Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that presents different strain types and degrees of virulence. The strains are classificated like clonal or typical and exotic or atypical. This parasite presents several evasion mechanisms, which guarantees the successful replication in the host cell and, between these mechanisms, there is ability to modulate apoptosis of infected cells as well of cells in the microenvironment of infection. The present work aimed to evaluate de ability of two atypical strains of T. gondii (Udi1CH-05 and Udi2CH-05) on modulation of apoptosis in BeWo cells, the susceptibility of these cells by infection, as well as the influence of those strains on the standard of secretion of cytokines by the trophoblastic cells lineage. These parameters were evaluated from the perspective of the immediate origin of the strains derived directly from cell culture or from animals and maintained for a short period in culture (here called Calomys callosus / culture). The Udi1CH-05 culture category upregulated apoptosis from 12 hours post infection, and from 2 hours of infection by Udi2CH-05, culture category, apoptosis was uncontrolled in BeWo cells. The condition C. callosus / culture of both strains didn t control apoptosis when compared to uninfected control. BeWo cells infected with Udi2CH-05, C. callosus / culture category produce high levels of IL-12 in the early stages of infection, suggesting a typical inflammatory response. Levels of TNF-α were higher in the early stages of infection and with a gradual decrease production, coinciding with failure to induce apoptosis when cells were infected BeWo Udi2CH-05, C. callosus / culture category. The levels of IL-10 found during infection of BeWo cells by Udi1CH-05 indicate that other cytokines may be involved in the control of infection, whereas this cytokine acts in controlling the immune response induced by infection of cells by BeWo Udi2CH-05, C. callosus / culture category. The production of TGF-β detected by infection Udi1CH-05 C. callosus / culture or Udi2CH-05 of both categories, shows that this cytokine acts in the immunoregulation of infected cells, whereas infection by Udi1CH-05, culture category, suggests that other anti-inflammatory cytokines can participate in immunoregulation, since the increase the apoptosis rate coincided with the decreased production of TGF-β. / Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório que apresenta diferentes tipos de cepas e graus variados de virulência. As cepas são classificadas como clonais e cepas exóticas ou atípicas. Este parasito apresenta diversos mecanismos de evasão, o que garante o sucesso na replicação na célula hospedeira e, entre estes mecanismos, destaca-se habilidade de modular a apoptose tanto de células infectadas quanto de células presentes no microambiente da infecção. O presente trabalho objetivou avaliar a habilidade de duas cepas atípicas de T. gondii (Udi1CH-05 e Udi2CH-05) em modular a apoptose de células BeWo, a susceptibilidade destas células a este parasito, bem como a influência de tais cepas no padrão de secreção de citocinas por esta linhagem de células trofoblásticas. Estes parâmetros foram avaliados sob a perspectiva da procedência imediata das cepas oriundas diretamente de cultura celular ou oriundas de animais e mantidas por curto período em cultura (aqui denominada Calomys callosus/cultura). A categoria cultura de Udi1CH-05 modulou positivamente a apoptose a partir de 12 horas de infecção, e a partir de 2 horas de infecção por Udi2CH-05, categoria cultura a apoptose não foi controlada em células BeWo. A condição C. callosus/cultura de ambas as cepas não controlou a apoptose quando comparado ao controle não infectado. As células BeWo infectadas com Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura produzem altos níveis de IL-12 nos estágios iniciais da infecção, sugerindo o desencadeamento de resposta inflamatória típica. Os níveis de TNF-α foram maiores nos estágios iniciais de infecção e com diminuição gradativa de produção, coincidindo com incapacidade em induzir a apoptose quando células BeWo foram infectadas por Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura. Os níveis de IL-10 encontrados durante a infecção de células BeWo por Udi1CH-05, indicam que outras citocinas podem estar envolvidas no controle da infecção, enquanto que essa citocina atua no controle da resposta imune desencadeada pela infecção de células BeWo por Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura. A produção de TGF-β detectada mediante a infecção por Udi1CH-05 C. callosus/cultura ou por Udi2CH-05 de ambas as categorias, demonstra que essa citocina atua na imunorregulação de células infectadas, enquanto que a infecção por Udi1CH-05, categoria cultura sugere que outras citocinas anti-inflamatórias possam participar da imunorregulação, pois o aumento do índice de apoptose coincidiu com a diminuição da produção de TGF-β. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

O gênero Yersinia compreende 12 espécies. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis são patógenos de vários animais, incluindo os humanos. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti e Y. rhodei são encontradas sobretudo no meio ambiente e alimentos e consideradas, usualmente, como bactérias oportunistas não-patogênicas e Y. ruckeri é um importante patógeno de peixes. Usualmente, as linhagens de Yersinia são classificadas em espécies de acordo com suas características bioquímicas. O Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras que Y. pestis recebeu mais de 700 linhagens que foram identificadas bioquimicamente. Entretanto, sete linhagens de Yersinia não puderam ser identificadas pelos testes bioquímicos convencionais em nenhuma das espécies até o momento conhecidas e, por esse motivo, foram denominadas Yersinia atípicas. Os objetivos desse trabalho foram identificar as linhagens atípicas de Yersinia spp. em espécies por técnicas moleculares como Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), sequenciamento do gene 16S rRNA e Multilocus Sequencing Typing (MLST) e definir dentre as metodologias empregadas a que mais contribui para a identificação precisa dessas linhagens. Foi estudado um total de 59 linhagens de Yersinia spp., sendo 52 linhagens representantes das diferentes espécies do gênero e sete as linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia. As técnicas de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e o MLST foram eficientes na identificação molecular do gênero Yersinia, uma vez que conseguiram reunir todas as espécies em ramos espécie-específicos, com exceção de algumas linhagens de Y. frederiksenii e Y. kristensenii. A técnica de PFGE, pelo contrário, não agrupou as linhagens estudadas em clusters espécie-específicos. Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST, sugerem que as linhagens atípicas FCF 229 e FCF 231 pertençam à espécie Y. ruckeri. Os dados de ERIC-PCR e MLST sugerem que a linhagem atípica FCF 487 pertença à espécie Y. enterocolitica. Ademais, os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST sugerem que as linhagens atípicas FCF 216, FCF 465, FCF 457 e FCF 494 pertençam a espécie Y. massiliensis. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem dados importantes para a caracterização molecular de linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia e contribuem para uma melhor descrição do gênero quanto a sua diversidade e reforçam o MLST como uma técnica confiável e reprodutível a ser usada na identificação de bactérias pertencentes a esse gênero, sendo dentre as metodologias utilizadas nesse estudo a mais indicada para tipagem molecular de yersiniae. / The genus Yersinia comprises 12 species. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis are pathogens of various animals, including humans. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti and Y. rohdei have been mostly found in the environment and food sources and are commonly considered to be opportunistic nonpathogenic bacteria and Y. ruckeri is an important fish pathogen. Usually, Yersinia strains are classified into species according to their biochemical characteristics. The Brazilian Reference Center on Yersinia spp. other than Y. pestis received more than 700 strains that were biochemically identified. However, seven strains that were typed as Yersinia could not be biochemically identified in any one of the currently known Yersinia species and for this reason they were named as atypical strains. The aims of this work were to identify into species the atypical Yersinia strains using molecular techniques as Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gene sequencing and Multilocus Sequencing Typing (MLST) and to define which methodology better contribute to the identification of those strains. A total of 59 Yersinia spp. strains were studied, being 52 representative strains of the defined Yersinia species and seven atypical Yersinia strains. ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST were efficient in molecular identifying the genera Yersinia once they grouped the strains into species-specific clusters, with exception of some Y. frederiksenii and Y. kristensenii strains. However, PFGE was not capable to cluster the defined Yersinia strains into species-specific clusters. The data obtained by ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 229 and FCF 231 belong to Y. ruckeri species. The data obtained by ERIC-PCR and MLST suggest that FCF 487 belong to the Y. enterocolitica species. Additionally, ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 216, FCF 465, FCF 457 and FCF 494 belong to the Y. massiliensis species. The results obtained provide important data for the molecular characterization of biochemically atypical strains and contribute for a better description of the genera regardless its diversity. Furthermore, the results reinforce MLST as a trustful and reproducible technique to be used in the identification of bacteria of this genus, being among the methodologies studied the most recommended one to molecular type yersiniae.

O gênero Yersinia compreende 12 espécies. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis são patógenos de vários animais, incluindo os humanos. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti e Y. rhodei são encontradas sobretudo no meio ambiente e alimentos e consideradas, usualmente, como bactérias oportunistas não-patogênicas e Y. ruckeri é um importante patógeno de peixes. Usualmente, as linhagens de Yersinia são classificadas em espécies de acordo com suas características bioquímicas. O Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras que Y. pestis recebeu mais de 700 linhagens que foram identificadas bioquimicamente. Entretanto, sete linhagens de Yersinia não puderam ser identificadas pelos testes bioquímicos convencionais em nenhuma das espécies até o momento conhecidas e, por esse motivo, foram denominadas Yersinia atípicas. Os objetivos desse trabalho foram identificar as linhagens atípicas de Yersinia spp. em espécies por técnicas moleculares como Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), sequenciamento do gene 16S rRNA e Multilocus Sequencing Typing (MLST) e definir dentre as metodologias empregadas a que mais contribui para a identificação precisa dessas linhagens. Foi estudado um total de 59 linhagens de Yersinia spp., sendo 52 linhagens representantes das diferentes espécies do gênero e sete as linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia. As técnicas de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e o MLST foram eficientes na identificação molecular do gênero Yersinia, uma vez que conseguiram reunir todas as espécies em ramos espécie-específicos, com exceção de algumas linhagens de Y. frederiksenii e Y. kristensenii. A técnica de PFGE, pelo contrário, não agrupou as linhagens estudadas em clusters espécie-específicos. Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST, sugerem que as linhagens atípicas FCF 229 e FCF 231 pertençam à espécie Y. ruckeri. Os dados de ERIC-PCR e MLST sugerem que a linhagem atípica FCF 487 pertença à espécie Y. enterocolitica. Ademais, os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST sugerem que as linhagens atípicas FCF 216, FCF 465, FCF 457 e FCF 494 pertençam a espécie Y. massiliensis. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem dados importantes para a caracterização molecular de linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia e contribuem para uma melhor descrição do gênero quanto a sua diversidade e reforçam o MLST como uma técnica confiável e reprodutível a ser usada na identificação de bactérias pertencentes a esse gênero, sendo dentre as metodologias utilizadas nesse estudo a mais indicada para tipagem molecular de yersiniae. / The genus Yersinia comprises 12 species. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis are pathogens of various animals, including humans. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti and Y. rohdei have been mostly found in the environment and food sources and are commonly considered to be opportunistic nonpathogenic bacteria and Y. ruckeri is an important fish pathogen. Usually, Yersinia strains are classified into species according to their biochemical characteristics. The Brazilian Reference Center on Yersinia spp. other than Y. pestis received more than 700 strains that were biochemically identified. However, seven strains that were typed as Yersinia could not be biochemically identified in any one of the currently known Yersinia species and for this reason they were named as atypical strains. The aims of this work were to identify into species the atypical Yersinia strains using molecular techniques as Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gene sequencing and Multilocus Sequencing Typing (MLST) and to define which methodology better contribute to the identification of those strains. A total of 59 Yersinia spp. strains were studied, being 52 representative strains of the defined Yersinia species and seven atypical Yersinia strains. ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST were efficient in molecular identifying the genera Yersinia once they grouped the strains into species-specific clusters, with exception of some Y. frederiksenii and Y. kristensenii strains. However, PFGE was not capable to cluster the defined Yersinia strains into species-specific clusters. The data obtained by ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 229 and FCF 231 belong to Y. ruckeri species. The data obtained by ERIC-PCR and MLST suggest that FCF 487 belong to the Y. enterocolitica species. Additionally, ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 216, FCF 465, FCF 457 and FCF 494 belong to the Y. massiliensis species. The results obtained provide important data for the molecular characterization of biochemically atypical strains and contribute for a better description of the genera regardless its diversity. Furthermore, the results reinforce MLST as a trustful and reproducible technique to be used in the identification of bacteria of this genus, being among the methodologies studied the most recommended one to molecular type yersiniae.