Recentemente novas técnicas no diagnóstico oncológico foram introduzidas, uma delas sendo a determinação do antígeno carcinoembriônico (CEA) no líquido pleural, o que poderia auxiliar a citopatologia no diagnóstico diferencial. Cento e duas amostras de líquido pleural, não selecionadas, foram submetidas ao exame citopatológico e à dosagem dos níveis de CEA para avaliar o rendimento do uso combinado da citopatologia e do CEA na detecção de neoplasia. O teste utilizado para a determinação do CEA foi o de radioimunoensaio, através da técnica conhecida como “Sandwich”, onde é medida a radioatividade do complexo anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Duas ou três lâminas, para o exame citopatológico, foram coradas pelo método de Papanicolaou e o mesmo número, pelo método de Leishman. Sessenta e dois casos foram classificados como derrames pleurais não neoplásicos, ou seja, 22 casos devidos a tuberculose pleural, 18 a pneumonia, 9 a insuficiência cardíaca congestiva, 5 a embolia pulmonar, 4 a insuficiência renal, 2 a colagenoses e 2 a abscesso sub-frênico. Os demais 40 casos foram ocasionados por neoplasias. Dessas 40 casos, 34 forma devidos a neoplasias epiteliais, onde 14 eram carcinoma brônquico, 10 carcinoma de mama, 4 tumor primitivo desconhecido, 2 carcinoma gástrico, 2 carcinoma de ovário, 1 carcinoma de pâncreas e 1 carcinoma de reto, e 6 foram devidos a neoplasis não epiteliais. O CEA sendo um teste relativamente novo nos derrames pleurais, procurou-se estabelecer com exatidão seus características operacionais: Especificidade, Sensibilidade. Índice de falsos positivos, Índice de falsos negativos, Valos crítico discriminativo, Valor preditivo do resultado positivo e Valor preditivo do resultado negativo. Foi escolhido arbitrariamente, após análise dos resultados, como valor crítico discriminativo para o CEA, o nível de 8,0 ng/ml. Acima deste valor encontraram-se 61,8% dos derrames pleurais causados pelas neoplasias epiteliais. Apenas dois casos (3%) dos derrames pleurais não neoplásicos apresentaram níveis acima deste valor crítico discriminativo: ambos eram devidos à empiema pleural pós-pneumônico. As neoplasias não epiteliais não atingiram o nível escolhido como valor crítico discriminativo, devido a uma característica própria de não secretarem, ou secretarem o CEA em pequena quantidade. O rendimento (sensibilidade) da citopatologia nas neoplasias foi de 75% havendo ocorrido 25% de falsos negativos; a especificidade foi 100%, não tendo ocorrido falsos positivos. O uso combinado da citopatologia e do CEA apresentou uma especificidade de 97% e uma sensibilidade de 82,5%; havendo sobre a citopatologia isolada um ganho na sensibilidade de 75% para 82,5% e sobre o uso isolado do CEA um ganho de 60 para 82,5% na sensibilidade. Conclui-se, pois, pela vantagem de se dosar o CEA nos casos com citopatologia negativa, usando-se o nível de 8,0 ng/ml como valor crítico discriminativo, entre os derrames pleurais neoplásicos e os com etiologia benigna.

Orientador: Márcia Regina Brochetto Braga / Banca: Regina Barretto Cicarelli / Banca: Frederico Gonzalez Colombo Arnoldi / Resumo: Polybia paulista ou popularmente "paulistinha" é uma vespa social da família Vespidae. Possui hábitos urbanos e grande ocorrência no Sudeste do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo, onde tem causado muitos acidentes de importância médica. Na composição de seu veneno encontra-se um potente alérgeno, a proteína Antígeno 5 (Ag5) e embora sua função biológica ainda seja desconhecida, este alérgeno é responsável por importantes reações imunológicas cruzadas com o Ag5 do veneno de outros insetos sociais e com outras proteínas de eucariotos. A importância da reatividade cruzada em pacientes alérgicos ao veneno de vespas sociais é inquestionável, pois estas interações têm impacto direto sobre o diagnóstico e a seleção da melhor conduta terapêutica. Os diagnósticos de alergia são baseados na detecção de anticorpos do tipo IgE específico ao veneno por testes cutâneos ou de sangue. No entanto, respostas falso-positivas decorrentes da reatividade cruzada e respostas falso-negativas provenientes da baixa quantidade de IgE detectada, dificultam a interpretação dos resultados. A sequência completa de cDNA (621 pb) do alérgeno Ag5 do veneno da vespa P. paulista, foi clonada e a análise dos nucleotídeos revelou uma similaridade de 99% com a vespa Polybia scutellaris. Anticorpos policlonais foram produzidos contra a fração eletroforética protéica do Ag5 (25 kDA) de P. paulista e analisados imunologicamente por Western blotting. Os resultados demonstraram que os anticorpos reconheceram especificamente o alérgeno Ag5 no veneno bruto de P. paulista bem como, desenvolveram maior reação imunológica cruzada com os alérgenos Ag5 do veneno das vespas do gênero Polybia, embora não se descarte a possibilidade de ocorrência de reação cruzada com venenos de outros insetos sociais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Polybia paulista, commonly known as "paulistinha", is a social wasp of the family Vespidae. This species occurs in urban areas and is frequent in the Southeastern Brazil, especially in the State of São Paulo, where it has been responsible for many accidents of medical significance. A potent allergen, the protein antigen 5 (Ag5), is an important compound of the wasp venom. Although its biological function remains unknown, this component is responsible for substantial cross-immunological reactions with the Ag5 of venoms of other social insects and with eukaryotic proteins. The importance of cross-reactivity in allergic patients to the wasp venoms is unquestionable, because these interactions present a direct impact on the diagnosis and on the selection of the therapeutic treatment. Allergenic diagnoses are based on the detection of IgE specific to the venom via cutaneous or blood tests. However, sometimes they are hampered by false-positive responses as a result of cross-reactivity and false-negative responses that can occur due to the low amount of IgE detected as consequence of the low sensitivity of the test. The fulllength cDNA (621 bp) from the venom allergen Ag5 wasp P. paulista was cloned and nucleotide analysis revealed 99% of similarity with the wasp Polybia scutellaris. Polyclonal antibodies were produced against the electrophoretic protein fraction of Ag5 (25 kDa) of P. paulista and immunologically analyzed by Western blotting. The results showed that the antibodies strongly recognized the allergen Ag5 in the venom of P. paulista and developed higher cross-immune reaction with the same allergen in wasp venoms of the genus Polybia, although the possibility of cross reaction with other insect venoms not tested in this study cannot be excluded. The model carried out for the Ag5 P. paulista revealed the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Recentemente novas técnicas no diagnóstico oncológico foram introduzidas, uma delas sendo a determinação do antígeno carcinoembriônico (CEA) no líquido pleural, o que poderia auxiliar a citopatologia no diagnóstico diferencial. Cento e duas amostras de líquido pleural, não selecionadas, foram submetidas ao exame citopatológico e à dosagem dos níveis de CEA para avaliar o rendimento do uso combinado da citopatologia e do CEA na detecção de neoplasia. O teste utilizado para a determinação do CEA foi o de radioimunoensaio, através da técnica conhecida como “Sandwich”, onde é medida a radioatividade do complexo anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Duas ou três lâminas, para o exame citopatológico, foram coradas pelo método de Papanicolaou e o mesmo número, pelo método de Leishman. Sessenta e dois casos foram classificados como derrames pleurais não neoplásicos, ou seja, 22 casos devidos a tuberculose pleural, 18 a pneumonia, 9 a insuficiência cardíaca congestiva, 5 a embolia pulmonar, 4 a insuficiência renal, 2 a colagenoses e 2 a abscesso sub-frênico. Os demais 40 casos foram ocasionados por neoplasias. Dessas 40 casos, 34 forma devidos a neoplasias epiteliais, onde 14 eram carcinoma brônquico, 10 carcinoma de mama, 4 tumor primitivo desconhecido, 2 carcinoma gástrico, 2 carcinoma de ovário, 1 carcinoma de pâncreas e 1 carcinoma de reto, e 6 foram devidos a neoplasis não epiteliais. O CEA sendo um teste relativamente novo nos derrames pleurais, procurou-se estabelecer com exatidão seus características operacionais: Especificidade, Sensibilidade. Índice de falsos positivos, Índice de falsos negativos, Valos crítico discriminativo, Valor preditivo do resultado positivo e Valor preditivo do resultado negativo. Foi escolhido arbitrariamente, após análise dos resultados, como valor crítico discriminativo para o CEA, o nível de 8,0 ng/ml. Acima deste valor encontraram-se 61,8% dos derrames pleurais causados pelas neoplasias epiteliais. Apenas dois casos (3%) dos derrames pleurais não neoplásicos apresentaram níveis acima deste valor crítico discriminativo: ambos eram devidos à empiema pleural pós-pneumônico. As neoplasias não epiteliais não atingiram o nível escolhido como valor crítico discriminativo, devido a uma característica própria de não secretarem, ou secretarem o CEA em pequena quantidade. O rendimento (sensibilidade) da citopatologia nas neoplasias foi de 75% havendo ocorrido 25% de falsos negativos; a especificidade foi 100%, não tendo ocorrido falsos positivos. O uso combinado da citopatologia e do CEA apresentou uma especificidade de 97% e uma sensibilidade de 82,5%; havendo sobre a citopatologia isolada um ganho na sensibilidade de 75% para 82,5% e sobre o uso isolado do CEA um ganho de 60 para 82,5% na sensibilidade. Conclui-se, pois, pela vantagem de se dosar o CEA nos casos com citopatologia negativa, usando-se o nível de 8,0 ng/ml como valor crítico discriminativo, entre os derrames pleurais neoplásicos e os com etiologia benigna.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:58:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313851.pdf: 12194664 bytes, checksum: a49f2818198bdc12a810d2d30de9730b (MD5) / A distribuição simpátrica e o compartilhamento de hospedeiros e antígenos entre o Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas podem levar a erros nos diagnósticos e inferências epidemiológicas destes parasitos. Neste sentido, apresentamos o primeiro estudo proteômico comparativo em grande escala das proteínas solúveis e de superfície da forma tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi, objetivando a identificação de proteínas com potencial aplicação no diagnóstico diferencial destes parasitos. Neste estudo foram identificadas 137 distintas proteínas solúveis da forma tripomastigota de T. rangeli resolvidas no perfil 2-D por espectrometria de massas (LC-ESI-MS/MS). Destas, 76% localizadas no citosol ou mitocôndrias e 26% envolvidas no metabolismo energético ou na resposta ao estresse. Além disto, através de ensaios de immunoblotting 1-D com estas proteínas solúveis e antissoros de animais experimentalmente infectados com estes parasitos, foi verificado que a reatividade sorológica cruzada existente entre estes dois parasitos não é recíproca, pois o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli é menos intensa do que o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. cruzi pelos antissoros heterólogos. Também observamos que proteínas das formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi na faixa de 70-80kDa são reconhecidas exclusivamente pelos antissoros homólogos. Nos ensaios de immunoblotting 2-D foi observado um forte reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli pelo antissoro homólogo na faixa entre 60-100kDa. Apesar disto, não foi possível identificar marcadores específicos destes parasitos com estes ensaios. Porém, a análise proteômica comparativa das proteínas de superfície das formas epimastigota e tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi permitiu a identificação de potenciais marcadores específicos de T. rangeli. Esta análise foi realizada utilizando duas abordagens, sem (LC-MS-MS/MS) e com o uso de gel (GeLC-ESI-MS/MS), além de ensaios de immunoblotting 1-D, que revelaram um padrão de reconhecimento das proteínas de superfície distinto para cada espécie. Com isto foi possível identificar 138 proteínas de T. rangeli e 343 proteínas de T. cruzi, das quais 42 e 157 proteínas exclusivamente nas formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi, respectivamente. Em particular, as análises de MS/MS revelaram pelo menos duas proteínas de T. rangeli, GP63-relacionada (~70kDa) e FCaBP (~25kDa), como potenciais alvos para o diagnóstico diferencial com T. cruzi. Desta forma, esta análise proteômica em larga escala das proteínas de superfície de T. rangeli, revelou diferenças e semelhanças entre as proteínas de superfície destes parasitos, além de permitir a identificação de novas proteínas de T. rangeli com potencial aplicação no diagnóstico diferencial com T. cruzi.<br> / Abstract : Sympatric distribution and sharing of hosts and antigens by Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi the etiological agent of Chagas' disease, often incur in misdiagnosis and improper epidemiological inferences. In order to identify differential antigens with potential application in serological diagnosis we performed the first high-throughput proteomic analysis of soluble and surface proteins (SP) of T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes. In this work, 137 non-redundant T. rangeli trypomastigote soluble proteins resolved in 2-D profile were identified by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Within these 137 non-redundant proteins, 76% are cytosolic or mitochondrial and 26% are involved in energy metabolism or response to stress. Furthermore, 1-D immunoblotting assays with soluble proteins and antisera from animals experimentally infected showed a less intense recognition of T. rangeli trypomastigotes soluble proteins than T. cruzi trypomastigotes proteins by heterologous antisera indicating that serological cross-reactivity between these parasites is not reciprocal. In addition, T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes soluble proteins between ~70-80 kDa were exclusively recognized by homologous antisera suggesting specie-specific antigens among the trypomastigote proteins. We also observed a strong recognition of T. rangeli trypomastigotes proteins by homologous antiserum between ~60- 100kDa in 2-D immunoblotting tests. Unfortunately, we were not able to identify specific markers of these parasites through these trials. On the other hand, the comparative proteomic analysis of T. rangeli and T. cruzi epimastigote and trypomastigote SP pointed out potential T. rangeli specific-markers, using gel-free (LC-ESI-MS/MS) and gel-based (GeLC-ESI-MS/MS) proteomic approaches. Besides, immunoblotting revealed distinct recognition profiles of SP for each species. A total of 138 T. rangeli proteins and 343 T. cruzi proteins were identified, of which, 42 and 157 proteins were exclusively identified in T. rangeli or T. cruzi trypomastigotes, respectively. MS/MS analysis of T. rangeli exclusive bands revealed two unique proteins, GP63-related (~70kDa) and flagellar calcium-binding protein (FCaBP) (~25kDa), as potential markers. This highly sensitive proteomic assessment of surface proteins characterized the T. rangeli surfaceome, revealing several differences and similarities between these two parasites and new T. rangeli-specific proteins with promising use in differential diagnosis from T. cruzi.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:08:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338132.pdf: 1996282 bytes, checksum: f659a404f2f50b825cf0b5fca2cee4be (MD5) Previous issue date: 2015 / Após um episódio de infarto do miocárdio, cardiomiócitos necrosados liberam componentes intracelulares os quais se configuram como antígenos, e desencadeiam assim, uma resposta autoimune contra o tecido cardíaco. Em um trabalho prévio realizado por nosso grupo encontramos que a tolerância imunológica aos antígenos cardíacos pode ser reforçada por meio do tratamento oral com proteínas cardíacas, e parece ser benéfica ao processo de reparo tecidual e função cardíaca após a indução de isquemia. Desta forma, o principal objetivo deste trabalho foi estudar em maiores detalhes estas observações e ainda, caracterizar o fenótipo dos leucócitos presentes no infiltrado celular inflamatório. Lesões cardíacas semelhantes ao infarto foram induzidas em ratos Wistar machos (grupo ISO) através da injeção de altas doses de isoproterenol (150 mg/Kg, em dois dias consecutivos). A tolerância imunológica aos antígenos cardíacos foi desenvolvida por meio da exposição oral aos componentes do coração 7 dias antes da indução da lesão miocárdica (grupo TOL+ISO). Animais naïve foram usados como controles não-infartados (grupo CTR). Com a finalidade de se acessar a função cardíaca e o processo inflamatório que tomou parte após a indução da lesão isquêmica, foram realizadas avaliação hemodinâmica e análise imunohistoquímica. Observamos que, enquanto os animais do grupo ISO apresentaram um proeminente dano sistólico e diastólico cardíaco, os animais do grupo TOL+ISO apresentaram fração de ejeção preservada tanto 3 dias após a indução da lesão miocárdica isquêmica (CTR 73,4 ± 2,8; ISO 44,6 ± 6,3; TOL+ISO 74,3 ± 4,4; P < 0,05 entre o grupo CTR e o grupo ISO), quanto 15 dias após (CTR 73,4 ± 2,8; ISO 53,6 ± 8.,8; TOL+ISO 66,6 ± 4,1; P < 0,05 entre grupo CTR e grupo ISO). A análise imunohistoquímica dos níveis de expressão de IL-10, arginase-1, NOS-2 e fosfo-p65 revelou que os animais tornados tolerantes aos antígenos cardíacos (TOL+ISO) são capazes de mobilizar a resposta anti-inflamatória de forma antecipada e mais pronunciada, quando comparado aos animais do grupo ISO. Em conjunto, nossos dados sugerem que a tolerância oral aos antígenos cardíacos pode ser capaz de melhorar o processo de reparo tecidual após lesão isquêmica, uma vez que acelerou o processo de resolução da inflamação, e que isso se correlacionou com o melhor desempenho cardíaco global.<br> / Abstract : After a myocardial infarction episode, necrotic cardiomyocytes can release antigens that trigger autoimmunity phenomena against the cardiac tissue. In a previous work we found that the reinforcing immunological tolerance to such cardiac antigens might benefits myocardial healing and function after isoproterenol-induced damage. Thus, the main objective of the present study was to further address those observations, and characterize the phenotype of infiltrating leukocytes. Infarction-like myocardial lesions were induced in male Wistar rats (ISO group) through the injection of high doses of isoproterenol (150 mg/kg, two consecutive days). Immunological tolerance to cardiac antigens was developed by means of oral exposure to cardiac antigens 7 days before isoproterenol-induced myocardial lesions (TOL+ISO group). Naïve animals were used as non-infarcted control (CTR group). Hemodynamics and immunohistochemistry analysis were performed do asses myocardial function and inflammation. We found that while ISO-treated animals presented systolic and diastolic impairment, TOL+ISO animals presented preserved ejection fraction at 3 d (CTRL 73.4 ± 2.8; ISO 44.6 ± 6.3; TOL+ISO 74.3 ± 4.4; P < 0.05 between CTRL and ISO) and 15 d (CTRL 73.4 ± 2.8; ISO 53.6 ± 8.8; TOL+ISO 66.6 ± 4.1; P <0 .05 between CTRL and ISO) post myocardial lesion induction. Immunohistochemical analysis of IL-10, arginase-1, NOS-2 and phopho-p65 expression levels revealed that animals tolerant to cardiac antigens mobilized an earlier and stronger anti-inflammatory response as compared to animals from the ISO group. Altogether, these findings suggest that oral tolerance to cardiac antigens might improve myocardial healing by means of accelerating the inflammation resolution process, and that correlated with a better overall cardiac functionality.

Orientadora : Profª Drª Maria da Graça Bicalho / Co-orientador : Prof. Dr. Sandro Carvalho Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 25/03/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Genética / Resumo: O papel de HLA-G em meio a mecanismos de imunotolerância vem sendo cada vez mais elucidado. A sua atuação na imunomodulação se extende desde a interface materno-fetal, a condições patológicas, assim como em transplantes de coração, rim, fígado e pâncreas. O HLA-G apresenta isoformas que podem ser expressas tanto ligadas a membrana celular, como solúveis (sHLA-G), podendo ser esta a forma detectada circulante no plasma. A secreção das moléculas HLA-G ocorre por meio de células que estão envolvidas nos mecanismos específicos de inibição da resposta imune. Polimorfismos genéticos também são observados no gene HLA-G influenciando a sua função biológica através da alteração dos níveis de transcrição gênica ou até alterando a afinidade de HLA-G com seus ligantes. Neste estudo foi investigado a influência de HLA-G no perfil imunológico de pacientes transplantados renais. No total 100 pacientes pertencentes ao HUEC (Hospital Univesitário Evangélico de Curitiba) foram genotipados para HLA-G e, dentre estes, 36 pacientes foram monitorados do pré ao pós-transplante com relação aos níveis de sHLA-G no plasma. A genotipagem foi realizada utilizando o kit para HLA-G da SBTcomercial (GenDx) e a quantificação utilizando o kit ELISA (Exbio, Praga, República Checa) para as isoformas mais abundantes: o sHLA-G1 e - G5. As freqüências alélicas observadas foram de acordo com o relatado previamente para as populações brasileiras, com exceção de seis alelos (G*01:01:15 , G*01:01:17 , G*01:01:20 , G*01:04:03, G*01:04:05 e G*01:08), que não tinham sido descritos anteriormente. Ainda, foram identificados dois novos alelos HLA-G, cada um compondo o genótipo heterozigoto de dois pascientes transplantados renais. Os níveis de sHLA-G quantificados apresentaram variação expressiva do pré ao pós-transplante entre os indivíduos transplantados sensibilizados comparados àqueles indivíduos dessensibilizados (tratados via protocolo de indução com ATG). Com os resultados deste estudo, esperamos melhor explicar o papel do HLA-G em relação ao aumento da sobrevida de aloenxertos, assim como auxiliar na exploração desta molécula como uma potencial biomarcadora positiva da resposta imune dos pacientes transplantados em relação aos protocolos de imunossupressão à que são submetidos. Palavras-chaves: Transplante renal. HLA-G. Imunotolerância. / Abstract: The role of HLA-G through the immune tolerance mechanisms has been increasingly elucidated. Its performance in immunomodulation extends from the maternal-fetal interface, in pathological conditions, as well as in heart, kidney, liver and pancreas transplants. HLA-G has isoforms that can be expressed and stays membrane bound or as a soluble (sHLA-G) isoform, which can be detected in the plasma of patients. The secretion of sHLA-G occurs through immune cells involved in the specific inhibition mechanisms of immune response. There are also genetic polymorphisms observed in HLA-G gene, which can influence its biological function by altering transcription levels of this gene or even altering the affinity of HLA-G with ligants. In this study we investigated the influence of HLA-G in immune profile from kidney transplant patients. In total of 100 patients belonging to HUEC were genotyped and, among these, 36 transplant patients were monitored from pre to post-transplant with respect to sHLA-G levels in plasma. Genotyping was performed using the commercial SBT kit for HLA-G (GenDx) and quantified using the ELISA kit (Exbio , Prague , Czech Republic) for the most abundant isoforms: sHLA-G1 and -G5. The allele frequencies were in accordance with previously studies reported for Brazilian populations, with the exception of six alleles (G*01:01:15 , G*01:01:17 , G*01:01:20 , G*01:04:03, G*01:04:05 e G*01:08), which had not been previously described. Furthermore, two new HLA-G alleles have been identified, each one composing the heterozygous genotype of two kidney transplant patients. The quantified levels of sHLA-G have had significant variations in the pre to post-transplant from sensitized individuals when compared with desensitized individuals (treated by an induction protocol using ATG). Thus with the results of this study, we hope to better explain the role of HLA-G in relation to the increased survival of allografts, as well as support in the exploration of this molecule as a positive potential marker of the transplant patients response to immunosuppression protocols. Key-words: Kidney transplant. HLA-G. Immunotolerance.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-02Bitstream added on 2014-06-13T19:08:38Z : No. of bitstreams: 1 giratto_dt_me_rcla.pdf: 1764427 bytes, checksum: 1b64e9443f58235f6ad350ec38383d9a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Polybia paulista ou popularmente “paulistinha” é uma vespa social da família Vespidae. Possui hábitos urbanos e grande ocorrência no Sudeste do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo, onde tem causado muitos acidentes de importância médica. Na composição de seu veneno encontra-se um potente alérgeno, a proteína Antígeno 5 (Ag5) e embora sua função biológica ainda seja desconhecida, este alérgeno é responsável por importantes reações imunológicas cruzadas com o Ag5 do veneno de outros insetos sociais e com outras proteínas de eucariotos. A importância da reatividade cruzada em pacientes alérgicos ao veneno de vespas sociais é inquestionável, pois estas interações têm impacto direto sobre o diagnóstico e a seleção da melhor conduta terapêutica. Os diagnósticos de alergia são baseados na detecção de anticorpos do tipo IgE específico ao veneno por testes cutâneos ou de sangue. No entanto, respostas falso-positivas decorrentes da reatividade cruzada e respostas falso-negativas provenientes da baixa quantidade de IgE detectada, dificultam a interpretação dos resultados. A sequência completa de cDNA (621 pb) do alérgeno Ag5 do veneno da vespa P. paulista, foi clonada e a análise dos nucleotídeos revelou uma similaridade de 99% com a vespa Polybia scutellaris. Anticorpos policlonais foram produzidos contra a fração eletroforética protéica do Ag5 (25 kDA) de P. paulista e analisados imunologicamente por Western blotting. Os resultados demonstraram que os anticorpos reconheceram especificamente o alérgeno Ag5 no veneno bruto de P. paulista bem como, desenvolveram maior reação imunológica cruzada com os alérgenos Ag5 do veneno das vespas do gênero Polybia, embora não se descarte a possibilidade de ocorrência de reação cruzada com venenos de outros insetos sociais... / Polybia paulista, commonly known as paulistinha, is a social wasp of the family Vespidae. This species occurs in urban areas and is frequent in the Southeastern Brazil, especially in the State of São Paulo, where it has been responsible for many accidents of medical significance. A potent allergen, the protein antigen 5 (Ag5), is an important compound of the wasp venom. Although its biological function remains unknown, this component is responsible for substantial cross-immunological reactions with the Ag5 of venoms of other social insects and with eukaryotic proteins. The importance of cross-reactivity in allergic patients to the wasp venoms is unquestionable, because these interactions present a direct impact on the diagnosis and on the selection of the therapeutic treatment. Allergenic diagnoses are based on the detection of IgE specific to the venom via cutaneous or blood tests. However, sometimes they are hampered by false-positive responses as a result of cross-reactivity and false-negative responses that can occur due to the low amount of IgE detected as consequence of the low sensitivity of the test. The fulllength cDNA (621 bp) from the venom allergen Ag5 wasp P. paulista was cloned and nucleotide analysis revealed 99% of similarity with the wasp Polybia scutellaris. Polyclonal antibodies were produced against the electrophoretic protein fraction of Ag5 (25 kDa) of P. paulista and immunologically analyzed by Western blotting. The results showed that the antibodies strongly recognized the allergen Ag5 in the venom of P. paulista and developed higher cross-immune reaction with the same allergen in wasp venoms of the genus Polybia, although the possibility of cross reaction with other insect venoms not tested in this study cannot be excluded. The model carried out for the Ag5 P. paulista revealed the... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:08:59Z : No. of bitstreams: 1 sodre_lp_me_botfm.pdf: 1339623 bytes, checksum: ed335773fb6c0b581fc33a31e3612a6e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Anticorpos monoclonais (AcMm) são imunoglobulinas produzidas por engenharia celular através da fusão de células tumorais com linfócitos B provenientes de organismos previamente imunizados contra o antígeno de interesse. As células recém criadas recebem a denominação de hibridomas, crescem indefinidamente em cultura por agregar características de imortalidade das células tumorais. A tecnologia de monoclonais compreende etapas seriadas, incluindo imunização, fusão, screening, clonagem, caracterização de especificidade dentre outras. O CD45 é um marcador expresso na superfície de todos os leucócitos humanos: linfócitos, eosinófilos, monócitos, basófilos e neutrófilos sendo, o maior componente da membrana de linfócitos, o que aumenta a probabilidade de obtenção de AcMm com este perfil em protocolos de imunização com linfócitos. Este marcador é amplamente utilizado em diagnóstico por citometria de fluxo, no acompanhamento de pacientes HIV+, na classificação de leucemias e linfomas, quantificação de células CD34+ para transplantes de medula óssea e, também em imunohistoqu ímica auxiliando na subtipagem das neoplasias, principalmente linfomas (Hodgkin, não Hodgkin e outras categorias) e leucemias de células B e T. Assim, este trabalho teve por objetivo a caracterização de anticorpo monoclonal anti-CD45 desenvolvido in house e validação deste em aplicações diagnósticas envolvendo citometria de fluxo e imunohistoqu ímica, comparando-o com anticorpos monoclonais comerciais, visando minimização dos custos dessas técnicas. Foram utilizadas 50 amostras de sangue excedente de doadores para o grupo controle e 48 amostras de sangue de pacientes HIV+ para validação do AcMm em citometria de fluxo e analisados 114 fragmentos em lâmina de Tissue Microarray - TMA provenientes de 38 amostras de amígdalas para validação do AcMm em imunohistoqu ímica... / Monoclonal antibodies (mAb) are immunoglobulins produced by cell engineering through fusion of tumor cells and B lymphocytes from organisms previously immunized against the antigen of interest, generating thus hybridomas that indefinitely grow in culture since they aggregate immortality characteristics of tumor cells capable of secreting antibodies. The production of such antibodies consists of sequential steps, including immunization, fusion, screening, cloning, and specificity characterization. CD45 is a marker expressed in the surface of all human leukocytes: lymphocytes, eosinophils, monocytes, basophils, and neutrophils. Besides, CD45 is the major component of lymphocyte membranes, which increases the probability of obtaining mAb presenting such profile in immunization procedures using lymphocytes. This marker has been widely used in diagnosis through flow cytometry, besides monitoring of HIV+ patients, classification of leukemia and lymphomas, quantification of CD34+ cells for bone marrow transplantation, and also in immunohistochemistry, helping in subtyping of neoplasms, mainly lymphomas (Hodgkin s, non-Hodgkin and other categories) and B- and T-cell leukemia. Thus, this work aimed to characterize the in-house-developed anti-CD45 monoclonal antibody besides its validation in diagnostic applications involving flow cytometry and immunohistochemistry through comparison with commercial monoclonal antibodies in order to reduce the costs of such techniques. Fifty samples of extra blood from donors were used in the control group, and 48 blood samples from HIV+ patients were used for mAb validation in flow cytometry. For mAb immunohistochemical validation, 114 fragments from 38 amygdala samples were analyzed in a Tissue Microarray - TMA slide. In flow cytometry, the commercial anti-CD45 and the likely in-house-obtained anti-CD45 (LINB5 clone) did not significantly differ concerning cell... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-09-20Bitstream added on 2014-06-13T18:20:01Z : No. of bitstreams: 1 lucidi_ca_me_botfmvz.pdf: 1789993 bytes, checksum: 1be9205c888eae8b214b252b5790367e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A expressão de antígenos eritrocitários do sistema ABO em plaquetas humanas pode causar baixo incremento plaquetário pós-transfusional e refratariedade no receptor. Na Medicina Veterinária, o antígeno eritrocitário canino (DEA) 1.1 causa as reações transfusionais hemolíticas mais importantes clinicamente, e se presente nas plaquetas caninas pode estar envolvido em reações imunológicas levando à baixa sobrevida das plaquetas transfundidas ou aloimunização do paciente receptor. O objetivo deste estudo foi investigar a presença do DEA 1.1 em plaquetas de cão. Para tanto, plaquetas de 110 cães DEA 1.1 positivos e 62 cães DEA 1.1 negativos foram incubadas com soro policlonal anti-DEA 1.1, e então com o anticorpo policlonal anti-IgG canina marcado com FITC, e posteriormente avaliadas pelo método de citometria de fluxo. As hemácias de todos os cães foram testadas da mesma forma, a fim de demonstrar a eficácia da técnica de citometria de fluxo para detecção deste antígeno. Além disso, todas as amostras foram tipadas para o DEA 1.1 pelo teste convencional da aglutinação em tubo, para confirmação dos resultados obtidos pela citometria de fluxo em hemácias. Os resultados demonstraram que o DEA 1.1 não está presente nas plaquetas caninas e que parece não haver a necessidade de transfusão de plaquetas compatíveis para este tipo sanguíneo em cães. Foi observado ainda, que a citometria de fluxo é um teste mais sensível e acurado para a tipagem sanguínea do DEA 1.1 do que o teste de aglutinação em tubo. / The expression of erythrocyte antigens, from the ABO system, by human platelets can cause post-transfusional low platelet increment and refractoriness on the receptor. In Veterinary Medicine, the dog erythrocyte antigen (DEA) 1.1 causes the most clinically important hemolytic transfusion reactions, and if present on canine platelets may be the cause of immunologic platelet transfusion reactions, leading to short survival of the transfused platelets or alloimmunization of the recipient. The purpose of this study was to investigate the presence of the DEA 1.1 antigen in canine platelets. For that, platelets from 110 DEA 1.1 positive dogs and 62 DEA 1.1 negative dogs were incubated with anti-DEA 1.1 polyclonal sera, and then with anti-canine IgG FITC-labeled polyclonal antibody, to be evaluated by flow cytometry. All canine erythrocytes were tested the same way, to demonstrate the efficacy of the flow cytometric technique to detect this antigen. Moreover, all samples were typed for DEA 1.1 by the gold-standard tube typing test, to confirm the results obtained to the red cells by flow cytometry. The results showed that the DEA 1.1 antigen is not present on canine platelets, and that it seems to not be necessary the transfusion of DEA 1.1 compatible platelets in dogs. Further observation also showed that the flow cytometric test is more sensitive and accurate than the tube typing test for the detection of DEA 1.1 antigen.

Orientador: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Gil Benard / Banca: Andréa de Faria Fernandes Belone / Resumo: Células gigantes multinucleadas (CGM) são células características, presentes em lesões granulomatosas, induzidas por agentes infecciosos e, sua formação pode ser modulada por citocinas produzidas por células da resposta imune. No presente trabalho avaliou-se o efeito modulador de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ e TNF-α) e anti-inflamatórias (IL-10 e TGF-β1) na formação de CGM in vitro, a partir de monócitos humanos, estimulados com antígenos de Paracoccidioides brasiliensis (AgPb) e sobre a atividade fungicida dessas células desafiadas com a cepa Pb18 de P.brasiliensis. Monócitos do sangue periférico de indivíduos saudáveis foram cultivados na ausência de estímulo (controle), com AgPb (100ug/mL) ou com associações de AgPb e GM-CSF (100 U/ml) com as citocinas: IFN-γ (300UI/mL), IL-10 (50U/mL), TGF- β1 (250pg/mL) ou TNF-α (50U/mL). A formação de CGM foi avaliada após três dias de cultivo, estabelecendo-se o índice de fusão (IF) e a percentagem de CGM após fixação e coloração das células com May-Grunwald-Giemsa. Além disso, a atividade fungicida dessas células foi avaliada após 4 h de co-cultivo das CGM com 4 x 104 células leveduriformes viáveis da cepa Pb18 de P. brasiliensis, por plaqueamento das co-culturas em meio BHI-ágar e determinação da recuperação de fungos viáveis. O método estatístico empregado para comparação dos resultados foi análise de variância, com nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que a incubação de monócitos com AgPb+GM-CSF+IFN-γ induziu IF significativamente mais elevados em relação a todas as demais culturas: controle, apenas estimulados com AgPb ou AgPb adicionado das demais citocinas. A adição de TNF- α+AgPb+GM-CSF não resultou em IF maiores do que os obtidos na cultura estimulada apenas com o AgPb, enquanto as citocinas IL-10 e TGF-β1 apresentaram efeito supressor... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multinucleated giant cells (MGC) are characteristics cells present in granulomatous lesions induced by infectious agents and also may be modulated by cytokines produced by cells of the immune response. The present study evaluated the modulatory effect of interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) pro-inflammatory cytokines, and interleukin-10 (IL-10) and transforming growth factor beta (TGF-β1) anti-inflammatory cytokines on in vitro formation of MGC derived from human monocytes, stimulated with Paracoccidioides brasiliensis antigen (PbAg) and on fungicidal activity of these cells challenged with the Pb18 strain of P.brasiliensis. Peripheral blood monocytes obtained from healthy individuals were cultured for three days without stimulus (control) or with PbAg (100 ug/mL) or with association of PbAg and granulocyte macrophage colony stimulator factor (GMCSF (100 U/mL) with the following cytokines: IFN-γ (300 UI/mL), IL-10 (50 UI/mL), TGF-β1 (250 pg/mL) or TNF-α (50 UI/mL). The generation of MGC was evaluated by fusion index (FI) and the percentage of MGC formation after cell fixing and May-Grumwald-Giensa staining. Fungicidal activity of monocytederived MGC was evaluated 4h after co-culture of MGC with 4 x 104 viable yeast cells of Pb18 strain, by plating the cultures in BHI-agar and determination of viable fungi recovery. The statistical method employed for the comparison of the results was analysis of variance with the significance set at p< 0.05. The results showed that the incubation of monocytes with PbAg+GM-CSF+IFN-γ induced FI significantly higher than those observed in all the other cultures, such as control cultures, cultures stimulated with PbAg only or cultures stimulated with PbAg associated with the other cytokines. Stimulation with PbAg+TNF+GM-CSF did not result in FI higher than those obtained in the culture stimulated with PbAg only... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor