Student Number : 0000127R - MPharm dissertation - School of Pharmacy and Pharmacology - Faculty of Health Sciences / Traditional medicines form a significant part of the lives of many people around the world and in South Africa almost 60 % of people consult traditional healers in addition to the modern medical services available. Plants form a significant part of traditional healing and hence, selected species of a traditionally used plant genus, Hermannia, were chosen for biological and chemical investigation to determine a scientific basis for the traditional use of these plants. A phytochemical investigation was carried out, firstly using thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) and then isolation and identification of compounds from various Hermannia species. TLC analysis indicated significant similarities between the various species with only H. saccifera displaying chemical anomalies. This was further corroborated by the HPLC analysis although very conservative profiles were produced. Isolation of compounds from H. saccifera yielded a novel labdane compound, E-17, 19-diacetoxy - 15 - hydroxylabda - 7,13 - diene, as well as two flavones, 5,8- dihydroxy-6,7,4’- trimethoxyflavone and cirsimaritin which have previously been isolated. In addition, two commonly found compounds, lupeol and β- sitosterol were isolated from H. cuneifolia and H. salviifolia respectively. This is the first report on the isolation and identification of all five compounds from Hermannia species. Antimicrobial activity was assessed using two methods i.e. minimum inhibitory concentrations as well as the death kinetics assay. Minimum inhibitory concentrations were determined using four Gram-positive and two Gram-negative bacteria as well as two yeasts. All species investigated indicated antimicrobial activity with H. saccifera showing good activity against S. aureus and B. cereus. E-17, 19-diacetoxy - 15 - hydroxylabda - 7,13 - diene isolated from H. saccifera indicated activity (MIC = 23.6 μg/ml against S.aureus) although the activity was less than that of the crude extract (MIC = 19.5 μg/ml), thus, demonstrating that there are a number of compound contributing to the promising activity of the crude extract. This was further corroborated by the bioautograms developed of the H. saccifera extract. Time-kill studies on H. saccifera against S. aureus indicated that at concentrations of 0.1, 0.25 and 0.5 % bacteriostatic activity was observed while at 0.75% the extract achieved complete bactericidal activity after 240min. Free radical scavenging activity was assessed using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazy (DPPH) and 2,2′-azino-bis(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays. Ten of the twelve species indicated good activity with H. cuneifolia demonstrating the most promising activity (IC50 = 10.26 μg/ml for DPPH and 10.32 μg/ml for ABTS). Two of the isolated compound, 5,8- dihydroxy-6,7,4’- trimethoxyflavone and cirsimaritin displayed insignificant activity. The 5-lipoxygenase assay was used to assess the anti-inflammatory activity of Hermannia species. All species exhibited intermediate activity with the exception of H. cuneifolia (IC50 = 15.32 μg/ml). In addition, four isolated compounds, 5,8- dihydroxy-6,7,4’- trimethoxyflavone, cirsimaritin, lupeol and β-sitosterol showed moderate inhibition of the enzyme indicating that while these compounds do contribute to the activity of the extracts they are not individually responsible for any significant activity. Antimalarial activity was assessed using the titrated hypoxanthine incorporation assay while toxicity was assessed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) cell proliferation assay. Only three species indicated any good antimalarial activity i.e. H. saccifera, H. muricata and mostly H. trifurca (IC50 = 25.30, 28.17 and 18.80 μg/ml respectively). However, the activity of H. saccifera and H. trifurca are probably due to a general cytotoxicity as these species exhibited a low safety index. All other species appear safe for use. Several Hermannia species have indicated in vitro biological activity in a number of assays which is related to their use in traditional medicines to treat a number of disease states. Hence, a scientific basis, albeit in vitro, has been established for the use Hermannia species in traditional healing.

O pequi caracteriza-se por possuir expressiva quantidade de compostos fenólicos, que por apresentarem propriedades antioxidantes estão associados com a prevenção da formação de radicais livres. Além de ser consumido in natura, é também comumente consumido na forma processada. No entanto, sabe-se que os antioxidantes presentes nos vegetais podem ser afetados pela forma de processamento e provocam alterações dos teores de fenólicos totais (FT) bem como da sua atividade antioxidante. Este trabalho objetivou avaliar o teor de FT e as propriedades antioxidantes da polpa do pequi processado e in natura. Foram obtidos os extratos alcoólicos (EALC) e aquosos (EAQ), a partir de amostras liofilizadas de diversas polpas de pequi processado (em conserva) e também do in natura, bem como as frações de ácidos fenólicos livres (AFL), ésteres solúveis de ácidos fenólicos (AFS) e ésteres insolúveis de ácidos fenólicos (AFI) de pequi processado (CB1). Os EALC e EAQ, além dos líquidos provenientes das conservas (LC), foram avaliados quanto aos teores de FT, onde se verificou que os EAQ do pequi in natura, principalmente, e do processado tiveram um maior conteúdo de FT quando comparados aos EALC. Os LC, por sua vez, apresentaram valores médios ainda maiores que os EAQ. Com relação ao teor de FT das frações, a AFL se destacou diante da AFS e AFI. Os extratos, LC e frações foram avaliados quanto à atividade antioxidante in vitro pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico e também pelo ensaio do radical DPPH• (2,2 difenil-1-picril-hidrazila). No primeiro, verificou-se que os EAQ e LC do pequi apresentaram maior atividade que os EALC. Foi observada ainda atividade elevada em todas as frações analisadas. No segundo ensaio pelo método do radical DPPH•, pode-se observar que os extratos aquosos do pequi in natura apresentaram maior atividade, enquanto que, no pequi processado, os extratos alcoólicos e os líquidos das conservas tiveram melhores resultados. Verificou-se também que a AFL possui atividade superior às outras frações. De uma maneira geral, os resultados do pequi processado foram inferiores aos do pequi in natura tanto em relação aos teores de FT como na atividade antioxidante. Verificando-se ainda, que isto se deve principalmente à perda dos FT da polpa, indicando que houve lixiviação destes compostos para os LC. / Pequi characterized by having a significant amount of phenolic compounds, that are related with its antioxidant properties that are associated with the prevention of free radicals. Besides being eaten fresh, it is also widely consumed in processed form. However, it is known that the antioxidants present in plants can be affected by processing form and cause changes in the levels of total phenolic content (FT) and the antioxidant activity. The objective of this study was to evaluate the content of phenolic compounds and the antioxidant properties of the pequi pulp processed and fresh. Were obtained the alcoholic (EALC) and aqueous (EAQ) extracts from lyophilized samples of various pulps pequi processed (canned) and also in nature, as well as the fractions of free phenolic acids (AFL), soluble esters of phenolic acids (AFS) and insoluble esters of phenolic acids (AFI) of processed pequi (CB1). The EALC and EAq, besides the liquid from the canned (LC) were evaluated for the levels of FT, where it was found that the EAQ of the pequi in nature, mainly, and of the processed had, in general, a higher content of FT compared to EALC. The LC, in turn have showed that even greater EAQ. Regarding the content of FT of the fractions, the AFL stood in front of the AFS and AFI. The extracts, LC and fractions were also evaluated for their antioxidant activity in vitro by the system β-caroteno/ linoleic acid and by test DPPH• (2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl). At first, it was found that the LC and EAQ of the pequi showed greater activity than the EALC. Still high activity was observed in all fractions analyzed. In the second test, we can observe that the EAQ of the pequi in nature showed greater activity, whereas in pequi processed, the EALC and LC had better results. It was also noted that the AFL has superior activity to other fractions. In general, the results of pequi processed were lower than in fresh pequi both in relation to content of FT as antioxidant activity. Verifying also, that this is mainly due to the loss of FT of the pulp, indicating that there was leaching of these compounds to the LC.

Os neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são células fagocíticas com funções bactericida e fungicida altamente potentes. A destruição dos microrganismos invasores é realizada através da liberação de substâncias tóxicas presentes em seus grânulos e das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas durante o metabolismo oxidativo dessas células. Apesar dos benefícios da atividade antimicrobiana, em situações de intensa ativação celular, a grande produção e liberação de compostos citotóxicos podem causar efeitos deletérios sobre os tecidos do hospedeiro, como parece ocorrer em doenças por imunocomplexos. O grande potencial dos antioxidantes para o tratamento e prevenção dessas doenças tem levado à pesquisa de novos compostos que atuam no processo inflamatório em que estão envolvidos os neutrófilos ativados. Dentre estes, destacam-se os naturais, em que se encontra a planta Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), principal fonte botânica da própolis verde, sendo que a própolis possui diversas atividades biológicas conhecidas. Entretanto, a produção de metabólitos secundários pelas plantas pode ser modificada de acordo com fatores sazonais o que dificulta os estudos e pode acarretar em alterações de atividade biológica. Desta forma, este trabalho avaliou o efeito da sazonalidade no perfil químico de B. dracunculifolia e na atividade desta planta sobre o metabolismo oxidativo de PMNs. Para isso, extratos etanólicos brutos das folhas de B. dracunculifolia (EEBBd), colhidas mensalmente durante 14 meses foram submetidos à ensaios de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e avaliados quanto à capacidade de inibir a quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) produzida por PMNs estimulados. Além disso, para desvendar o(s) possível(is) mecanismo(s) de ação responsável(is) pela atividade antioxidante, foram realizados, com a amostra mais ativa em inibir a QL, ensaios para avaliar a citotoxicidade, a atividade scavenger de radicais livres (DPPH) e a ação sobre a atividade da enzima NADPH oxidase. Os resultados mostraram que todos os EEBBd inibiram tanto a QLlum quanto a QLluc de forma dependente da concentração e que para ambos os ensaios houve variação na eficiência deste efeito biológico ao longo do período de tempo estudado, demonstrando que a sazonalidade desempenhou um papel importante na intensidade da atividade antioxidante dos extratos. O ensaio de CLAE permitiu análise dos seguintes compostos: ácido caféico, ácido p-cumárico, aromadendrina-4-metil éter, isosakuranetina e artepilin C, e revelaram que apesar de não haver notória variação qualitativa entre os componentes, foi observada grande diferença quantitativa. As análises com a amostra do mês de maior atividade antioxidante (Maio/07) revelou que esta foi colhida durante um período de baixo índice pluviométrico, temperaturas amenas e apresentou a menor concentração da maioria dos compostos fenólicos estudados, evidenciando que tais compostos não foram os maiores responsáveis pela atividade biológica da amostra e que alguns desses compostos podem ter atuado como pró-oxidantes. Além disso, foi verificado que esta amostra atuou de forma não tóxica sobre as células, através da captação de parte das EROs geradas no meio reacional e de inibição parcial da atividade da NADPH oxidase. / Neutrophils or polymorphonuclear (PMN) are phagocytic cells with potent bactericidal and fungicidal functions. The destruction of invading microorganisms is made by the release of toxic substances contained within their granules and by the reactive oxygen species (ROS) produced during the oxidative metabolism of these cells. Despite the benefits of antimicrobial activity, in situations of intense cellular activation, large production and release of toxic compounds may cause deleterious effects on host tissue, as it seems to occur in immune complex diseases. The great potential of the antioxidants for the treatment and prevention of these diseases has led to the search of new compounds that act in the inflammatory process where are involved the activated neutrophils. Within this context, natural products are highlighted, mainly plants, among which is the Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), the main botanical source of green propolis, which has several activities already known. However, secondary metabolites of plants can be modified according to seasonal factors, what can difficult the studies and alter the biological activity results. Thus, this study evaluated the effect of seasonality in the chemical profile of B. dracunculifolia and in the activity of this plant on the oxidative metabolism of PMNs. For this, crude ethanolic extracts of B. dracunculifolia leaves (CEEBd), harvested monthly for 14 months were analyzed in high performance liquid chromatography (HPLC) and evaluated for their ability to inhibit the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence (CLlum and CLluc, respectively) produced by stimulated PMNs. In addiction, to understand the possible mechanisms of action responsible for antioxidant effect, the most active sample in the CL test was evaluated for the following proprieties: cytotoxic, scavenger of free radicals (DPPH) and action on the NADPH oxidase activity. The results showed that all CEEBd inhibited both CLlum and CLluc in a concentration-dependent manner and that in both trials it was found variation in the biological effect over the study period, indicating that the seasonality played an important role on the intensity of the antioxidant activity of the extracts. The HPLC assay allowed the analysis of the following compounds: caffeic acid, p-coumaric acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin and artepillin C, and showed that although there was no evident variation in qualitative profile, it was observed large quantitative differences. The analysis of the sample of greatest antioxidant activity (May/07) revealed that it was harvested during a period of low rainfall, mild temperatures and had lower concentrations of most compounds studied, indicating that these compounds were not the most responsible for the biological activity of the sample and that some of these substances may have acted as pro-oxidants molecules. Furthermore, it was found that this sample works in a non-toxic manner on cells, by capturing some of the ROS generated in the reaction medium and by partial inhibition of NADPH oxidase activity.

A exposição à radiação ultravioleta promove o desenvolvimento de efeitos indesejáveis, incluindo o fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese. Uma forma de prevenção é a utilização de antioxidantes de origem natural. O extrato de raiz de Pothomorphe umbellata (PU) apresenta conhecida atividade antioxidante e fotoprotetora, atividade esta atribuída, em parte, ao princípio ativo 4-nerolidilcatecol (4-NC). Artigos publicados sobre a atividade do extrato de raiz de PU, conhecida popularmente como \"pariparoba\" e do princípio ativo, 4-NC, mostraram que o extrato bruto de raiz é mais ativo do que o 4-NC isolado como inibidor de metaloproteinases (MMPs) e como antioxidante, sugerindo a presença de outros compostos com estas atividades, além de um possível efeito sinérgico. O objetivo deste estudo foi o de obter frações do extrato de PU isentas de 4-NC e avaliar a atividade antioxidante, fotoprotetora e inibitória de metaloproteinases 2 e 9 na pele. O extrato hidroalcoólico de raiz de PU foi submetido ao fracionamento líquido/líquido sucessivamente com hexano e n-butanol, restando um resíduo aquoso. As frações n-butanólica (NBUT) e aquosa (AQ) mostraram-se isentas de 4-NC. A avaliação da atividade antioxidante por DPPH e ORAC das 3 frações obtidas mostrou maior capacidade antioxidante para a fração hexânica (HEX), seguido das frações NBUT e AQ. O mesmo perfil foi observado quanto à presença de compostos fenólicos. Entretanto não foi detectada a presença de flavonóides nas frações. O tratamento tópico com formulação gel-creme contendo o extrato de PU, a fração NBUT e a fração NBUT+4-NC, 2h antes da exposição aguda à radiação UVB (2 MED - 204.36 mJ/cm2), mostrou-se insuficiente para repor os níveis basais do sistema antioxidante da pele depletados em aproximadamente 20% pela radiação após 12h quando comparado ao controle. O mesmo tratamento não foi capaz de reduzir a formação de dímeros de pirimidina (CPD) após 2h. A avaliação após 12h mostrou redução da marcação de células de queimadura solar (SBC) e do antígeno de proliferação nuclear (PCNA) para o grupo PU e NBUT. A marcação para p53 e p21 também foi diminuída para o grupo PU e NBUT+4NC, respectivamente. A atividade de metaloproteinases (MMPs) 2 e 9 ativas extraídas do homogenato de pele de camundongos sem pelo após 24h da exposição à radiação UVB, avaliada por zimografia foi inibida pela fração NBUT. Os resultados observados pela fração NBUT de menor atividade antioxidante, comparados à fração HEX, sugerem que a atividade inibitória de MMPs não esteja necessariamente relacionada à capacidade antioxidante. Neste estudo não foi possivel identificar o(s) composto(s) provavelmente responsável(is) pela ação inibitória de MMPs da fração NBUT. / Ultraviolet radiation exposure induces the development of undesirable effects, including photoageing and photocarcinogenesis. One way of preventing these effects is the use of natural antioxidants. The Pothomorphe umbellata (PU) root extract shows antioxidant and photoprotective activities, which have been attributed, in part, to 4-nerolidylcatechol (4-NC), the main compound from this plant species. In previous studies, the plant extract was more efficient than 4-NC as an antioxidant and in metalloproteinases (MMPs) inhibitory activities, suggesting the presence of others compounds that could be related with these properties, as well as a possible synergic effect. The purpose of this study was to obtain fractions from PU without 4-NC, and to evaluate the antioxidant, photoprotection and skin MMPs 2 and 9 inhibitory activity of this fractionation. The P.umbellata hidroalcoholic root extract was submitted to liquid/liquid extraction with hexane followed by n-buthanol, from which derived a final residue of aqueous extract. The n-buthanolic (NBUT) and aqueous (AQ) fractions did not show the presence of 4-NC. The evaluation of the antioxidant activity by DPPH and ORAC for the 3 fractions showed higher antioxidant activity for the hexanic (HEX) fraction, followed by the NBUT and AQ fractions. The same profile was observed for phenolic compound concentration. However the presence of flavonols in the fractions and PU root extract was not detected. The gel-cream topic treatment containing PU root extract, NBUT fraction and NBUT+4NC, 2h before acute UVB exposure (2 MED - 204,36 mJ/cm2), was insufficient to promote the normal conditions of basal level antioxidant system depleted approximately 20% after 12h of the exposure compared with the control. The same treatment evaluated by immunohistochemistry, was not able to reduce the CPD (cyclobutane pyrimidine dimers) 2h after the exposure. In 12h reduction of SBC (sunburn cells) and PCNA (proliferating cell nuclear antigen) in PU and NBUT mouse groups was observed. The p53 and p21 proteins were reduced in PU and NBUT+4NC groups, respectively. The activity of metalloproteinases 2 and 9 (MMPs) of mouse skin homogenates after 24h acute UVB exposure, evaluated by zymography, was inhibited by the NBUT fraction. The observed results for NBUT that showed lower antioxidant activity than HEX suggest that the inhibitory effects of MMPs activity may not be related to the antioxidant capacity. It has not been possible to identify the compound(s) that are probably responsible for inhibitory activity of MMPs from the NBUT fraction.

O objetivo do presente estudo é o de verificar o efeito do diabetes na atividade de constituintes do sistema antioxidante das glândulas salivares submandibular (SM) e parótida (P) de ratos. Para indução do diabetes foi injetado em ratos, via intraperitonial, estreptozotocina (60mg/kg de peso corporal) dissolvido em tampão citrato de sódio 0,1M pH 4,5. Quarenta e oito horas após sua indução foi determinada a glicemia no sangue dos animais. Somente aqueles ratos que apresentaram glicemia superior a 350mg de glicose/100 ml de sangue foram considerados diabéticos. Após o período experimental, os animais foram sacrificados, sendo removidas as glândulas salivares e sangue para análise. Foram determinadas, através de espectrofotometria, as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). O conteúdo de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) foi determinado em HPLC. A peroxidação lipídica foi determinada no sangue e nas glândulas salivares SM e P usando o ácido tiobarbitúrico (TBARS), que reage com o malonaldeído (MDA) decorrente da peroxidação lipídica. Os resultados mostram um aumento na concentração de malonaldeído no sangue e na glândula submandibular, mas não na glândula parótida. A concentração de GSH e GSSG é maior na glândula SM em relação ao grupo controle, enquanto que a concentração de GSH é menor na glândula P. Não há diferença na atividade da enzima SOD em nenhuma das glândulas salivares. As enzimas CAT e GPx tem a sua atividade específica aumentada somente na glândula parótida. Na glândula submandibular, nenhuma destas duas enzimas sofrem alterações nas suas atividades. Podemos concluir que o sistema antioxidante das glândulas salivares respondem de forma diferente 30 dias após a indução do diabetes. Na glândula SM não há alteração na atividade das enzimas estudadas, porém há um aumento na peroxidação lipídica. Na glândula P, há um aumento na atividade das enzimas CAT e GPx, não sendo encontrado aumento da peroxidação lipídica. / The aim of the present study is to determine the effect of diabetes in the activity of some contents from the antioxidant system of submandibular (SM) and parotid (P) salivary glands. The diabetic state was induced by an injection of streptozotocin (60mg/kg body weight) dissolved in 0,1M sodium citrate buffer pH 4,5. Forty-eight hours after the injection, blood was collected and the glycemia determined. Only those animals presenting a blood glucose above 350mg glucose/100ml blood was used in the study. Thirty days after the induction of the diabetes, the animals were sacrificed, the salivary glands were removed and blood was collected and used in the determinations. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) was determined in spectrofotometer. The content of reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione was determined in HPLC. The lipid peroxidation was determined in blood and in SM and P glands, measuring the tiobarbituric acid (TBARS) which reacts with malonaldeyde (MDA) from lipid peroxidation. The results show an increase in MDA concentration from SM and blood, but not on P gland. The content of GSH and GSSG from SM gland increase, and the content of GSH from P gland decreased. There is no difference in the activity of SOD in both salivary glands. The activity of CAT and GPx from P gland increase, but in SM gland there is no difference. We can conclude that the antioxidant system from the salivary glands have different responses in diabetes state after 30 days of the induction. In SM gland, there is no difference in the activity of the enzymes, but we have an increase in the MDA content. In P gland, we have an increase in the CAT and GPx activity, but not in MDA concentration.

As flutuações de temperatura no ambiente marinho, decorrentes de processos naturais e de atividades antrópicas, como a flutuação das marés, o resfriamento de usinas e o aquecimento global afetam a dinâmica ecológica e as respostas fisiológicas de organismos marinhos, especialmente das macroalgas bentônicas. Macroalgas que ocorrem nos limites das faixas entre-marés podem estar sujeitas a fortes variações de temperatura em curto-prazo, como por exemplo: Sargassum e Pyropia. Sob aquela perspectiva, o objetivo deste projeto foi prover subsídios para a compreensão do efeito da temperatura e dos mecanismos de tolerância e sensibilidade das espécies do mediolitoral paulista Sargassum stenophyllum (Fucales, Ochrophyta) e Pyropia spiralis (Bangiales, Rhodophyta) mediante a análise da performance fotossintetizante, variação na composição química e respostas antioxidantes, além de fornecer informação sobre o seu potencial como produto funcional. As respostas das algas modelos foram avaliadas sob temperaturas de 15, 20, 25 (controle), 30 e 35 ºC ao longo de sete dias, em condições controladas de laboratório. As espécies de estudo mantiveram proporções semelhantes na dissipação de energia e taxa de crescimento, e poucas alterações no perfil químico (p. ex. pigmentos, carboidratos, carotenoides e aminoácidos) entre os 15 e 30 ºC, o qual pode ser compreendido como faixa de tolerância. Em contraste, existiu sensibilidade no talo das macroalgas estudadas na temperatura de 35 ºC, tendo diminuição na fotossíntese e crescimento desde o terceiro dia do período experimental. Em alta temperatura, acima de 30 ºC, tanto os filoides de S. stenophyllum quanto o talo da P. spiralis podem ter liberado substâncias químicas, como substâncias fenólicas, evidenciado pela mudança de cor na água do mar. Em condição de baixa temperatura (15 ºC), P. spiralis mostrou acúmulo de aminoácidos tipo-micosporinas. Em termos gerais, as espécies de estudo são promissoras como produto funcional envolvido na área de alimentação devido à sua composição nutricional e propriedades antioxidantes / Temperature fluctuations in the marine environment, due to natural processes and anthropogenic activities, caused by tidal fluctuation, cooling of energy power plants, and global warming affect the ecological dynamics and physiological responses of marine organisms, mainly in benthic macroalgae. Seaweeds inhabiting the boundaries of the intertidal zone may be subjected to strong short-term temperature variations, such as Sargassum and Pyropia. On this perspective, the aim of this project was to provide subsidies for understand the effect of temperature and the mechanisms of tolerance and sensitivity of the intertidal species Sargassum stenophyllum (Fucales, Ochrophyta) and Pyropia spiralis (Bangiales, Rhodophyta) from São Paulo, through the analysis of photosynthetic performance, chemical variation, and antioxidant responses, as well as, to provide information about its potential as functional product. The responses of the studied seaweeds were evaluated under temperatures of 15, 20, 25 (control), 30 and 35 °C over seven days in laboratory controlled conditions. The species displayed similar proportions in energy dissipation and growth rate, and few changes in the chemical profile (e.g. pigments, carbohydrates, carotenoids, and amino acids) between 15 and 30 ºC, which can be identificated as thermal tolerance range. In contrast, algae were sensitive at 35 ºC, with decrease in photosynthesis and growth since the third day of the experimental period. Under high temperature, above 30 °C, S. stenophyllum phylloids and P. spiralis thalli might have released chemical compounds, such as phenolic compounds, evidenced by color change of the seawater. Under low temperature condition (15 °C), P. spiralis showed accumulation of mycosporin-like amino acids. In general, the studied species are promising as a functional product involved in the feed area due to its nutritional composition and antioxidant properties

Este trabalho descreve o desenvolvimento e aplicações práticas de uma nova e simples metodologia eletroquímica para a determinação da capacidade antioxidante de moléculas modelo específicas e/ou algumas amostras complexas de alimentos normalmente consumidas no Brasil. Outros sistemas de interesse teórico ou tecnológico também foram investigados. O método se baseia no uso de uma quantidade conhecida de um íon inorgânico como oxidante e na determinação cronoamperométrica de sua concentração remanescente após reação com as espécies antioxidantes de interesse. Contudo, testes iniciais para diferentes marcas comerciais de sucos de laranjas usando Fe3+ como oxidante (ensaio FRAP modificado), só obtiveram êxito quando o antioxidante apresenta um comportamento eletroquímico totalmente irreversível como, por exemplo, o ácido ascórbico. Para superar esse problema, o ensaio foi então desenvolvido usando o Ce4+ como oxidante (ensaio CRAC) uma vez que sua redução após reação pode ser realizada em 0,8 V vs Ag/AgCl, uma região de potencial na qual não ocorre a redução das espécies formadas pela oxidação reversível ou quase reversível do antioxidante. Devido ao elevado potencial anódico requerido quando o Ce4+ é usado, foi necessário um filme de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho. Após uma rigorosa caracterização do sistema eletroquímico, foram realizadas determinações da capacidade antioxidante de oito compostos padrões (ácido ascórbico, ácido gálico, ácido tânico, BHA, catequina, quercetina, rutina e trolox), usando o ensaio CRAC. Os resultados mostraram uma correlação satisfatória com ensaios mais complexos reportados na literatura e foram aplicados em um conjunto de sucos de frutas industrializados, mostrando valores máximos com quase uma ordem de grandeza superior ao apresentado pelo composto de referência (trolox), com a seguinte seqüência de capacidade antioxidante: caju > goiaba > uva > manga > laranja > maracujá. Considerando a busca da indústria local de \"cachaça\" por madeiras alternativas em contrapartida aos tonéis de carvalho, o ensaio CRAC foi realizado usando quatro extratos etanólicos de madeiras brasileiras [Pequi (Caryocar brasiliense), Imbuia (Octea porosa), Cabreúva (Myrocarpus frondosus) e Cabreúva-vermelha (Myroxylon balsamum)] assim como um extrato de Carvalho (Quercus sp), para comparação. Os resultados indicaram um aumento na capacidade antioxidante na ordem apresentada acima e, apesar da melhor amostra (Cabreúva-vermelha) ter apenas 60% da capacidade antioxidante apresentada pelo carvalho, sua disponibilidade e preço despertam o interesse por pesquisas futuras. Uma avaliação comparativa dos resultados obtidos usando os ensaios CRAC e DPPH foi realizado para extratos metanólicos de cana-de-açúcar e polpa de maracujá. Essa comparação revelou uma diferença quantitativa entre os valores dos ensaios, porém, a hierarquia foi mantida para cada conjunto de resultado. Esse efeito foi atribuído às diferenças nos mecanismos dominantes para a desativação radicalar, bem como para as condições experimentais de cada ensaio. A correlação entre a estrutura e a atividade antioxidante de moléculas modelo de flavonóides sob investigação foi relatada devido à presença de certos grupos substituintes na estrutura de difenilpirano. A atividade hierárquica para tais grupos foi estabelecida como: OH(C2´C4´) > OH(C4´) ~ OH(C3´C4´) > C2=C3 + 4-oxo > OH(C3,C5) + 4-oxo > OH(C3) + 4-oxo > OH(C5) + 4-oxo > OH(C3,C5). A formação de complexos entre flavonóides e íons metálicos, tal como o Fe2+, tem um forte efeito sobre a capacidade antioxidante e o ensaio CRAC mostrou que para a morina, quercetina e fisetina, esse aumento foi de 15,3; 31,8 e 27,9%, respectivamente. Por outro lado, para a catequina e crisina, o aumento foi de apenas 1,8 e 7,8%, respectivamente. Esses aumentos foram relatados devido à presença de, pelo menos, um dos três tipos de sítios ativos na molécula polifenólica que interage com íons metálicos. Todos esses resultados confirmam que o ensaio CRAC é uma ferramenta simples e viável para a determinação da capacidade antioxidante de uma variedade de sistemas práticos e moléculas modelo. / This work describes the development and practical applications of a novel and simple electrochemical methodology for the determination of the antioxidant capacity of specific model molecules and/or some complex food samples currently consumed in Brazil. Other systems having either theoretical or technological interest were also investigated. The method is based on the use of a known amount of an inorganic ion as the oxidant and in the chronoamperometric determination of its remaining concentration after reaction with the chosen antioxidant species. However, initial tests for different commercial brands of orange juices using Fe3+ as the oxidant (modified FRAP assay) were only successful when the antioxidant has a totally irreversible electrochemical behavior as, for example, ascorbic acid. To overcome this problem, the assays were then performed using Ce4+ as the oxidant (the CRAC assay) since its reduction after reaction can be carried out at 0.8 V vs Ag/AgCl, a potential region where the reduction of species formed by the reversible or quasi-reversible oxidation of the antioxidant does not occur. Due to the high anodic potentials required when using Ce4+, it was necessary to have a boron-doped diamond film as the working electrode. After a rigorous characterization of the electrochemical systems, measurements of the antioxidant capacity of eight standard compounds (ascorbic acid, gallic acid, tannic acid, BHA, catechin, quercetin, rutin and trolox) were carried out using the CRAC assay. The results showed a satisfactory correlation with those reported in the literature using other more complex assays and these studies were then applied to a set of industrialized fruit juices showing maximum values almost one order of magnitude higher than that of the reference compound (trolox) and following the antioxidant capacity sequence: cashew>guava>grape>mango>orange>passion fruit. Considering that the local \"cachaça\" industry is looking for alternative woods to the use of oak barrels, CRAC assays were carried out using four ethanol extracts of Brazilian woods [Pequi (Caryocar brasiliense), Imbuia (Octea porosa), Cabreúva (Myrocarpus frondosus) e Cabreúva-vermelha (Myroxylon balsamum)] as well as an Oak (Quercus sp) extract, for comparison. The results indicate an increasing antioxidant capacity in the order presented above and, although the best sample (Cabreúva-vermelha) has only 60% of the capacity shown by oak, its local availability and price makes it interesting for further research. A comparative evaluation of the results obtained using the CRAC and the DPPH assays was carried out for methanol extracts of sugar cane juice and passion fruit pulp. That comparison revealed a quantitative difference between the assay values but the hierarchy was maintained for each set of results. Such effect was attributed to differences in the prevailing mechanism for radical deactivation, as well as, the experimental conditions used for each assay. The correlation between structure and antioxidant activity of model flavonoid molecules under investigation was related to the presence of certain groups in the diphenilpyrene structure. The activity hierarchy for them was established as: OH(C2´C4´) > OH(C4´) ~ OH(C3´C4´) > C2=C3 + 4-oxo > OH(C3,C5) + 4-oxo > OH(C3) + 4-oxo > OH(C5) + 4-oxo > OH(C3,C5). The complex formation between flavonoids and metal ions, such as Fe2+, has a strong effect on the antioxidant capacity and CRAC assay showed that for morin, quercetin and fisetin the increase was 15.3, 31.8 and 27.9%, respectively. On the other hand, for catechin and chrysin the increase was only 1.8 and 7.8%, respectively. These increases were related to the presence of, at least, one of three types of active sites in the polyphenolic molecule that can interact with metal ions. All these findings confirm that the CRAC assay is simple and convenient tool for the determination of the antioxidant capacity of a variety of practical systems and model molecules.

Muitas espécies de animais vivenciam situações nas quais há uma profunda depressão metabólica, como na anóxia, na hipóxia e na hibernação. Durante a reoxigenação ou o despertar, ocorre aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que tendem a causar danos oxidativos. Diferentes enzimas antioxidantes protegem o organismo contra as ROS, porém não se sabe qual a real importância de cada uma delas durante a reoxigenação. A hibernação é uma das formas de hipometabolismo menos estudadas, fazendo com que haja questionamentos sobre como os hibernantes se protegem das ROS durante o despertar. A análise dos dados existentes é complexa devido à existência de variáveis não controladas, como o efeito do jejum associado à hibernação. Nesta tese, foram desenvolvidos dois projetos. Em um, investigou-se a importância da catalase num ciclo de anóxia e reoxigenação em caramujos pulmonados. No segundo, investigou-se o efeito da hibernação e da privação alimentar no intestino de lagartos teiús. Com base nos resultados, foi possível concluir que a catalase exerce um papel complementar contra os danos oxidativos causados pelas ROS e em conjunto com os demais componentes do sistema antioxidante. Porém, sua função não parece ser essencial, sendo em grande parte compensada pela atividade de glutationa peroxidase. Também foi possível concluir que a hibernação, estudada sem a interferência de drásticas quedas da temperatura, causa nítidas alterações no metabolismo de radicais livres no intestino de lagartos, com queda de atividades enzimáticas e de concentração de glutationa. A ausência de grandes danos oxidativos durante o despertar dos animais mostra que eles têm um sistema antioxidante eficiente. A privação alimentar resultou em respostas semelhantes as da hibernação, mas parece ter causado um certo grau de estresse oxidativo. Os resultados apresentados nesta tese respondem dois questionamentos no estudo do metabolismo de radicais livres em situações que envolvem flutuações na disponibilidade e no consumo de oxigênio. / Many species of animals experience situations in which occurs a profound metabolic depression, like anoxia, hypoxia and hibernation. During reoxygenation or arousal, there is an increase of the production of reactive oxygen species (ROS), which tend to cause oxidative damage. Different antioxidant enzymes protect the organims against the ROS, however the real importance of each one of them during reoxygenation is not known. Hibernation is one of the types of hypometabolism less studied, and questions about how the hibernators protect themselves from ROS during the arousal have not yet been answered. The analysis of the existent data is complex due to the existence of uncontrolled variables. In this thesis were carried out two studies in which were investigated: the importance of catalase in a cycle of anoxia and reoxygenation in pulmonate snails, and the effect of hibernation and of food deprivation in the intestine of tegu lizards. Considering the results, it was possible to conclude that catalase plays an complementary role against the damages caused by ROS and in association with the other components of the antioxidant system. However, its function seems to be non-essential, being greatly compensated by the glutathione peroxidase activity. It was also possible to conclude that hibernation, studied without the interference of drastic falls in temperature, causes clear alterations in free radicals metabolism in the lizards intestine, with a reduction in enzymes activities and in glutathione concentration. The absence of big oxidative damage during the arousal of the animals shows that they have an efficient antioxidant system. Food deprivation resulted in similar responses of those from hibernation, but seemed to cause some degree of oxidative stress. The results presented in this thesis answer two questions in the study of the free radical metabolism in situations that involve fluctuations in oxygen availability and consumption.

O crescimento da produção e comercialização de pescado gera um aumento considerável na quantidade de resíduos. A escassez de reutilização e as formas incorretas de descarte tem sido preocupação constante das indústrias e dos pesquisadores, que buscam soluções para a melhor destinação dos mesmos. Buscando o conceito de empresa eco eficiente, são propostos tratamentos que levem à obtenção de coprodutos. A produção de \"farinha de peixe\" é a forma de aproveitamento do resíduo mais utilizada, porém apresenta baixo valor comercial. A elaboração de hidrolisados proteicos apresenta-se como uma alternativa de maior valor agregado. A clivagem proteica realizada por enzimas específicas pode gerar peptídeos biologicamente ativos, que apresentam propriedades funcionais e medicinais, bem como atividade antioxidante. O objetivo deste trabalho foi a elaboração e caracterização de hidrolisados proteicos de cabeças de tilápia (Oreochromis niloticus), a aferição da atividade antioxidante destes e sua relação com o tamanho de peptídeos, como forma de se obter e disponibilizar coprodutos, visando a sustentabilidade da cadeia produtiva desta espécie. O hidrolisado proteico de tilápia (HPT) foi obtido por hidrólise enzimática e empregando as enzimas Neutrase (Protemax NP-800), Papaína (Brauzyn-100) e Pepsina nos tempos 30, 60 e 120 minutos. O grau de hidrólise foi determinado através da metodologia com utilização do o-ftaldialdeído. A atividade antioxidante foi avaliada pelos ensaios do DPPH e ABTS+. O perfil de peptídeos foi avaliado através da separação por cromatografia em gel com coluna Superdex peptide. O grau de hidrólise para os tratamentos com a neutrase (30 min, 60 min, 120min) variou de 11,3% a 14,1%. No tratamento com a papaína (30 min, 60 min, 120 min) o grau de hidrólise foi superior ao observado com a enzima neutrase, apresentando variação de 21,14%a 25,28%. A variação para o tratamento com a pepsina (30 min, 60 min e 120 min) foi de 10,18% a 14,97% Todos os hidrolisados apresentaram propriedade antioxidante através da inibição de radicais livres, mesmo a concentrações baixas de hidrolisado. A inibição de 50% (EC50) dos radicais na metodologia de DPPH ocorreu com concentrações inferiores a 3mg/mL para todos os tratamentos, sendo a menor concentração 1,36 mg/mL (pepsina 120 min) e a maior 2,70 mg/mL (neutrase 30 min). Na metodologia de ABTS, concentrações superiores foram necessárias para a inibição de 50% dos radicais, porém ainda assim foram inferiores a 5%. A menor concentração foi 3,58 mg/mL (pepsina 120 min) e a maior foi de 4,49 mg/mL (neutrase 60 min). O tamanho das cadeias de peptídeos para a maioria dos tratamentos se situou entre cadeias de 1000 a 10000Da, sendo que o tratamento com pepsina promoveu porcentagem de peptídeos com maior peso molecular seguido pela neutrase. A papaína foi a enzima que promoveu maior clivagem de proteína e menores tamanhos de peptídeos, localizados na faixa de 100 a 1000 Da, valor relacionado ao seu maior grau de hidrólise. As propriedades observadas nos hidrolisados elaborados indicam que este pode ser um potencial suplemento alimentício devido ao seu elevado valor proteico, aditivos para conservação de alimentos e ainda aplicados na indústria farmacêutica. / The growth in production and marketing of fish generates a considerable increase in the amount of waste. The scarcity of re-used products and incorrect disposal forms has been a constant concern of industries and researchers who seek solutions for better allocation thereof. Seeking an efficient eco company concept, proposed treatments are leading to obtaining co-products. The production of \"fish meal\" with the residues is the most common use for the waste, but has a low commercial value. The preparation of protein hydrolysates is presented as an alternative with higher added value. The protein cleavage performed by specific enzymes can generate biologically active peptides which exhibit functional and medicinal properties as well as antioxidant activity. The objective of this work was the preparation and characterization of protein hydrolysates of tilapia (Oreochromis niloticus) , the measurement of antioxidant activity of these and its relation to the size of peptides as a way to obtain and provide co-products , aimed at the sustainability of the chain production of this species. The protein hydrolyzate of tilapia (HPT) was obtained by enzymatic hydrolysis and employing the enzyme Neutrase (Protemax NP- 800), Papain (Brauzyn - 100) and Pepsin at 30, 60 and 120 minutes. The degree of hydrolysis was determined using o- phthaldialdehyde . In the treatment with papain (30 min, 60 min, 120 min) the degree of hydrolysis was higher than that observed with Neutrase enzyme, showing variation of 21.14% to 25.28%. The variation for treatment with pepsin (30 min, 60 min and 120 min) was 10.18% and 14.97% hydrolyzed. All samples showed antioxidant properties through inhibition of free radicals, even at low concentrations hydrolyzate. The 50% inhibition (EC50) of the DPPH radical methodology occurred at concentrations below 3 mg / ml for all treatments, being the lowest concentration 1.36 mg / ml (lot 120 min) and the largest 2.70 mg / ml (Neutrase 30 min). In the ABTS method, higher concentrations were required for 50% inhibition of the radical, but still was less than 5%. The lowest concentration was 3.58 mg / mL (120 pepsin min) and the largest was 4.49 mg / mL (Neutrase 60 min). The size of the peptide chains to most treatments ranged from 1000 to 10000Da chains, whereas treatment with pepsin promoted percentage of peptides of higher molecular weight followed by Neutrase. The papain was the enzyme cleavage that generated more protein and peptides of smaller size, situated in the range from 100 to 1000 Da, which is related to the higher degree of hydrolysis. The properties observed in hydrolysates produced indicate that this is a potential food supplement because of its high protein value for food preservation additives, and applied in the pharmaceutical industry.

Setenta e sete vacas distribuídas em três propriedades foram divididas em três grupos: G1 (sem suplementação vitamínica), G2 (suplementação com 1000 UI de vitamina E durante 30 dias antes do parto previsto e 30 dias após o parto), G3 (suplementação com 1000 UI de vitamina E de 30 a 15 dias antes do parto previsto e 3000 UI de 15 dias antes do parto a 30 dias após o parto). Todas as propriedades continham os três grupos, sendo que as vacas foram sorteadas para cada grupo de acordo com a ordem de parição e a data prevista para o parto, para que ficassem homogeneamente distribuídas. Na interrupção da lactação que antecedeu o experimento, os quartos mamários foram tratados com antibióticos específicos para o tratamento de vacas secas. Os animais foram alimentados com silagem de milho e concentrado, permanecendo confinados com acesso a piquetes de descanso. Foram efetuados os exames: tamis, CMT e microbiológico do leite de cada quarto mamário, logo após a fase colostral e uma vez por mês durante a lactação, para o diagnóstico de mastite. Foram colhidas amostras de soro de 20% dos animais e dos alimentos fornecidos para a análise de selênio. Os resultados obtidos mostraram que a ocorrência de mastite clínica foi maior (p<0,05) no grupo não suplementado do que nos grupos suplementados. Não foram verificadas diferenças estatísticas entre os três grupos quanto à ocorrência de mastite subclínica. Os principais microrganismos isolados foram Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Corynebacterium sp. A ocorrência de infecções intramamárias foi maior (p<0,05) no grupo G3 do que nos grupos G2 e G1 e maior (p<0,05) no grupo G2 do que no grupo G1. Em relação à ocorrência de mastite nas fazendas, foi verificado maior (p<0,05) ocorrência da forma clínica no grupo G1 do que nos demais grupos apenas em uma delas e quanto às infecções intramamárias, o grupo G3 apresentou maior (p<0,05) ocorrência que o grupo G1 em todas as fazendas. Os resultados das análises sorológicas de selênio mostraram que as concentrações do elemento nos animais estavam adequadas. / Seventy seven dairy cows, kept in three herds were randomly allocated in three homogeneous groups: Group 1, control group (without vitamin E supplementation), Group 2 (supplementation of 1,000 UI of vitamin E during 60 days, thirty days prior and 30 days post-parturition) and Group 3 (supplementation of 1,000 UI of vitamin E from the thirtieth day to the fifteenth day before parturition, and, then, a supplementation of 3,000 UI from the fourteenth day before parturition until the thirtieth day after it). All the cows in the groups received a long-action intramammary antibiotic at the drying off. Animals were fed with corn silage and concentrate-mixture, and they were confined in a free stall system with grass paddock. Examinations were performed at the drying off, in the first week of lactation and once a month during lactation. Strip cup, CMT and the microbiological exams were used. Twenty percent of the animals of each group were randomly assigned for selenium analysis. The obtained results showed that clinical mastitis occurrence in Group 1 was significantly higher than in Groups 2 and 3. In relation to subclinical mastitis cases, no significant differences were detected among the groups. Microorganisms that were most frequently isolated were: Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Corynebacterium sp. Results obtained for mammary gland infections showed a higher level of infections in supplemented groups compared to the control group. The occurrence of clinical mastitis in Group 1 was significantly higher than in Groups 2 and 3 only in one of the dairy herds. The occurrence of the intramammary infections was significantly higher in Group 3 than in Group 1 in all herds. The results obtained from selenium analysis demonstrated to be range of recommended levels.