A arginina é um aminoácido condicionalmente essencial que participa de inúmeras reações metabólicas no organismo como, por exemplo, o ciclo da uréia, a síntese de creatina e a geração de óxido nítrico (NO). Além dessas funções a arginina é associada, com a sensibilidade à insulina, a secreção de GH e mais recentemente com a síntese protéica muscular. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da suplementação via oral crônica de L-arginina sobre a síntese protéica muscular, pela via da mTOR, a fim de contribuir com as novas discussões científicas acerca deste aminoácido de ampla atuação. Métodos: Foram utilizados ratos wistar machos adultos com cerca de 200g de peso corporal divididos em quatro grupos de quatorze animais denominados na seguinte forma: Arginina Treinado (AT), Arginina Sedentário (AS), Dieta-Controle Treinado (CT) e Dieta-Controle Sedentário (CS). Ambas as dietas foram elaboradas com base das recomendações da AIN-93, sendo que a dieta enriquecida com arginina recebeu acréscimo de 2% deste aminoácido e a dieta controle recebeu um mix de aminoácidos não essenciais para garantir que ambas fossem isonitrogenadas e isocalóricas e as proporções de aminoácidos presente nas rações foi conferida por aminograma. O treinamento dos animais consistiu em exercício anaeróbio com sessões que eram compostas de 4 séries de 10 saltos com um minuto de descanso entre estas em tanque de água. Os saltos eram desempenhados com carga de 50% do peso corporal acoplado ao tórax dos animais na freqüência de 5 dias por semana por 6 semanas. A evolução da massa corporal dos animais bem como o consumo de ração foram avaliadas três vezes por semana e estimada uma média semanal. Foram realizados testes de tolerância oral à glicose (OGTT) e tolerância à insulina (ITT) no início e ao final do experimento em todos os animais para avaliar alterações na sensibilidade à insulina. Após 72hs da última sessão de treinamento os animais foram anestesiados para infusão de insulina, coleta dos músculos gastrocnêmio e plantar, fígado, sangue e eutanasiados conforme protocolo aprovado pelo CEA-USP. As análises bioquímicas foram determinações séricas de insulina, GH, IGF-1 e a proteína transportadora de IGF-1 (IGFBP-3), glicose plasmática, uréia e creatinina séricas, IGF-1 muscular e hepático por kits comerciais de tecnologia multiplex Luminex e aminograma sérico por cromatografia. As análises moleculares foram realizadas para as proteínas chaves envolvidas na via de síntese protéica muscular em sua forma total e fosforilada, sendo estas: IRS-1, Akt, mTOR, 4E-BP1 e p70S6K determinadas por método de western blotting. Resultados: Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros avaliados com exceção da creatinina que se mostrou mais elevada nos grupos suplementados com arginina. A suplementação de arginina, nas concentrações administradas, bem como o exercício de alta intensidade pelo período determinado não foram capazes de alterar a expressão das proteínas envolvidas na regulação de síntese protéica muscular de ratos nem a sensibilidade celular à insulina. Conclusão: não houve aumento da síntese protéica muscular com a suplementação de arginina, nestas condições experimentais. / The arginine is an amino acid conditionally essential that participates in innumerous metabolic reactions in the body like, for instance, the urea cycle, the synthesis of creatine and production of nitric oxide (NO). Besides those functions the arginine is associated, with the insulin sensitivity, GH secretion and most recently with muscle protein synthesis. The aim of this work was to investigate the effect of L-arginine chronic oral supplementation on the muscle protein synthesis, through mTOR pathway, in order to contribute with new scientific discussions about this broad action amino acid. Methods: Wistar male adult rats were used with about 200g body weight distribute into four groups of fourteen animals named this way: Trained Arginine (TA), sedentary Arginine (SA), Trained Diet-Control (TC) and Sedentary Diet-control (SC). Both diets were elaborated based on the AIN-93 recommendations, considering that the enriched diet with arginine was added 2% of this amino acid and the control diet received a mix of non-essential amino acid in order to ensure that both were isonitrogenous and isocaloric and the proportions of present amino acids in the rations have been checked through aminogram. The animals training consisted of anaerobic exercise with sections composed by four jump series, with one minute rest among these in a PVC cube water. The jumps were performed with a load of 50% of their body weight attached in the animal\'s trunk, five days a week over six weeks. The animals\' body weight evolution as well as the food intake were evaluated three times a week in order to figure a weekly average. Oral glucose test tolerance (OGTT) and insulin test tolerance (ITT) have been done in the beginning and in the end of the experiment in all animals to evaluate insulin sensitive changes. The animals were anesthetized to insulin infusion, gastrocnemic and plantaris muscles, liver and blood collects 72 hrs after the last training section and afterwards sacrificed according to CEA-USP approved protocol. The biochemical analysis were blood determination of insulin, GH, IGF-1 and its binding protein 3 (IGFBP-3), glucose, urea and creatinine, and muscle and liver IGF-1 through commercial kits of multiplex Luminex technology and seric aminogram through chromatography. The molecular analysis were performed for the key proteins of the muscle protein synthesis pathway in its total and phosphorylated form: IRS-1, Akt-1, mTOR, 4E-BP1 and p70S6K determined by western blotting method. Results: Significant statistical differences were not found to all evaluated biomarkers in this experiment except for creatinine which was more elevated in groups supplemented with arginine. The arginine supplementation, in these given doses, as well as the high-intense exercise, failed in stimulate both the expression of the proteins involved in the muscle protein synthesis regulation and the insulin sensitivity in the rats in this condition. Conclusion: There hasn\'t been any increase in the muscle protein synthesis with arginine supplementation, in these experimental conditions.

Investigamos os efeitos dos exercícios físicos (EF) aeróbios e/ou suplementação de L-Arginina (L-ARG) sobre as possíveis alterações da composição corporal (CC) de ratas hipertensas (SHR) ovariectomizadas. As ratas (com aproximadamente 13 semanas de idade) foram submetidas a remoção cirúrgica dos ovários para podermos estudar o efeito da depleção de hormônios ovarianos, que ocorre na menopausa. Após 30 dias de ovariectomia, as ratas realizaram um protocolo de EF em esteira ergométrica de moderada intensidade ou mantidos sedentários por oito semanas e suplementadas com L-ARG. Enquanto o ganho de massa corporal (MC) relativa não foi afetada pelos EF ou L-ARG, o consumo alimentar (CA) aumentou significativamente nos grupos EXER (hipertenso treinado) e EXER-ARG (hipertenso treinado associado com suplementação de L-ARG), quando comparado ao grupo CONT (hipertenso sedentário - controle) Como esperado, os EF e a L-ARG, foram eficientes em elevar a capacidade física dos grupos EXER e EXER-ARG, com aumento extremamente significativo (p<0.001) da distância máxima alcançada na 8ª semana de EF, porém não causou alterações na massa úmida dos músculos estriados esqueléticos (MEE). Em associação, verificamos um aumento da massa úmida do coração nos grupos EXER e EXER-ARG, porém no grupo EXER-ARG observou-se uma discreta queda na PA (pressão arterial) final, ainda que não significante. Paralelamente, os dados mostraram que a L-ARG e/ou os EF não foram efetivos para a diminuição da reabsorção do osso ou a formação óssea crescente. / We investigated the effects of physical exercise (PE) aerobic and/or supplementation of L-arginine (L-ARG) on the possible changes in body composition (CC) of hypertensive rats (SHR) ovariectomized. The rats (approximately 13 weeks old) underwent surgical removal of the ovaries in order to study the effect of depletion of ovarian hormones at menopause occurring. After 30 days of ovariectomy, the rats underwent a protocol of PE treadmill of moderate intensity or kept sedentary for eight weeks and supplemented with L-ARG. While the gain in body mass (BM) was not affected by the relative PE or L-ARG, food consumption (CA) increased significantly in groups EXER (hypertensive trained) and EXER-ARG (hypertensive trained associated with supplementation of L-ARG) when compared to the CONT group (untrained - control) As expected, PE and L-ARG, were effective in increasing the physical capacity of groups EXER and EXER-ARG, with highly significant increase (p <0.001) the maximum distance reached the 8th week of PE, but caused no change in wet mass of striated skeletal muscle (ESM). In combination, we see an increase in wet weight of the heart in groups EXER and EXER-ARG, but in the group EXERARG showed a slight drop in BP (blood pressure) end, though not significant. Simultaneously, the data show that L-Arg and/or PE were not effective to decrease bone resorption or increasing bone formation.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus (DM) can be defined as a heterogeneous group of metabolic disorders characterized by hyperglycemia, resulting in dysfunction, ultimately, failure of various organs, especially the eyes, kidneys, nerves and vascular system. This study aimed to evaluate the effects of L-arginine (L-Arg), resistance exercise (RE) and the association between them on changes of endothelium-derived relaxing factor (EDRF) in isolated rings of superior mesenteric artery of diabetic rats induced by alloxan. Wistar rats (250-300g) were divided into 7 groups: Control (CON, n = 4), Electrically Stimulated (ES, n = 4), Trained Control (TC, n = 4), Sedentary Diabetic (SD, n = 5), L-arginine Diabetic (L-Arg + D, n = 5), Trained Diabetic (TD, n = 5) and L-arginine + Trained Diabetic (L-Arg + TD, n = 5). The animals diabetic groups received alloxan 2 weeks before the start of treatment protocols. The RE protocol consisted of 3 sets of 10 squats (Tamaki apparatus) with an intensity of 50% of one repetition maximum (1RM). Animals treated with L-Arg received 1.25 mg/ml daily in drinking water. At the end of 8 weeks, vessel relaxation endothelium-dependent was obtained in rings pre-contracted with L-phenylephrine (Phe, 10 mM) by addition of increasing concentrations and cumulative acetylcholine (ACh, 10-9 10-4 M). After this, concentration-response curves were constructed in control conditions or in the presence of inhibitors of nitric oxide sintetase (L-NAME), cyclo-oxygenase (INDO) and potassium channels blockers (TEA). The vessel relaxation induced by 10 ACh showed a significant reduction (p < 0.05) in the maximum response (Rmax) of SD compared with CON. Furthermore, we observed a significant reduction (p < 0.001) in sensitivity (pD2) (6.8 ± 0.12 to 6.2 ± 0.11) of L-Arg + D compared with the SD. In the presence of L-NAME the L-Arg + D showed a reduction (p < 0.001) of vessel relaxation compared to the SD. After addition of L-NAME + INDO, the LArg + TD showed a significant reduction (p < 0.001) in vessel relaxation compared with the SD. The presence of L-NAME + INDO + TEA, the TD and L-Arg + TD showed a significant reduction (p <0.001) of vessel relaxation compared with the SD. The results show that although there was no improvement in vessel relaxation induced by ACh, we observed a change in the participation of EDRF in all groups. / O diabetes mellitus (DM) pode ser definido como um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos caracterizados pela hiperglicemia, resultando em disfunção, e última instância, insuficiência de vários órgãos, especialmente dos olhos, rins, nervos e sistema vascular. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da Larginina (L-Arg), do exercício resistido (ER) e da associação entre L-Arg e o ER sobre as alterações dos fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs) em anéis isolados da artéria mesentérica superior de ratos diabéticos induzidos por aloxano. Ratos Wistar (250-300g) foram divididos em 7 grupos: Controle (CON, n = 4), Estimulado Eletricamente (EE, n = 4), Controle Treinado (CT, n = 4), Diabético Sedentário (DS, n = 5), Diabético L-arginina (DL-Arg, n = 5), Diabético Treinado (DT, n = 5) e grupo Diabético Treinado + L-arginina (DT + L-Arg, n = 5). Os animais dos grupos diabéticos receberam aloxano 2 semanas antes do início dos protocolos de tratamento. O protocolo de ER consistiu em 3 séries de 10 agachamentos (no aparelho de Tamaki) com uma intensidade de 50% de uma repetição máxima (1RM). Os animais tratados com L-Arg receberam 1,25 mg/ml diariamente na água de beber. No final de 8 semanas, o vasorrelaxamento dependente de endotélio foi obtido em anéis pré-contraídos com L-fenilefrina (FEN, 10 μM) pela adição à cuba de concentrações crescentes e cumulativas de acetilcolina (ACh, 10-9 10-4 M). Após isto, curvas concentração-respostas foram construídas na condição controle ou na presença dos inibidores da síntese do óxido nítrico (LNAME), da ciclo-oxigenase (INDO) e dos canais para potássio (TEA). Os vasorrelaxamentos induzidos por ACh apresentaram uma redução significativa (p < 0,05) na resposta máxima (Rmax) do DS comparado com o CON. Além disso, foi observado uma redução significativa (p < 0,001) da sensibilidade (pD2) (de 6,8 ± 0,12 para 6,2 ± 0,11) do DL-Arg quando comparado com o DS. Na presença do LNAME o DL-Arg apresentou uma redução (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos 8 quando comparado com o DS. Após adição de L-NAME + INDO, o DT + L-Arg apresentou uma redução significativa (p < 0,001) nos vasorrelaxamentos quando comparado com o DS. Já na presença de L-NAME + INDO + TEA, o DT e DT + LArg apresentaram uma redução significativa (p < 0,001) dos vasorrelaxamentos quando comparados com o DS. Os resultados demonstram que apesar de não haver melhora nos vasorrelaxamentos induzidos por ACh, foi observado uma modificação na participação dos EDRFs em todos os grupos.

A Araucaria angustifolia é uma conífera nativa do Brasil. Em função da sua intensa exploração florestal, a espécie ocupa apenas 2% de sua vegetação natural. Neste sistema, a aplicação de técnicas biotecnológicas, como a embriogênese somática, podem ser integradas a programas de melhoramento genético e conservação. A similaridade entre a embriogênese somática e zigótica, tem sido utilizada para o estabelecimento de estudos visando o aperfeiçoamento do cultivo in vitro dos embriões somáticos, bem como para um maior conhecimento dos aspectos moleculares e fisiológicos que regulam a embriogênese. O metabolismo de poliaminas (PAs), mais especificamente putrescina, espermidina e espermina, tem se mostrado como fundamental para a compreensão e evolução da embriogênese zigótica e somática. Entretanto, a biossíntese das PAs e seu envolvimento nos vários processos biológicos que regulam a embriogênese, são pouco conhecidas em coníferas. Inserido nessa perspectiva, o presente trabalho teve como objetivo o estudo do metabolismo de PAs durante três estádios de desenvolvimento da semente (contendo as fases da embriogênese inicial até a tardia) e na proliferação de linhagens embriogênicas com diferentes potenciais embriogênicos de A. angustifolia. Foram investigados: a) os perfis de PAs (livres e conjugadas) e aminoácidos; b) determinação da via preferencial da biossíntese de putrescina, através da atividade enzimática da arginina descarboxilase (ADC) e ornitina descarboxilase (ODC); c) identificação e caracterização do padrão de expressão dos genes envolvidos no metabolismo de PAs; e d) a identificação das relações entre os perfis de PAs e aminoácidos presentes nas sementes das matrizes, e sua potencial influência nas fases de indução, proliferação e maturação dos embriões somáticos. Durante a embriogênese zigótica, a expressão dos genes AaADC (arginina descarboxilase) e AaSAMDC (S-adenosilmetionina descarboxilase) aumentaram no estádio cotiledonar, juntamente com o aumento de PAs. A biossíntese da putrescina é realizada preferencialmente via ADC, enquanto que a citrulina foi o principal aminoácido presente nas sementes. Em relação ao metabolismo de PAs nas culturas embriogênicas, os dados obtidos demonstraram que a arginina e ornitina parecem ter diferentes funções em cada linhagem testada. Na linhagem com alto potencial embriogênico, a arginina parece estar associada com a ativação dos genes relacionados ao catabolismo de PAs (AaPAO2, AaCuAO e AaALDH), enquanto que esse efeito não foi observado na linhagem bloqueada. A ODC tem uma maior atividade na linhagem responsiva, enquanto que na linhagem bloqueada, as atividades da ADC e ODC são similares. Dependendo da matriz foram observados diferentes perfis de PAs e aminoácidos, sendo estes perfis relacionados com as taxas de indução, proliferação e desenvolvimento dos embriões somáticos. Putrescina total, ornitina e asparagina foram os metabólitos diferencialmente identificados entre as matrizes, os quais podem ser propostos como marcadores bioquímicos para a seleção de matrizes com alto potencial para a embriogênese somática. Os resultados obtidos fornecem informações relevantes e inéditas sobre o metabolismo de PAs e aminoácidos na embriogênese zigótica e somática de A. angustifolia, bem como fornece novos subsídios para o aprimoramento das condições artificiais utilizadas para o desenvolvimento dos embriões somáticos / The Araucaria angustifolia is a native conifer species of Brazil. Due to its intense exploitation, the species cover only 2% of its original forest area. In this system, biotechnological tools, like somatic embryogenesis, may be integrated into breeding and conservation programs. The similarity between zygotic and somatic embryogenesis have been used to establishment of studies in order to optimization of somatic embryos in vitro culture, as well as for a better understanding of physiologic and molecular aspects that modulates the embryogenesis. The metabolism of polyamines (PAs), specifically putrescine, spermidine and spermine, has been demonstrated as fundamental for the comprehension and evolution of zygotic and somatic embryogenesis. However, the biosynthetic pathways of PAs and their involvement in various biological process that regulate the embryogenesis are little known in conifers. Inserted in this perspective, the aim of the current work was to study the metabolism of PAs during three seeds development stages (containing the early till late embryogenesis phases) and in proliferation of cell lines with different embryogenic potential of A. angustifolia. Were investigated: a) PAs (free and conjugated) and amino acids profiles; b) determination of preferential pathway for putrescine biosynthesis, through enzymatic activity of arginine decarboxylase (ADC) and ornithine decarboxylase (ODC); c) identification and characterization of gene expression profile of genes related to metabolism of PAs; and d) identification of the relationship between PAs and amino acids profiles in seeds of mother plants, and their potential influence in initiation, proliferation and maturation phases of somatic embryos. During the zygotic embryogenesis, AaADC (arginine decarboxylase) and AaSAMDC (S-adenosylmethionine decarboxylase) genes were up-regulated at cotyledonary stage along with the increasing of PAs. The biosynthesis of putrescine is performed preferentially by ADC pathway, while citrulline was the main amino acid recorded during the seed development. Regarding the metabolism of PAs in embryogenic cultures, the data demonstrated that arginine and ornithine seem to have different functions in each cell line tested. In cell line with high embryogenic potential, arginine seems to be associated to activation of genes related to PAs catabolism (AaPAO2, AaCuAO e AaALDH), while in blocked cell line this effect was not observed. ODC has a higher enzymatic activity in responsive cell line, while in blocked cell line, both ADC and ODC activities are similar. Depending of mother plant, were observed different PAs and amino acids profiles, being these profiles related with the rate of initiation, proliferation and maturation of somatic embryos. Total putrescine, ornithine and asparagine were the differentially metabolites identified between the mother plants, which can be proposed as biochemical marker to select mother plant with high potential to somatic embryogenesis. The results obtained provide relevant and inedited information about the metabolism of PAs and amino acids in zygotic and somatic embryogenesis of A. angustifolia, as well as provide news subsidies for optimization of in vitro conditions for somatic embryos development

O presente estudo é parte do Projeto Enurese, um estudo multidisciplinar conduzido no ICr - HCFMUSP, no Departamento de Fisioterapia Fonoaudiologia e Terapia ocupacional USP e no Instituto de Psicologia USP, CAPPesq nº.0649/10 e FAPESP nº. 2011/17589-1; que teve como objetivo geral avaliar a resposta terapêutica de pacientes com enurese noturna monossintomática (ENM) de 6 a 16 anos a três diferentes modalidades de tratamento: alarme, desmopressina; tratamento combinado de DDAVP+alarme; O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar, pré e pós intervenção, os escores de problemas de comportamento, avaliados pelo questionário CBCL/6-18, e dos índices de qualidade de vida, avaliados pelo PedsQL (TM) 4.0. A coorte é composta por cinquenta e nove (59) crianças e adolescentes de 6 a 16 anos, que foram randomizados aos três grupos terapêuticos: vinte e um (21) participantes receberam o tratamento conjunto de alarme com o medicamento desmopressina (DDAVP), vinte (20) participantes receberam o tratamento apenas com o alarme e dezoito (18) receberam o tratamento apenas com desmopressina. Todos os indivíduos participaram do mesmo procedimento inicial, ou seja, triagem médica, e preenchimento dos instrumentos necessários (CBCL/6-18; PedsQL (TM) 4.0 e Termo de Consentimento Livre e Esclarecido); ao fim do tratamento, os participantes preencheram novamente o CBCL/6-18 e PedsQL(TM) 4.0, O cálculo do poder estatístico foi de (1-beta) = 0,967 com probabilidade de erro a (alfa) estabelecido em 0,05. A análise de dados foi realizada através do teste T de Student pareado, o teste de Wilcoxon e ANOVA: fator único em caso de variáveis não paramétricas. Para analisar correlações foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson por se tratarem de dados paramétricos. Os resultados demonstraram melhora da qualidade de vida e diminuição dos problemas de comportamento pós intervenção, nas três modalidades propostas, para os pacientes que responderam com sucesso às intervenções / The present study is part of the Enuresis Project, a multidisciplinary study conducted at ICr - HCFMUSP, at the Department of Physical Therapy, Speech Therapy and Occupational Therapy USP and at the Institute of Psychology USP, CAPPesq nº 0649/10 and FAPESP nº. 2011 / 17589-1;which aimed to evaluate the therapeutic response of patients with monosymptomatic nocturnal enuresis (MNE ) from 6 to 16 years to three different treatment modalities: Alarm, Desmopressin(DDAVP); combined treatment DDAVP + alarm; The present study aims to evaluate, before and after intervention, the scores of behavioral problems according to the CBCL / 6-18 questionnaire and the quality of life indices assessed by PedsQL (TM) 4.0. The cohort is composed of fifty-nine (59) children and adolescents aged 6 to 16 years, who were randomized to the three therapeutic groups: twenty-one (21) participants received the combined alarm treatment with the drug desmopressin (DDAVP), twenty (20) participants received the treatment only with the alarm and eighteen (18) were treated with desmopressin alone. All subjects participated in the same initial procedure, ie, medical screening, and filling in the necessary instruments (CBCL / 6-18, PedsQL (TM) 4.0 after Informed Consent Form signature. At the end of the treatment, participants completed again the CBCL / 6-18 and PedsQL (TM) 4.0 questionnaires. The statistical power calculation was (1-beta) = 0.967 with probability of error ? (alpha) set at 0.05. The data analysis was performed by paired Student\'s t test, the Wilcoxon test and ANOVA: single factor in case of non-parametric variables. Pearson\'s correlation coefficient was used to analyze correlations as they were parametric data. The results showed an improvement in the quality of life and a reduction in post-intervention behavior problems in the three proposed therapeutic modalities , for the patients who responded successfully to the interventions

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

Introdução: Arginina e antioxidantes estão associados à melhora funcional de cicatrização. Formulação enteral suplementada com arginina e antioxidantes tem sido proposta para corrigir déficit nutricional e garantir substratos ideais para uma boa cicatrização. Ainda não existem informações disponíveis sobre os possíveis mecanismos envolvidos. Objetivo: Avaliar o efeito da nutrição enteral suplementada com arginina e antioxidantes sobre o processo de cicatrização de feridas cutâneas em ratos nutridos e previamente desnutridos, em termos de avaliação morfo-estrutural, bioquímica e biologia molecular. Método: Ratos isogênicos, machos, adultos com peso entre 250 a 350 g, foram divididos aleatoriamente em seis grupos. Três grupos foram mantidos nutridos com alimentação com dieta padrão AIN-93M e três grupos foram submetidos ao regime de desnutrição por 14 dias, com perda de peso corpóreo entre 12 e 15% em relação ao peso corpóreo inicial. Após esse período, os grupos de ratos nutridos e os previamente desnutridos, foram submetidos à lesão cutânea dorsal padronizada e gastrostomia. A seguir, os ratos receberam aleatoriamente dieta por via oral, dieta enteral padrão ou dieta enteral suplementada com arginina e antioxidantes por via gastrostomia, durante 14 dias pós-trauma (PT). A área da lesão cutânea no dia do trauma, no 7º e 14º dias PT foram medidas por fotografia digital. No 7º e 14º dias PT, em tecido de granulação cicatricial, por meio de análise histológica, foram avaliadas as variáveis reepitelização, infiltrado inflamatório, recomposição da derme, quantificação do colágeno total e miofibroblastos (imunoistoquímica). Amostras do tecido de granulação, retiradas no 7º dia PT, foram submetidas à análise de expressão gênica de fatores de crescimento (TGF-beta, KGF, PDGF, VEGF) e colágenos (tipo I e III). Resultados: Ratos nutridos apresentaram maior fechamento da lesão cutânea quando comparados aos previamente desnutridos, no 7º e 14º dias PT, independente dos diferentes tipos de dieta administrados por via gastrostomia. No 14º dia PT, ratos nutridos apresentaram maior reepitelização, intensidade de infiltrado inflamatório e recomposição da derme, quando comparados aos ratos previamente desnutridos, independente da oferta de dieta por via oral, dieta enteral padrão e suplementada. Ratos nutridos e previamente desnutridos, no 7º e 14º dias PT, não apresentaram diferença na quantidade de colágeno total e miofibroblastos, independente do tipo de dieta enteral administrada por via gastrostomia. No 7º dia PT, ratos nutridos apresentaram aumento na expressão gênica dos fatores de crescimento TGF-beta e KGF e colágenos I e III, quando comparados aos ratos previamente desnutridos, independente da dieta enteral administrada por via gastrostomia. Conclusões: 1 - Com estado nutricional mantido, a cicatrização ocorre de maneira adequada, independente da dieta oral, enteral padrão ou suplementada. 2- A desnutrição retarda a cicatrização em termos de epitelização, recomposição da derme e contração da ferida cutânea, independente da realimentação com dieta oral, enteral padrão ou suplementada. 3- Após uma semana de trauma cutâneo, a expressão gênica de fatores de crescimento ligados à cicatrização apresentaram-se alterados em virtude da desnutrição prévia, e não foram revertidos independentemente da realimentação com dieta oral, enteral padrão ou suplementada. 4- Após uma semana de trauma cutâneo, a expressão gênica dos colágenos tipo I e III ligados à cicatrização apresentaram-se alterados em virtude da desnutrição prévia, e não foram revertidos independentemente da realimentação com dieta oral, enteral padrão ou suplementada / Introduction: Arginine and antioxidants are associated with functional enhancement of healing. Arginine and antioxidants supplemented enteral formulas have been used to revert nutritional deficits and to guarantee substrates to ideal healing. The possible mechanisms involved have not been totally elucidated. Objective: To examine the effect of enteral nutrition supplemented with arginine and antioxidants on cutaneous wound healing process in nourished and previously malnourished rats in morphological structural, biochemical and molecular analyses. Methods: Isogenic rats, male, adults, weighting 250 to 350 g, were divided in six groups. Three groups were maintained nourished with oral diet AIN-93 and three groups were submitted to malnutrition process for 14 days, with 12 to 15% of body weight loss. Nourished and previously malnourished groups were submitted to dorsal cutaneous wound and gastrostomy. The rats received oral diet, standard enteral diet or enteral diet supplemented with arginine and antioxidants through gastrostomy during 14 days post trauma (PT). The cutaneous wound area on day of trauma, 7th and 14th days post-trauma were calculated. At 7th and 14th day, histological variables (re-epithelization, inflammatory infiltrate, dermal recomposition and total collagen quantification) and myofibroblasts were analyzed at granulation tissue. Growth factors (TGF-beta, KGF, PDGF and VEGF) and collagens (type I and III) gene expression analyses were performed at samples from the granulation tissue. Results: Nourished rats showed higher contraction of cutaneous wound when compared with previously malnourished rats, on 7th and 14th days post trauma (PT) independent of different enteral diet administered through gastrostomy. On 14th day PT, nourished rats showed higher re-epithelization, inflammatory infiltrate intensity and dermal recomposition when compared to previously malnourished rats, independent of physiologic solution, standard enteral diet and supplemented enteral diet with arginine and antioxidants. Total collagen quantification and myofibroblasts semi-quantification, did not show any significant difference, independent of the enteral diet type, administered through gastrostomy in nourished and previously malnourished rats, at 7th and 14th days PT. Nourished rats showed higher levels of TGF-beta, KGF, collagen type I and III gene expression when compared to previously malnourished rats, independent of the enteral diet type administered through gastrostomy at the 7th day PT. Conclusions: 1- Adequate healing process occurs with the maintenance of nutritional status, independent of the feeding of a oral diet, standard enteral diet or supplemented enteral diet with arginine and antioxidants, 2- Previous malnutrition state slower re-epithelization, dermal recomposition and contraction, independent of refeeding with oral diet, standard enteral diet or supplemented enteral diet with arginine and antioxidants refeeding. 3- Previous malnutrition reduce the levels of growth factors gene expression involved on wound healing, independent of refeeding with oral diet, standard enteral diet or supplemented enteral diet with arginine and antioxidants after seven days post-trauma. 4- Previous malnutrition reduce the levels of collagens type I and III gene expression involved on wound healing, independent of refeeding with oral diet, standard enteral diet or supplemented enteral diet with arginine and antioxidants after seven days post-trauma

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

O presente estudo é parte do Projeto Enurese, um estudo multidisciplinar conduzido no ICr - HCFMUSP, no Departamento de Fisioterapia Fonoaudiologia e Terapia ocupacional USP e no Instituto de Psicologia USP, CAPPesq nº.0649/10 e FAPESP nº. 2011/17589-1; que teve como objetivo geral avaliar a resposta terapêutica de pacientes com enurese noturna monossintomática (ENM) de 6 a 16 anos a três diferentes modalidades de tratamento: alarme, desmopressina; tratamento combinado de DDAVP+alarme; O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar, pré e pós intervenção, os escores de problemas de comportamento, avaliados pelo questionário CBCL/6-18, e dos índices de qualidade de vida, avaliados pelo PedsQL (TM) 4.0. A coorte é composta por cinquenta e nove (59) crianças e adolescentes de 6 a 16 anos, que foram randomizados aos três grupos terapêuticos: vinte e um (21) participantes receberam o tratamento conjunto de alarme com o medicamento desmopressina (DDAVP), vinte (20) participantes receberam o tratamento apenas com o alarme e dezoito (18) receberam o tratamento apenas com desmopressina. Todos os indivíduos participaram do mesmo procedimento inicial, ou seja, triagem médica, e preenchimento dos instrumentos necessários (CBCL/6-18; PedsQL (TM) 4.0 e Termo de Consentimento Livre e Esclarecido); ao fim do tratamento, os participantes preencheram novamente o CBCL/6-18 e PedsQL(TM) 4.0, O cálculo do poder estatístico foi de (1-beta) = 0,967 com probabilidade de erro a (alfa) estabelecido em 0,05. A análise de dados foi realizada através do teste T de Student pareado, o teste de Wilcoxon e ANOVA: fator único em caso de variáveis não paramétricas. Para analisar correlações foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson por se tratarem de dados paramétricos. Os resultados demonstraram melhora da qualidade de vida e diminuição dos problemas de comportamento pós intervenção, nas três modalidades propostas, para os pacientes que responderam com sucesso às intervenções / The present study is part of the Enuresis Project, a multidisciplinary study conducted at ICr - HCFMUSP, at the Department of Physical Therapy, Speech Therapy and Occupational Therapy USP and at the Institute of Psychology USP, CAPPesq nº 0649/10 and FAPESP nº. 2011 / 17589-1;which aimed to evaluate the therapeutic response of patients with monosymptomatic nocturnal enuresis (MNE ) from 6 to 16 years to three different treatment modalities: Alarm, Desmopressin(DDAVP); combined treatment DDAVP + alarm; The present study aims to evaluate, before and after intervention, the scores of behavioral problems according to the CBCL / 6-18 questionnaire and the quality of life indices assessed by PedsQL (TM) 4.0. The cohort is composed of fifty-nine (59) children and adolescents aged 6 to 16 years, who were randomized to the three therapeutic groups: twenty-one (21) participants received the combined alarm treatment with the drug desmopressin (DDAVP), twenty (20) participants received the treatment only with the alarm and eighteen (18) were treated with desmopressin alone. All subjects participated in the same initial procedure, ie, medical screening, and filling in the necessary instruments (CBCL / 6-18, PedsQL (TM) 4.0 after Informed Consent Form signature. At the end of the treatment, participants completed again the CBCL / 6-18 and PedsQL (TM) 4.0 questionnaires. The statistical power calculation was (1-beta) = 0.967 with probability of error ? (alpha) set at 0.05. The data analysis was performed by paired Student\'s t test, the Wilcoxon test and ANOVA: single factor in case of non-parametric variables. Pearson\'s correlation coefficient was used to analyze correlations as they were parametric data. The results showed an improvement in the quality of life and a reduction in post-intervention behavior problems in the three proposed therapeutic modalities , for the patients who responded successfully to the interventions

A Arginina (Arg) regula a secreção de GH e insulina, e é o único precursor biológico do NO. Previamente demonstramos que animais tratados cronicamente com Arg (35mg/dia) desenvolvem resistência à insulina (RI), e o presente estudo investigou as suas bases moleculares. A RI baseou-se na redução da atividade e/ou expressão do IRS 1/2 e Akt, e do conteúdo de GLUT4; sendo o GH crucial na gênese desses efeitos. Doses mais elevadas de Arg (70mg/dia/30 dias), a maior geração de NO e a melhora do fluxo sangüíneo reverteram este quadro. Experimentos com células musculares demonstraram que a Arg estimula o metabolismo de glicose e lipídios, via NO/c-GMP. Esses achados indicam que a Arg pode ser benéfica para o tratamento de distúrbios metabólicos, como obesidade e DM2; e que ao estimular a secreção de GH, em doses adequadas, seria eficaz na terapia de distúrbios da secreção deste hormônio. Todavia, estudos adicionais são necessários para investigar a melhor dose e os efeitos crônicos in vivo da Arg, uma vez que o GH em excesso apresenta um efeito diabetogênico importante. / Arginine (Arg) regulates the secretion of GH and insulin, and it is the main biological precursor of NO. We have previously shown that animals chronically-treated with Arg (35 mg/day) developed insulin resistance (IR), and this study investigated its molecular basis. The RI relies on the reduction of the activity and/or expression of IRS 1/2 and Akt, and of the GLUT4 content; and GH has a crucial role in the genesis of these effects. Higher doses of Arg (70 mg/dia/30 days), the increased NO generation and the improvement of the blood flow reversed the RI. Experiments with muscle cells showed that Arg stimulates glucose and lipids metabolism, via NO/c-GMP activation. These findings indicate that Arg may be beneficial for the treatment of metabolic disorders, such as obesity and T2DM, and by stimulating GH secretion, Arg can, in appropriate doses, be effective for the therapy of GH secretion disorders. However, further studies are needed to investigate the best dose and the chronic effects of Arg in vivo, since that GH in excess is potentially diabetogenic.