Os astrócitos são células conhecidas por sua capacidade dinâmica e versatilidade, participando não somente da manutenção da homeostase cerebral em condições fisiológicas, mas também respondendo em condições patológicas, como por exemplo, na encefalopatia hepática (EH). Esta patologia neurológica está associada principalmente à hiperamonemia, decorrente de uma falência hepática aguda ou crônica. A toxicidade da amônia no sistema nervoso central (SNC) é mediada por uma série de alterações celulares e metabólicas, principalmente nas células astrogliais. Nesse sentido, a busca por moléculas com potencial terapêutico no SNC é extremamente relevante. Trabalhos do nosso grupo mostraram que o resveratrol e o ácido lipoico, duas moléculas conhecidas pelos seus efeitos antioxidantes, modulam importantes funções gliais, relacionadas principalmente ao metabolismo glutamatérgico, à defesa antioxidante e à resposta inflamatória. Neste sentido, esta tese teve como objetivo avaliar os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico em células astrogliais e neuronais expostas à amônia, assim como seus possíveis mecanismos protetores. Primeiramente, nós observamos que o resveratrol e o ácido lipoico foram capazes de prevenir as alterações induzidas pela amônia em células astrogliais C6, sobre parâmetros do metabolismo glutamatérgico, dentre os quais podemos destacar a captação de glutamato, a atividade da enzima glutamina sintetase (GS) e o conteúdo de glutationa (GSH). Além disso, o ácido lipoico também exerceu um efeito antiinflamatório nestas células, prevenindo a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IL- 1β, IL-6, IL-18) e da proteína S100B, através da diminuição da ativação do fator de transcrição NFκB. Nós também verificamos que a maioria dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico foram dependentes da heme oxigenase 1 (HO1), uma enzima associada com a defesa celular em situações de estresse. Por fim, foram avaliados os efeitos do resveratrol e do ácido lipoico sobre células neuronais expostas à amônia. Novamente, ambos apresentaram um efeito benéfico, prevenindo tanto o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) quanto a diminuição do conteúdo de GSH induzidos pela amônia. Nas células neuronais, a proteína HO1 também participou dos efeitos protetores do resveratrol e do ácido lipoico. Em conjunto, esses resultados nos mostram que o resveratrol e o ácido lipoico são capazes de modular positivamente o funcionamento tanto de células astrogliais quanto de células neuronais em situações de hiperamonemia, compartilhando também alguns mecanismos de ação, como a indução da HO1. Este estudo in vitro sugere que o resveratrol e o ácido lipoico são potenciais agentes terapêuticos para doenças do SNC, as quais envolvam produção de espécies reativas e resposta inflamatória, como a EH. / Astrocytes are dynamic and versatile cells which participate in the maintenance of brain homeostasis in physiological conditions and also in response to pathological conditions, such as hepatic encephalopathy. This neurological disease is mainly associated with hyperamonnemia, resulting from acute or chronic liver failure. Ammonia toxicity in the central nervous system (CNS) is mediated by several cellular and metabolic alterations, primarily in astroglial cells. In this sense, the search for molecules with therapeutical potential for CNS becomes highly relevant. Our group has shown that resveratrol and lipoic acid, two molecules known for their antioxidant activities, are able to modulate important glial functions mainly related to glutamate metabolism, antioxidant defense and inflammatory response. In this sense, this study aimed to evaluate the effects of resveratrol and lipoic acid in astroglial and neuronal cells exposed to ammonia, as well as their possible protective mechanisms. Firstly, we observed that resveratrol and lipoic acid were able to prevent ammonia-induced alterations in C6 astroglial cells functioning, such as glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and intracellular GSH content. Moreover, lipoic acid also exerted an anti-inflammatory effect in C6 astroglial cells, preventing the ammonia-stimulated release of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1β, IL-6, IL-18) and S100B protein, by decreasing the activation of the transcription factor NFκB. We also verified that the most protective effects of resveratrol and lipoic acid involved the heme oxygenase 1 (HO1), an enzyme associated with protection against stressful conditions. Finally, we evaluated the effects of resveratrol and lipoic acid on neuronal cells exposed to ammonia. Again, both showed beneficial roles, preventing the increase of reactive oxygen species (ROS) and decrease of GSH content induced by ammonia. In neuronal cells, HO1 also mediated the protective effects of resveratrol and lipoic acid. Taken together, these results show that resveratrol and lipoic acid are able to positively modulate the functioning of both astroglial and neuronal cells in hyperamonemmia conditions, sharing some mechanisms of action, such as HO1. This study in vitro suggests that resveratrol and lipoic acid may represent potential therapeutic agents for CNS, during oxidative and inflammatory damages, as the induced by ammonia.

As respostas inflamatórias no cérebro são mediadas principalmente pela microglia, mas evidências crescentes sugerem uma importância crucial dos astrócitos. A S100B, uma proteína ligante de cálcio e secretada por astrócitos, tem propriedades neurotróficas e de citocina inflamatória. No entanto, não se sabe se sinais primários que ocorrem durante a indução de uma resposta inflamatória como, por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) modulam diretamente a S100B. A neuroinflamação está implicada na patogênese ou na progressão de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos e muitos estudos procuram uma conexão entre S100B e doenças degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e esquizofrenia. O uso terapêutico de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) para estas doenças tem aumentado. No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito desses fármacos em relação à proteína S100B. Neste trabalho, nós avaliamos se os níveis de S100B no líquido cefalorraquidiano (LCR) e soro de ratos Wistar são afetados por injeção de LPS administrado por via intraperitoneal (IP) ou intracerebroventricular (ICV), bem como se as culturas primárias de astrócitos respondem diretamente ao LPS. Além disso, nós avaliamos o conteúdo e a secreção de S100B medido por ELISA (bem como o conteúdo de GFAP e secreção de TNF-α) em culturas primárias de astrócitos expostos a dexametasona e quatro classes químicas diferentes de AINEs (ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenaco e nimesulida) durante 24 h. Os nossos dados sugerem que a secreção de S100B no tecido cerebral é estimulada rapidamente e persistentemente (durante pelo menos 24 h) por administração ICV de LPS. Este aumento da S100B no LCR foi transitório quando o LPS foi administrado IP. Em contraste com estes resultados de S100B, observou-se um aumento nos níveis de TNF-α no soro, mas não no LCR, após a administração IP de LPS. Em astrócitos isolados e em fatias de hipocampo frescas, observou-se uma estimulação direta da secreção de S100B por LPS numa concentração de 10 ug/ml. Um envolvimento de TLR4 foi confirmado pelo uso de antagonistas específicos deste receptor. No entanto, baixas concentrações de LPS em culturas de astrócitos foram capazes de induzir uma diminuição na secreção de S100B após 24 h, sem alteração significativa no conteúdo intracelular de S100B. Além disso, após 24 horas de exposição ao LPS, observou-se um decréscimo na glutationa e um aumento na proteína ácida fibrilar glial. Também foi observado que os AINEs apresentam diferentes efeitos sobre parâmetros gliais. O ácido acetilsalicílico e o diclofenaco foram capazes de aumentar a GFAP, enquanto que a nimesulida, um inibidor seletivo de COX-2, e a dexametasona diminuiram a secreção de S100B. No entanto, todos os AINEs reduziram os níveis de PGE2. Juntos, esses dados contribuem para a compreensão dos efeitos de LPS em astrócitos, especialmente sobre a secreção de S100B, e nos ajuda a interpretar mudanças nesta proteína no LCR e soro em doenças neuroinflamatórias. Além disso, tecidos periféricos que expressam S100B talvez devam ser regulados diferentemente, uma vez que a administração IP de LPS não foi capaz de aumentar os níveis séricos de S100B. Em relação aos AINEs, a PGE2 parece estar envolvida no mecanismo de secreção de S100B, mas vias adicionais, não claras neste momento, necessitam de uma maior caracterização. O papel inflamatório de S100B em doenças degenerativas, onde também são observados níveis elevados da COX-2 e PGE2, poderia ser atenuado por inibidores de COX-2. / Inflammatory responses in brain are primarily mediated by microglia, but growing evidence suggests a crucial importance of astrocytes. S100B, a calciumbinding protein secreted by astrocytes, may act as a neurotrophic or an inflammatory cytokine. However, it is not known whether primary signals occurring during induction of an inflammatory response (e.g. lipopolysaccharide, LPS) directly modulate S100B. Neuroinflammation has been implicated in the pathogenesis or progression of a variety of neurodegenerative disorders and several studies have looked for a connection of S100B, and degenerative diseases including Alzheimer’s disease and schizophrenia. The therapeutic use of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAID) to these diseases has growth up. However, there are few reports about the effect of these drugs on S100B. In this work, we evaluated whether S100B levels in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of Wistar rats are affected by LPS administered by intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) injection, as well as whether primary astrocyte cultures respond directly to lipopolysaccharide. Moreover we evaluated S100B content and secretion measured by ELISA (as well as GFAP content and TNF-α secretion) in primary astrocyte cultures exposed to dexamethasone and 4 different chemical classes of NSAID (acetyl salicylic acid, ibuprofen, diclofenac and nimesulide) for 24 h. Our data suggest that S100B secretion in brain tissue is stimulated rapidly and persistently (for at least 24 h) by ICV LPS administration. This increase in CSF S100B was transient when LPS was IP administered. In contrast to these S100B results, we observed an increase in in TNFα levels in serum, but not in CSF, after IP administration of LPS. In isolated astrocytes and in acute hippocampal slices, we observed a direct stimulation of S100B secretion by LPS at a concentration of 10 μg/mL. An involvement of TLR4 was confirmed by use of specific inhibitors. However, lower levels of LPS in astrocyte cultures were able to induce a decrease in S100B secretion after 24 h, without significant change in intracellular content of S100B. In addition, after 24 h exposure to LPS, we observed a decrease in astrocytic glutathione and an increase in astrocytic glial fibrillary acidic protein. We also observe that NSAIDs have distinct effects on glial parameters. ASA and diclofenac are able to increase GFAP, while nimesulide, a selective COX-2 inhibitor, and dexamethasone were able to decrease S100B secretion. However, all anti-inflammatories were able to reduce levels of PGE2. Together, these data contribute to the understanding of the effects of LPS on astrocytes, particularly on S100B secretion, and help us to interpret cerebrospinal fluid and serum changes for this protein in neuroinflammatory diseases. Moreover, non-brain S100B-expressing tissues may be differentially regulated, since LPS administration did not lead to increased serum levels of S100. With respect to NSAIDs, PGE2 is possibly involved in the mechanism of S100B secretion but additional pathways, unclear at this moment, demand further characterization. The inflammatory role of S100B in degenerative diseases, where also is observed elevated levels of COX-2 and PGE2, could be attenuated by COX-2 inhibitors in which elevated levels of COX-2.

Agressões nos períodos críticos do crescimento do sistema nervoso podem modificar os eventos de desenvolvimento. Entre os vários fatores nocivos está a anóxia. O organismo do neonato tem suprimento de energia anaeróbica relativamente rica, foi observado que a acidose ocorre com menor facilidade, propiciam sobrevivência. A proteína de astrócitos, S100<font face=\"Symbol\">b, exerce efeitos parácrinos e autócrinos em neurônios e glia. Sua estimulação promove sobrevivência e proteção neuronal, atuando como fator trófico e neurotrófico. Modelo animal de anóxia neonatal desenvolvido em nosso laboratório, nos revelou ativação neural pela expressão de Fos e alterações comportamentais, o que nos instigou a explorar os efeitos da anóxia nas células da glia no Hipocampo e Núcleo do Trato Solitário. Para sua exposição à anoxia, durante 25 minutos, foi utilizada câmara, saturada com nitrogênio gasoso 100%. Grupos P2 e P7 nas condições: Basal (B), sem estimulo; Sham (S) como controle experimental e Anóxia (A) com falta de oxigênio, foram analisados por S100<font face=\"Symbol\">b-IR com técnicas ABC/DAB e Western blot. Observamos significante diferença de S100<font face=\"Symbol\">b-IR no núcleo do trato solitário, somente no grupo P2 A 2 h em relação ao grupo P2 S 2 h. A reatividade glial de S100<font face=\"Symbol\">b na formação hipocampal (CA1, CA3+CA2 e DG), apresentou diferença significante no grupo anoxia de acordo com o estágio de maturação do animal. A técnica por Western blot em toda a formação hipocampal, apresentou aumento de S100<font face=\"Symbol\">b no grupo A em ambos P2 e P7, a avaliação de um todo foi diferente daquela de áreas especificas. / Attacks to the nervous system at critical growth periods can modify developmental events. Among the various harmful factors at is anoxia. The high anaerobic energy supply to the newborn and a less easily acidosis occurrence provides survival. The astrocyte S100<font face=\"Symbol\">b protein exerts paracrine and autocrine effects on neurons and glia. Its stimulation promotes neuronal survival and protection, as a trophic and neurotrophic factor. An animal model of neonatal anoxia improved in our lab revealed neural activation by Fos expression and behavioral changes, which prompted us to explore the anoxia effects on glial cells in the Hypocampus and Nucleus of Solitary Tract. For their exposure to anoxia, a chamber, saturated with 100% nitrogen gas, for 25 minutes were used. Groups with P2 and P7, conditions: Baseline, without stimulation; Sham as the experimental control, and Anoxia with lack of oxygen, were evaluated by S100<font face=\"Symbol\">b-IR by ABC/DAB and Western blot techniques. The nucleus of solitary tract, significant different S100<font face=\"Symbol\">b-IR observed, only in the P2 A 2 h compared to P2 S 2 h. The glial S100<font face=\"Symbol\">b-IR at the hippocampal formation (CA1, CA2 + CA3 and DG) presented significant difference in the anoxic group according to the maturational stage of the animal. Western blot technique of the entire hippocampal formation, showed increase of S100<font face=\"Symbol\">b at the group A at both P2 and P7, the whole evaluation was different from of that of specific areas.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa de caráter progressivo caracterizada pela morte seletiva de neurônios motores que leva rapidamente os pacientes à morte. O camundongo transgênico que expressa a superóxido dismutase 1 humana mutante é o modelo experimental mais aceito para o estudo da doença. Os mecanismos que levam a perda neuronal ainda são pouco conhecidos e não existe tratamento eficaz para prolongar a vida do indivíduo. Estudos recentes indicam que as células gliais aceleram o processo neurodegenerativo, entretanto os mecanismos moleculares ainda não estão estabelecidos. Os astrócitos merecem uma atenção particular, pois apresentam íntima interação com os neurônios, fornecendo suporte estrutural, metabólico e trófico. Além disso, participam ativamente da modulação excitatória neuronal e da neurotransmissão, controlando os níveis extracelulares de íons e neurotransmissores. O presente estudo propôs investigar in vitro os possíveis dos astrócitos extraídos da medula espinal do camundongo de idade neonatal (P1) e adulta pré-sintomática (P60) sobre a morte de neurônios motores na ELA. Para isso, o trofismo e sobrevida do neurônio motor espinal foram avaliados nas culturas de neurônios motores tratados com meio condicionado de astrócitos e também em sistemas de co-culturas neurônios motores/astrócitos, de origem SOD1G93A (transgênica) e selvagem (wild type) em diferentes combinações. Investigou-se ainda, a expressão gênica de genes nos astrócitos nas culturas P1 e P60 realizadas através do PCR quantitativo (qPCR) e a quantificação de moléculas secretadas pelos astrócitos por ELISA Sanduíche. Para o estudo do trofismo e degeneração neuronal, as células foram marcadas com marcadores específicos de morte neuronal e o trofismo dos neurônios também foi quantificado por contraste de fase. As células foram quantificadas por métodos estereológicos específicos e as análises mostraram que o tratamento com meio condicionado de astrócitos transgênicos P1 e P60 causaram respectivamente retrações nos prolongamentos e morte dos neurônios transgênicos. As análises da morte neuronal dos meios condicionados e co-cultura mostraram que os astrócitos transgênicos de ambas as idades causaram a morte de neurônios wild type e apenas os astrócitos transgênicos P60 levaram os maiores perfis de morte nos neurônios transgênicos, demonstrando a toxidade dessas células. Quanto à análise da expressão gênica, os genes NKRF, UBE2I e TGFA mostraram-se diferencialmente expressos nos astrócitos transgênicos P1 e os genes HIPK3, TGFA e NTF5 diferencialmente expressos nos astrócitos transgênicos P60. Nas análises das moléculas secretadas nos meios condicionados maior quantidade de NGF foi encontrada no meio dos astrócitos transgênicos P60 comparando-se aos astrócitos wild type. A quantidade de IGF-I diminuiu no meio condicionado da cultura de astrócitos transgênicos P60 comparando-se aos astrócitos wild type E ainda, há a diminuição autócrina de TNF-? e IL-6 nos astrócitos transgênicos P60. Os astrócitos transgênicos parecem promover a toxicidade ao neurônio motor na ELA e moléculas liberadas pelos astrócitos parecem estar envolvidas no processo de desenvolvimento da ELA / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterized by selective motor neurons death that readly leads patients to death. Transgenic mice expressing human mutant superoxide dismutase 1 (hSOD1) is the most accepted experimental model for the disease studying. The mechanisms that lead to neuronal loss are still poorly understood and there is no effective treatment able to prolong the pacient\'s life. Recent studies indicate that glial cells accelerate the neurodegenerative process, but the molecular mechanisms are not yet established. Astrocytes deserve particular attention, since they have close interaction with neurons, providing structural, metabolic and trophic support. In addition, they also participate actively in the neuronal excitatory modulation and in neuronal transmission, controlling ions and neurotransmitters at extracellular levels. The present study aimed to investigate the possible in vitro effects in astrocytes on the motor neurons death in ALS from newborn (P1) and adult pre symptomatic (P60) spinal cord mice. Thus, we evaluated spinal motor neuron survival and trophism in cultures treated with astrocytes conditioned medium and also in co-culture neuron/astrocyte systems of SOD1G93A (transgenic) and wild type in different cells combinations. Still, we investigated genes expression related to P1 and P60 astrocytes cultures performed by quantitative PCR (qPCR) and the molecules secreted by astrocytes were quantified by Sandwich ELISA. For the neuronal degeneration and trophism study, cells were immunostained with specific markers and neurouns were also visualized by phase contrast. These cells were quantified by stereological method and their analysis showed that treatment with transgenic P1 and P60 astrocytes conditioned medium cause length retractions and death on transgenic motor neuron. But, the neuronal death on conditioned medium and co-cultures experiments showed that transgenic P1 and P60 astrocytes caused wild type neuronal death and only transgenic P60 astrocytes led transgenic neurons death, demonstrating major toxicity of transgenic astrocytes. For the gene expression analysis NKRF, UBE2I and TGFa genes showed differentially expressed in transgenic P1 astrocytes and HIPK3, TGFa and NTF5 genes showed differentially expressed in transgenic P60 astrocytes. The analizes of molecules secreted by conditioned media a larger amount of NGF was found in transgenic P60 astrocytes comparing to wild type astrocytes. The amount of IGF-I in the conditioned medium was reduced in astrocytes transgenic P60 cultures compared to the wild type astrocytes Also, there is a reduction autocrine of TNF-? and IL-6 on transgenic astrocytes P60. The transgenic astrocytes seem to promote motor neuron toxicity in ALS and molecules released by astrocytes appear to be involved in the ALS development

O desenvolvimento humano pode ser influenciado pelo ambiente. Estímulos recebidos ao longo da vida determinam seu progresso e sucesso. Estímulos positivos levam ao desenvolvimento de habilidades, melhorando funções cognitivas e da memória, enquanto estímulos negativos podem predispor a patologias como o estresse. Eventos estressantes durante a infância aumentam a predisposição para o desenvolvimento de transtornos psiquiátricos ao longo da vida. A separação materna, modelo animal de estresse pós-natal, promove diversas alterações comportamentais e encefálicas. Animais submetidos à separação materna apresentam comportamentos que mimetizam doenças psiquiátricas humanas. Por outro lado, diversos trabalhos sugerem que o enriquecimento ambiental pode ter efeito benéfico na reversão ou atenuação de modificações comportamentais e encefálicas promovidas por modelos animais de depressão, esquizofrenia, ansiedade e hiperatividade. Esses aspectos motivaram-nos a estudar se as alterações causadas por estresse podem ser revertidas ou atenuadas pelo enriquecimento do ambiente. Há evidências que sugerem um importante envolvimento de células gliais e de transportadores de glutamato presentes nessas células em modelos animais de transtornos psiquiátricos. Sendo assim, investigamos a expressão de mRNA e proteínas de dois transportadores de glutamato gliais e um neuronal, do receptor de glutamato AMPA, de marcadores gliais GFAP, S100?, glutamina sintase (GS) e do marcador de neurônios maduros NeuN na camada molecular e granular do giro denteado do hipocampo de ratos de 60 dias. Observamos que a separação materna diminui a expressão das proteínas GLAST, GLT-1, GS e NeuN, reduz a expressão dos genes Gria1 (AMPA) e S100?, e aumenta a expressão da proteína EAAC1 no giro denteado. Nossos dados sugerem uma reversão das alterações causadas pela separação materna em relação ao gene Gria1/AMPA e às proteínas GLAST, GLT-1 e EAAC1 após o enriquecimento ambiental. Portanto, o enriquecimento ambiental pode reverter as modificações causadas pela separação materna nas vias glutamatérgicas. Esses efeitos benéficos podem ser investigados para auxiliar no tratamento de transtornos psiquiátricos relacionados à separação materna. / Human development can be influenced by the environment. Stimuli received throughout life determine its progress and success. Positive stimuli lead to development of skills, improving cognitive and memory functions, while negative stimuli may predispose to pathologies such as stress. Stressful events during childhood increase the predisposition to psychiatric disorders throughout life. Maternal separation, an animal model of postnatal stress, promotes several behavioral and encephalic changes. Animals submitted to maternal separation stage behaviors associated with psychiatric diseases in humans. On the other hand, some researches have suggested that environmental enrichment may have some beneficial effects on the reversal or attenuation of behavioral and encephalic modifications promoted by animal models of depression, schizophrenia, anxiety and hyperactivity, which motivates us to study if these changes, stirred by this kind of stress, can be reversed or mitigated by environmental enrichment. There are evidences suggesting the involvement of glial cells and glutamate transporters existent in these cells in psychiatric disorders and animal models of these disorders. Therefore, we investigated mRNA and protein expression of two glial and one neuronal glutamate transporters, AMPA glutamate receptor, glial markers GFAP, S100?, glutamine synthase (GS), and the NeuN neuronal marker in the molecular and granular layer of the hippocampal gyrus in sixty-days-old rats. We observed that maternal separation decreases expression of GLAST, GLT-1, GS and NeuN proteins, reduces Gria1 (AMPA) and S100? gene expression, and increases EAAC1 protein expression in the dentate gyrus. After environmental enrichment, our data suggests a reversal of the maternal separation changes in the Gria1/AMPA gene and the GLAST, GLT-1 and EAAC1 proteins. Therefore, environmental enrichment may reverse the maternal separation changes in the glutamatergic pathways. These beneficial effects may be investigated to aid in the treatment of psychiatric disorders related to maternal separation.

Orientador: Cláudio Aparecido Casatti / Resumo: As teneurinas (Tens) são proteínas transmembrana do tipo II, constituídas de quatro membros homólogos (Ten-1-4). Estas proteínas são expressas principalmente durante a neurogênese do sistema nervoso central (SNC) e estão envolvidas primariamente no estabelecimento dos circuitos neuronais. Tens apresentam vários sítios de clivagens intracelular e extracelular que resultam em peptídeos bioativos, destacando-se os peptídeos associados aos terminais carboxila das teneurinas (Teneurin C-terminal-Associated Peptides, TCAPs). As latrofilinas (LPHN1-3) representam receptores associados à proteína G, sendo os principais receptores endógenos das Tens. A interação da Ten-2 com a LPHN-1 resulta na modulação nos níveis de cálcio intracelular, fato este que pode estar desbalanceado durante episódios epileptogênicos. O principal propósito deste estudo foi verificar possíveis alterações na imunorreatividade e na expressão gênica da Ten-2 no SNC em um modelo de epilepsia induzida por cloreto de lítio-cloridrato de pilocarpina em ratos adultos. Adicionalmente, as expressões gênicas do TCAP-2 e LPHN1 também foram analisadas, visto que são as principais proteínas correlacionadas à Ten-2. Para isto, ratos adultos (Rattus norvegicus; n=49) foram submetidos a indução de status epilepticus (SE) com cloreto de lítio (127 mg/kg) e cloridrato de pilocarpina (40 mg/kg) e divididos em grupos controles, grupos 2, 5 e 14 dias após SE e grupos epilepsia crônica (35 e 75 dias). Amostras do SNC destes animais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Teneurins (Tens) are a type II transmembrane protein family composed of four homologous members (Ten-1-4). These proteins are primarily present in the central nervous system (CNS) during neurogenesis and exert an important role in the development and establishment of neuronal circuits. Tens have several intra- and extracellular cleavage sites, originating bioactive peptides, such as the carboxyl-terminal peptides named Teneurin C-terminal-Associated Peptides (TCAPs). Latrophilins (LPHN1-3) represent G protein-coupled receptors and are considered the main endogenous receptors for Tens. The Ten-2-LPHN-1interaction results in intracellular calcium modulation in neurons and this system can be changed during epilepsy induction. The main purpose of this study was to verify possible alterations in immunoreactivity and gene expression of Ten-2 in the CNS from an adult rat model of lithium chloridepilocarpine-induced epilepsy. In addition, TCAP-2 and LHPN1 gene expressions were also analyzed, as they are the main Ten-2 related proteins. For this, adult male (Rattus norvegicus; n = 49) were submitted to status epilepticus (SE) induced by intraperitoneal administration of lithium chloride (127 mg/kg) and pilocarpine hydrochloride (40 mg/kg). Subsequently, the animals were divided into control groups, 2-, 5- and 14-day groups after SE, as well as chronic epilepsy group (35-75 days). Samples were submitted to immunohistochemistry technique to identify Teneurin-2-like immunoreactive (Ten-2... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Embora os glicocorticoides (GCs) sejam os anti-inflamatórios mais prescritos mundialmente, níveis elevados de GCs potencializam alguns aspectos da resposta inflamatória em regiões do encéfalo de ratos, dependentes da ativação dos receptores GR. Neste estudo visamos avaliar os efeitos dos glicocorticoides em alguns aspectos da resposta inflamatória induzida por LPS nas populações de células (neurônio, micróglia e astrócitos) primárias de córtex frontal derivadas de ratos Wistar neonatos. Através de ensaios EMSA e imunofluorescência, avaliamos indicativos da ativação do fator NFKB em culturas mistas e enriquecidas expostas ao pré-tratamento com CORT, seguido do estímulo inflamatório LPS. Verificamos que a CORT não exerceu sua clássica atividade anti-inflamatória, pois não foi capaz de diminuir a ativação do NFKB induzida pelo LPS nas culturas mistas, sugerindo ser parcialmente dependente da ativação de GR, concentração dos GCs e interações celulares, já que os astrócitos em culturas mistas exibem respostas diferentes quanto ao NFKB, mas a microglia e neurônios não. / Although glucocorticoids (GCs) are the most commonly prescribed anti-inflammatory worldwide, high levels of GCs enhance some aspects of the inflammatory response in brain regions of rats, dependent on activation of GR. In this study, we aim to evaluate the effects of glucocorticoids in some aspects of the inflammatory response LPS-induced in populations of cells (neurons, astrocytes, and microglia) in primary frontal cortex derived from newborn rats. Through EMSA and immunofluorescence assays, we evaluated the indicative factor NFKB activation in mixed and enriched cultures exposed to pretreatment with CORT, followed by the LPS inflammatory stimulus. We found that CORT did not exerted its classic anti-inflammatory activity, whereas it was not able to decrease the activation of NFKB LPS-induced in mixed cultures, suggesting be partially dependent on the GR activation, GCs concentration and cellular interactions, since astrocytes in mixed cultures exhibit different responses relative to NFKB, but neurons and microglia did not.

Transtorno do espectro autista (TEA) é um quadro complexo do neurodesenvolvimento associado com elevado prejuízo funcional, onde os pacientes apresentam alterações comportamentais, déficit de comunicação e problemas de sociabilização. A incidência do TEA é muito elevada e vem crescendo constantemente nos últimos anos. Atualmente a prevalência é de 1 em cada 50 crianças nos EUA, sendo os meninos mais afetados que as meninas (4:1). O diagnóstico dos pacientes com TEA é feito clinicamente e ocorre geralmente com a idade de aproximadamente três anos, idade que os sintomas ficam mais evidentes. As causas biológicas e genéticas do autismo vem sendo estudadas em modelos animais e em material biológico humano, como sangue (genéticas) e cérebro post-mortem. Apesar de valiosos, esses modelos não permitem estudos das células neurais humanas em funcionamento. A geração de células neurais funcionais a partir das células previamente reprogramadas mudou esse cenário e abriu portas para gerar modelos celulares e estudar as doenças in vitro. Esse trabalho teve como objetivo modelar o TEA in vitro, a partir de neurônios e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas obtidas a partir das células-tronco de dente decíduo esfoliado (SHED) de pacientes com transtorno autista. Em nossos resultados observamos que neurônios autistas apresentam uma significativa diminuição na expressão de genes sinápticos quando comparados com neurônios não-autistas (controle). Além disso, ensaios funcionais de eletrofisiologia revelaram que neurônios autistas têm um número menor de picos de estimulação (spikes) por segundo, indicando neurônios possivelmente menos ativos. Em tempo, experimentos de co-cultura de neurônios e astrócitos revelaram que astrócitos autistas podem interferir na maturação e complexidade morfológica dos neurônios controle, e o inverso também foi observado, onde astrócitos de controles podem resgatar o fenótipo de neurônios autistas, sendo que um aumento significativo no nível de marcadores sinápticos, mudanças na morfologia com neurônios de pacientes mais maduros e complexos foi observado quando cultivados sobre astrócitos controles. Nossos dados indicam que os astrócitos influenciam na maturação, na complexidade e funcionalidade dos neurônios, mostrados aqui pela primeira vez para o autismo idiopático. Além disso, com este trabalho podemos afirmar que é possível modelar o autismo idiopático in vitro e estudar formas de resgate fenotípico das células afetadas na patologia visando futuras terapias para esses pacientes. A tecnologia das células reprogramadas e modelagem de doenças abre portas para novas descobertas no campo do autismo / Autism spectrum disorder (ASD) is a group of neurodevelopmental disorders characterized by qualitative impairment communication, social interaction and restricted and repetitive patterns of behavior. The prevalence of 1 in every 50 children in The United States has been reported with a tendency to increase in recent years. Patient ASD diagnosis typically occurs by the age of 3 years and affects more boys than girls (4:1). The biological and genetic causes of autism has been studied in animal models, in human biological material such as blood and in post-mortem brain tissues. Although valuable, these models do not allow study of living human neural cells. The generation of functional neural cells from reprogrammed cells previously changed this scenario and opened doors to generate cellular models in vitro and to study diseases as autism. This study aimed to model ASD in vitro to study neurons and astrocytes derived from induced pluripotent stem cells from mesenchymal stem cells from dental pulp (SHED) from patients with idiopathic autism. In our results we found that neurons derived from patients with ASD show a significant decrease in synaptic genes compared with controls. Functional electrophysiology tests were performed and we were able to observe a smaller number of spike per second in neurons derived from patients, indicating that neurons from ASD patients has less activity than control neurons. In our co-culture assay between neurons and astrocytes we observed that astrocytes derived from patients may interfere in the maturation and morphological complexity of neurons derived from controls. On the other hand, when we grow ASD neurons on astrocytes from controls we can observe a significant increase in the level of synaptic markers, changes in morphology where we observe more mature and complex neurons. These data indicate that astrocytes influence in the maturity, complexity and functionality of neurons, data never shown before for ASD patients. With these results we can say that it is possible to model idiopathic autism in vitro. The iPSC technology and disease modeling opens doors to new discoveries and therapies for ASD patients

Estudos anteriores de literatura indicavam que o sistema renina-angiotensina II local pineal era de fundamental importância para a expressão plena da capacidade de síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica pelos pinealócitos. Essa relação funcional estava na dependência de uma interação parácrina entre pinealócitos e astrócitos onde os astrócitos seriam os responsáveis pela síntese de angiotensina II que, liberada pela ação da noradrenalina, agiria em receptores do tipo AT1 existentes na membrana dos pinealócitos. O objetivo desse trabalho foi o de, uma vez estabelecida a metodologia de dissociação e cultivo dos tipos celulares, estudar a hipótese acima, além das possíveis vias de transdução intrapinealocitárias que levassem ao efeito potenciador da angiotensina II sobre a estimulação noradrenérgica no processo de síntese de melatonina. Os resultados mostraram que, diferentemente do que acontece com glândulas intactas ou com co-cultura (cultura contendo astrócitos e pinealócitos), a estimulação noradrenérgica de pinealócitos isolados não é passível de bloqueio por Losartan, uma droga bloqueadora de receptores AT1. Por outro lado, nas mesmas condições experimentais, a síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica é passível de potenciação pela adição de angiotensina II , efeito esse, que é bloqueado pelo Losartan. Demonstrou-se, ainda, que a estimulação noradrenérgica de astrócitos isolados, provoca a liberação de angiotensina II por esse tipo celular. Demonstrou-se, ainda, que há a mobilização de pelo menos duas vias de transdução nos pinealócitos quando estimulados pela angiotensina II: aumento da concentração de cálcio intracelular e mobilização de processos de fosforilação em tirosina usando as vias das proteínas JAK/ STAT. Dessa forma, pelo presente trabalho pode- se especular que quando a glândula pineal é estimulada pela liberação de noradrenalina dos terminais simpáticos, ao mesmo tempo que esta age nos pinealócitos promovendo a via de síntese de melatonina, age, também, nos 7 astrócitos, liberando angiotensina II que, por sua vez, age nos pinealócitos potenciando a ação estimulatória da noradrenalina, levando a um aumento da síntese de melatonina. / We have previously demonstrated that Angiotensin II (Ang II) potentiates the noradrenaline-stimulated (Nor+) melatonin synthesis in the rat pineal gland [Baltatu et al.,J. Neurochem.(2002)80, 328-334]. The aim of the present paper was to study the possible paracrine interactions between glial cells and pinealocytes in the rat pineal gland. To accomplish this aim, after standard pineal cell dissociation we studied the two cellular types separated in different cell cultures, either of glial pineal cells or pinealocytes. First, we showed, using freshly dissociated pineal cells, that Losartan is able to reduce Nor+ induced melatonin synthesis, similarly to what happens with pineal glands culture. Noradrenaline stimulation is able to induce melatonin synthesis in glial cell-free pinealocytes cell culture, what is not blocked by Losartan. In this condition, Ang II is able to potentiated the Nor+ induced melatonin synthesis, an AngII effect that is blocked by Losartan. Moreover, Ang II stimulated pinealocytes show an increase in Ca2+ current as evaluated by confocal microscopy. On the other hand, pinealocytes-free glial cells cultures when stimulated by noradrenaline release Ang II in the culture medium. Taking into account the above results it is possible to speculate that in the intact pineal gland noradrenaline released by sympathetic terminals stimulated pinealocytes inducing the well know process of melatonin synthesis at the same time that stimulate glial cells that release AngII that acting through AT1 receptors in pinealocytes potentiate melatonin synthesis by the inducing an increase in the intracellular Ca2+ pool and tyrosine phosphorylation of JAK/STAT complex.

Os objetivos principais desta tese foram avaliar parâmetros bioquímicos gliais, inflamatórios e comportamentais em pacientes com lesão medular (LM) submetidos a um protocolo de dança, e em ratos submetidos aos protocolos de exercício voluntário e forçado. Para tanto, foram realizados 4 experimentos. No primeiro, os ratos foram submetidos a 4 semanas de exercício moderado em esteira ergométrica (20 min por dia). No segundo, os animais foram submetidos à 4 semanas de exercício voluntário em rodas de correr (12 horas por dia). No terceiro experimento, os ratos foram expostos à esteira ergométrica durante 2 semanas (20 min/dia) e, após o último treino, receberam uma injeção intraperitoneal de LPS. Neste último, a memória e aprendizagem dos animais foram investigadas. Ao término do período de exercício, ou após a injeção de LPS, as análises bioquímicas do hipocampo foram realizadas. O quarto experimento foi realizado com indivíduos com LM que foram submetidos a 4 semanas de dança. Análises sorológicas e comportamentais foram efetuadas. Os resultados mostraram que o exercício forçado promoveu o aumento da glutamina sintetase (GS) e diminuição de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e óxido nítrico (NO) no hipocampo, além de aumentar os níveis de corticosterona, o que pode estar mediando os efeitos do exercício sobre os astrócitos. O exercício voluntário induziu o aumento da GS e BDNF. A aplicação de LPS promoveu aumento dos níveis de TNF-α no hipocampo dos animais, o que coincidiu com o aumento dos níveis de S100B no fluído cerebrospinal. Os indivíduos com LM submetidos à dança apresentaram melhora significativa nos escores da Medida de Independência Funcional, Índice de Barthel, Escala de Berg e Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão, e aumento dos níveis sorológicos de BDNF. A dança não teve efeito sobre os parâmetros gliais, metabólicos e inflamatórios periféricos. Estes resultados sugerem que diferentes tipos de exercício físico exercem diferentes efeitos sobre os astrócitos hipocampais, o que pode interferir na indicação de um ou outro dependendo do objetivo a ser alcançado. O exercício em esteira pode ser uma atividade indicada para prevenção de doenças que envolvem neuroinflamação, e a dança pode ser uma intervenção terapêutica eficaz para reabilitação de indivíduos com lesão medular uma vez que contribui para melhora física e psicológica desta população. Tomados juntos, os resultados desta Tese ressaltam a importância da prática de exercício físico para o metabolismo neural, e a relevância de estudar os astrócitos para compreensão dos mecanismos envolvidos no efeito do exercício físico no SNC. / The main aim of this Thesis was to evaluate the biochemical glial, inflammatory and behavioral parameters, in patient with spinal cord injury (SCI) submitted to a protocol of dance, and in rats submitted to voluntary and forced exercise. Four experiments were made. In the 1st, the rats were submitted to 4 weeks of moderate exercise on treadmill (20 min per day). In the 2nd, the animals were submitted to 4 weeks of voluntary exercise on wheel running (12 hours per day). In the 3rd experiment, the rats were exposed to treadmill during 2 weeks (20 min per day) and, after the last session, they received intraperitoneal injection of LPS. In this last experiment, the memory and learning were investigated. At the finish of the exercise period, or after the LPS injection, the biochemical analysis of the hippocampus was realized. The 4th experiment was realized with individuals with spinal cord injury that were submitted to 4 weeks of dance practice. Behavioral and serological analyses were performed. Data show that treadmill running increased glutamine synthetase (GS) activity and decreased hippocampal glial fibrillary acidic protein (GFAP) and nitric oxide (NO) , as well as increased corticosterone level, that can mediate the effects of the exercise on astrocytes. The voluntary exercise increased GS and BDNF. The LPS administration increased hippocampal TNF-α level in rats concomitantly with the increase in the S100B levels in cerebrospinal fluid. The individuals with spinal cord injury submitted to dance showed a significant improve in the scores of Functional Independency Measure, Barthel Index, Berg Scale and Ansiety and Depression Hospitalar Scale, and a increase in the serologic levels of BDNF. The dance had no effect on glial, metabolic and inflammatory parameters. These results suggest that different types of exercise exert different effects on hippocampal astrocytes, which may interfere with the appointment of one or the other depending on the objective to be achieved. The treadmill exercise can be a good strategy in the prevention of neuroinflammatory diseases, and dance can be an effective therapeutic intervention for rehabilitation of individuals with SCI as it helps to improve physical and psychological conditions in this population. Taken together, the present data highlight the importance of physical exercise for neural functions, and the relevance of studying astrocytes to understand the mechanisms involved in the effect of exercise on CNS.