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La lutte biologique par utilisation de micro-organismes a indéniablement un potentiel de développement considérable. Dans un contexte multidisciplinaire et fondamental de physio-phytopathologie moléculaire et répondant à d’éminents enjeux appliqués et attendus par les acteurs de la profession oléicole et les consommateurs, nous nous sommes projetés dans l’étude des propriétés intrinsèques d’un agent de biocontrôle fongique, Trichoderma harzianum (souche Ths97) contre l’agent de la fusariose Fusarium solani (souche Fso14), qui sévit sévèrement sur une culture pérenne majeure pour la Tunisie, l’oléiculture. Deux axes de recherche ont été menés. Dans le premier axe, nous avons démontré que Ths97 est un agent de biocontrôle efficace contre la virulence de F. solani Fso14. Cette capacité s’accompagne d’une accumulation des défenses chez le partenaire végétal, des accumulations qui sont d’autant plus fortes quand l’agent bénéfique est en présence du pathogène (événements de priming). De même, des tests in vitro montrent que Ths97développe des activités mycoparasites envers F. solani Fso14, en émettant des structures d’infection classiques tels des enroulements et accolements d’hyphes, des appressoria et des papilles. Quant au second axe d’étude, nous avons étudié la superfamille des perméases Major Intrinsic Proteins (MIP) dans le genre Trichoderma. Cette famille multigénique n’a jamais été étudiée chez un agent fongique hyperparasite. Sept membres MIP sont présents chez T. harzianum, et se classent en 3 sous-groupes, les AQP, les AQGP et les XIP. La modélisation des structures tridimensionnelles et les fonctions putatives de transport pour l’eau et quelques polyols ont été étudiées. Enfin, leurs patrons transcriptionnels ont été suivis chez Ths97 in planta en situation d’antagonisme et in vitro en situation de parasitisme vis-à-vis de Fso14, et montrent que 4 MIP sont exprimées et régulées différentiellement selon que Ths97 est au contact de Fso14 ou pas. Nos travaux ont donc mis en lumière que Ths97 doit être considéré comme un agent biofongicide et biostimulateur de défenses végétales, puis que les MIP seraient impliqués dans les relations trophiques que met en place T. harzianum avec son environnement. Ces données devraient intégrer le développement de procédés plus efficaces et/ou plus durables pour la protection des cultures d’oliviers en Tunisie ainsi qu’à travers le monde. / Biological disease control through the use of microorganisms has a great potential for future use in integrated pest management. In a multidisciplinary and fundamental context of molecular physio-phytopathology and to provide solutions for the actors in the olive profession and the consumers, we have been studying the activity of a fungal biocontrol agent, Trichoderma harzianum (strain Ths97) against the olive tree pathogen Fusarium solani (strain Fso14), which causes major problems for olive production in Tunisia and elsewhere. The project consists of two parts. In the first part, we have demonstrated that Ths97 is a biocontrol agent effective against the F. solani Fso14 pathogen. Induction of plant defence responses by Ths97 was shown to be partly responsible for the biocontrol effect. In vitro tests further showed that Ths97 develops mycoparasitic activities towards F. solani Fso14, by forming infection structures such as hyphae windings and wedges, appressoria and papillae. In the second part of the study, we investigated the Major Intrinsic Proteins (MIP) superfamily in the Trichoderma genus. This multigenic family has never been investigated in a hyperparasitic fungal species. Seven MIP members are present in T. harzianum, and are classified into 3 subgroups: AQP, AQGP and XIP. Their three-dimensional structures and their putative involvement in transport of water and certain polyols have been examined. Finally, their transcription profiles were monitored in Ths97 in planta in antagonistic situations and in vitro in a parasitic situation with Fso14 and show that 4 MIP are expressed and regulated differentially during the interaction. Our work has shown that Ths97 must be considered as a biological control agent and biostimulator of plant defences, and that MIPs are involved in the trophic relationships between T. harzianum and the environment. These data contributes to the further development of T. harzianum as an efficient biocontrol agent for sustainable protection of olive trees in Tunisia and around the world.

abstract: Glioblastoma (GBM) is the most common primary brain tumor with an incidence of approximately 11,000 Americans. Despite decades of research, average survival for GBM patients is a modest 15 months. Increasing the extent of GBM resection increases patient survival. However, extending neurosurgical margins also threatens the removal of eloquent brain. For this reason, the infiltrative nature of GBM is an obstacle to its complete resection. We hypothesize that targeting genes and proteins that regulate GBM motility, and developing techniques that safely enhance extent of surgical resection, will improve GBM patient survival by decreasing infiltration into eloquent brain regions and enhancing tumor cytoreduction during surgery. Chapter 2 of this dissertation describes a gene and protein we identified; aquaporin-1 (aqp1) that enhances infiltration of GBM. In chapter 3, we describe a method for enhancing the diagnostic yield of GBM patient biopsies which will assist in identifying future molecular targets for GBM therapies. In chapter 4 we develop an intraoperative optical imaging technique that will assist identifying GBM and its infiltrative margins during surgical resection. The topic of this dissertation aims to target glioblastoma infiltration from molecular and cellular biology and neurosurgical disciplines. In the introduction we; 1. Provide a background of GBM and current therapies. 2. Discuss a protein we found that decreases GBM survival. 3. Describe an imaging modality we utilized for improving the quality of accrued patient GBM samples. 4. We provide an overview of intraoperative contrast agents available for neurosurgical resection of GBM, and discuss a new agent we studied for intraoperative visualization of GBM. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Neuroscience 2014

La neuromyélite optique (NMO) est une maladie inflammatoire du système nerveux central récemment mieux comprise par la découverte d’un anticorps sérique spécifique dirigé contre l’aquaporine 4 (anticorps anti-AQP4). L’objectif de cette thèse a été de développer une recherche translationnelle pour améliorer la connaissance de la réponse immunitaire dans la NMO. Nous avons d’abord développé et étudié un modèle animal de NMO en laboratoire afin de mieux comprendre la physiopathologie d’une inflammation optico-médullaire. Nous avons aussi amélioré la connaissance de la NMO humaine. Nous avons montré que la réactivité anti-AQP4 n’était pas corrélée à l’activité de la maladie et retrouvé une réactivité contre d’autres protéines que l’AQP4. Nous avons aussi mis en évidence des anomalies métaboliques sériques (scyllo-inositol et acétate), et une diminution du volume de la substance blanche cérébrale, ce qui ouvre la voie à de nouvelles recherches pour confirmer et exploiter ces résultats. / Neuromyelitis optica (NMO) is an inflammatory disease of the central nervous system in which a specific antibody targeting aquaporin 4 (anti-AQP4) was recently found. The aim of this thesis is to develop a translational research in order to improve our knowledge of the immune response in NMO. We have therefore studied a animal model mimicking NMO and allowing a better comprehension of optico-spinal inflammation. In the human subjects suffering from NMO, we have also found that anti-AQP4 reactivity was not correlated to the disease activity and that reactivities against other proteins may exist. We have discovered changes in the serum concentrations of some metabolites (scyllo-inositol and acetate) and a decrease in the volume of brain white matter. These findings have to be confirmed by other studies and may improve our comprehension of NMO.

Les mouvements stomatiques en réponse aux stimuli environnementaux sont cruciaux pour le contrôle du statut hydrique de la plante et sa protection contre les pathogènes. L'acide abscissique (ABA) et les Motifs Moléculaires Associés aux Pathogènes (PAMPs), comme le peptide flg22, déclenchent, via le peroxyde d'hydrogène (H2O2), des processus de signalisation qui conduisent à la fermeture stomatique. Bien que les mouvements stomatiques impliquent d'importants flux membranaires d'eau et changements de volume cellulaire, le rôle des canaux hydriques membranaires (aquaporines, AQP) est resté hypothétique. Des expérimentations sur épidermes isolés montrent que les plantes pip2;1 d'Arabidopsis thaliana invalidées pour le gène codant pour PIP2;1, une AQP de la membrane plasmique, présentent un défaut de fermeture stomatique en réponse à l'ABA et au flg22, mais des réponses normales à l'obscurité, la lumière ou le dioxyde de carbone. Les protoplastes de cellules de garde de plantes sauvages présentent, contrairement aux protoplastes de plantes pip2;1, une augmentation de perméabilité hydrique (Pf) de deux fois en réponse à l'ABA. Une sonde génétique sensible à l'H2O2 (HyPer) a permis de révéler une accumulation d'H2O2 dans les cellules de garde de plantes sauvages en réponse à l'ABA et au flg22, accumulation qui est abolie chez les plantes pip2;1. SnRK2;6 (OST1), une protéine kinase étroitement liée aux récepteurs de l'ABA, est capable de phosphoryler in vitro un peptide cytoplasmique de PIP2;1, au niveau du résidu Ser121. SnRK2;6 augmente aussi l'activité de transport d'eau de PIP2;1 après co-expression en ovocytes de xénope. L'expression dans des plantes pip2;1 de formes mutées de PIP2;1 mimant un état phosphorylé (Ser121Asp) ou non phosphorylé (Ser121Ala) a permis de montrer que l'augmentation de Pf en réponse à l'ABA, l'accumulation intracellulaire d'H2O2 et la fermeture stomatique induites par l'ABA ou le flg22, requièrent la phosphorylation de PIP2;1 en Ser121. Ce travail fournit les premières évidences génétiques et physiologiques directes d'un rôle des AQPs dans les mouvements stomatiques. Nous proposons que PIP2;1 joue à la fois un rôle hydraulique et signalétique en facilitant le transport d'eau et H2O2 au travers de la membrane plasmique des cellules de garde. Sa phosphorylation en Ser121, par SnRK2.6 notamment, serait nécessaire à son activation dans ce contexte. / Stomatal movements in response to changing environmental conditions are crucial for controlling the plant water status and protecting plants against pathogens. Abscisic acid (ABA) or Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) such as the flg22 peptide, induce, via hydrogen peroxide (H2O2), signaling networks that lead to stomatal closure. Although stomatal movements involve marked water fluxes and changes in cell volume, the role of membrane water channels (aquaporins, AQP) has remained hypothetical. Functional assays in epidermal peels showed that Arabidopsis thaliana pip2;1 plants invalidated for plasma membrane AQP PIP2;1 have a defect in stomatal closure in response to ABA and flg22, but normal responses to dark, light or carbon dioxide. Guard cell protoplasts from wild-type plants showed a two-fold increase in osmotic water permeability (Pf) in response to ABA which was fully abrogated in pip2;1 plants. Plants expressing a H2O2 sensitive probe (HyPer) revealed an accumulation of H2O2 in guard cells of wild-type plants in response to ABA and flg22, which was abolished in pip2;1 plants. OST1 (SnRK2.6), a protein kinase closely linked to ABA receptors, was able to phosphorylate, in vitro and at Ser121, a cytosolic peptide of PIP2;1. SnRK2.6 also enhanced PIP2;1 water transport activity after co-expression in Xenopus oocytes. Expression in pip2;1 plants of a phosphomimetic (Ser121Asp) or a phosphodeficient form (Ser121Ala) of PIP2;1 allowed to demonstrate that the increase in guard cell protoplast Pf, the intracellular accumulation of H2O2 and stomatal closure induced by ABA and flg22 require the phosphorylation of PIP2;1 at Ser121. This work provides the first direct genetic and physiological evidence for aquaporin function in guard cells. We propose that PIP2;1 plays both a hydraulic and signaling role in guard cells, by facilitating the transport of water and H2O2 across the guard cell plasma membrane. PIP2;1 phosphorylation at Ser121, by SnRK2.6 in particular, would be required in this context.

Astrocytes posses a wide range of functions within the brain. In response to ischemic conditions they swell due to increased uptake of osmolytes and they are mainly responsible for cytotoxic edema formation. However, they are also able to regulate their volume by releasing osmolytes together with water via the process of regulatory volume decrease (RVD). The Aquaporin 4 (AQP4) channel and Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel are suspected to be strongly involved in these processes of astrocytic volume regulation. The goal of the present diploma thesis was to clarify the role of both channels in astrocytic swelling in situ. For our experiments we used a subpopulation of green fluorescent protein-labelled astrocytes from AQP4-deficient (AQP4-/- ), TRPV4-deficient (TRPV4-/- ) and control (Ctrl) mice. Cell volume alterations were induced in acute brain slices by hypoosmotic stress or by oxygen-glucose deprivation (OGD). Data were quantified using fluorescence intensity-based approach in the whole cells and in astrocytic endfeet. Our results indicate, that there is no difference in astrocytic swelling or cell volume recovery between astrocytes from AQP4-/- , TRPV4-/- and control mice when exposed to hypoosmotic stress. On the contrary, volume changes induced by OGD varied...

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Je utilise le AFM et le HS-AFM pour étudier les caractéristiques mécaniques du cellule du cristallin et aussi des protéines de membrane de la cellule, AQP0 et Connexon. L’énergie d'interaction de la AQP0 est -2.7 kBT, très nécessaire pour former les microdomaines de jonctions (junctional microdomain). Aussi c' est la première fois qu il est possible de voir des protéines individuel et son mouvement en cellules vivants. La formation de microdomaines est important pour la transparence du cristallin, et le AQP1 ne le peux faire. / I used the AFM and HS-AFM for characterise the eye lens and the eye lens membrane protein, AQP0 and connexon.A QP0-AQP0 interaction energy is -2.7kBT, it is important for the formation of junctional microdomains, which keep the distance between the cells lens and lens transparency. this is the first report which is present time the visualization of unlabelled membrane proteins on living cells under physiological conditions. AQP1 can not maintain the lens transparency because it does not form junctional microdomains.

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