Submitted by THIAGO TASSIO DE SOUSA SILVA null (thiago_tassio.ef@hotmail.com) on 2017-08-22T22:00:09Z No. of bitstreams: 1 20.pdf: 1468120 bytes, checksum: cdc42b128dc74d02bfda2b7ce03783f0 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-08-23T18:23:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_tts_me_bot.pdf: 1468120 bytes, checksum: cdc42b128dc74d02bfda2b7ce03783f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-23T18:23:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_tts_me_bot.pdf: 1468120 bytes, checksum: cdc42b128dc74d02bfda2b7ce03783f0 (MD5) Previous issue date: 2016-08-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O setor florestal é um dos que mais contribui em termos sociais, econômicos e ambientais para o Brasil. Dentro deste setor, a eucaliptocultura pode ser apontada como a mais importante do segmento, com o plantio que representa 5,56 milhões de hectares. A primeira etapa do processo de implantação de florestas de eucaliptos é a produção de mudas, que no Brasil é feita por meio da clonagem, garantindo qualidade das mudas plantada no viveiro Porém, um dos principais desafios em viveiros, é o controle de patógenos, entre eles, Oidium eucalypti Rostrup., que apresenta maior incidência e se destaca devido à severidade e danos causados, e também à variedade de espécies e híbridos de eucalipto que são suscetíveis a doença. Pressupõe a hipótese que a utilização do fosfito e silício diminui o nível de severidade de bacteriose, e mantém a uniformidade da qualidade de mudas em viveiros florestais. Portanto, para testar estas hipóteses, objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito da aplicação de produtos contendo fosfito e silício no controle de bacteriose, e na qualidade de mudas de Eucalyptus urograndis em um viveiro comercial. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições e dez tratamentos (Zincazot, Fitofos-Cu, Fitofos-K, Fitofos-Zn-Mn, Silamol, Amorux, Fitofos-Cu + Terra sorb, Fitofos-K + Terra sorb, Fitofos-Zn-Mn + Terra sorb, e testemunha), sendo cada repetição uma bandeja com 176 mudas incluindo a testemunha, a qual não recebeu aplicação. As aplicações foram realizadas via foliar, iniciando-se sete dias antes da coleta das minicepas no mini jardim clonal até os 120 dias de idade das mudas. Os resultados foram comparados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Conclui-se que a aplicação de produtos contendo fosfito e silício não reduziu a severidade da bacteriose causada por Xanthonomas sp. em mudas de Eucalyptus urograndis a nível de viveiro. Não houve efeito significativo dos tratamentos nos padrões de qualidade avaliados. Aos 120 dias de idade foi observado, exceto na testemunha, que os demais tratamentos tiveram uma taxa de sobrevivência das mudas adequada, podendo constatar o efeito positivo dos tratamentos nessa variável que é de grande importância econômica em um viveiro de produção mudas. São necessários estudos mais aprofundados com esses elementos em viveiros, um estudo em ambiente totalmente controlado e com a inoculação de um patógeno especifico seria uma alternativa de estudo para maior compreensão do efeito dos fosfitos e silício na produção de mudas. / This study aimed to verify the effect of the application of phosphite and silicon as compounds of plant health and quality clonal seedlings of Eucalyptus hybrid urophylla x Eucalyptus grandis in a commercial nursery. The study consisted of ten treatments, being the same Zincazot, Fitofós-Cu-K Fitofós, Fitofós-Zn-Mn, Silamol, Amorux, Cu + Fitofós earth-sorb, K + Fitofós-earth sorb, Fitofos- Zn-Mn + Terra Sorb, plus the control treatment. The applications were made via foliar once a week from seven days before planting the ministumps 120 days old seedlings. Each treatment consisted of four trays com176 seedlings, each tray a repeat. The results will be compared with the second evaluation values, which was held to 120 after cutting the ministumps. Still they are obtained the results of quality seedlings (IQD), blight severity.Several studies have shown the effects of mineral nutrition on growth and productivity, with emphasis on the role of nutrients in the plant metabolism. Phosphites have been used on agricultural crops, including forest crops, due to the numerous particular advantages of the product as the relative low cost of the raw material, improving the nutritional status of plants and effects on disease control. Thus, that paper also promoted a study about bacteriosis , that according to the authors is a kind of sickness that has one great in young eucalyptus plants in nursery phase. / CNPq: 130258/2014-8

Ratoon stunting disease (RSD) is a serious disease that affects all sugarcane producing countries. The major symptom of RSD is plant growth reduction, which is only seen in ratoon plants, causing up to 80% biomass reduction depending on environmental conditions. The disease is due to Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), a gram-positive and nutritionally fastidious bacterium that so far has been found to specifically colonize the xylem vessels of sugarcane. However, the successful early detection of this pathogen is currently the main challenge for RSD prevention. Breeding for resistance to RSD, although not in practice, is a viable control measure. Since sugarcane varieties differ in relation to their degree of colonization by Lxx and losses are directly related to population densities of the pathogen in the plant, a promising breeding strategy would be to select for genotypes that are resistant to bacterial multiplication. Thus, knowledge on the responses of sugarcane to RSD at the \"omics\" level is an essential starting step to identify key metabolic targets for breeding resistant varieties. The overall goal of this study is to determine the metabolic profiles of a susceptible (CB49-260) and resistant (SP80-3280) variety inoculated or not with Lxx and to compare the results with existing proteomic and transcriptomic data to define a core of targets (proteins, genes, and metabolites) that can be tested as markers of resistance in a collection of sugarcane varieties. Bacterial titers were quantified by Real-Time PCR (qPCR). The metabolites were profiled from the leaves and from the xylem saps collected at 30 and 120 days after inoculation (DAI). Untargeted analysis were performed with Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) and were carried out on leaves and sap from 120 DAI. Targeted analysis was executed with Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) on both tissues at both timepoints. To validate metabolomics results, a set of metabolites was chosen to be tested in vitro, in order to detect growth alterations caused to Lxx. qPCR confirmed the susceptibility of CB49-260 as it had higher titers than SP80-3280. Global analysis revealed that both varieties and tissues have different metabolic profiles but that those differences are more quantitative than qualitative. The targeted approach identified more amino acids, sugars, organic acids and phosphorylated compounds in the non-inoculated susceptible genotype, while the resistant one had higher abundance of phenolics. It was also shown that inoculation with Lxx results in more relative abundance of amino acids, organic acids, phosphorylated compounds and phenolics. Furthermore, a key amino acid for Lxx survival was related to inoculation on both varieties, as well as a known phenolic compound related to plant defense. Distinguished phenolics resulting from the targeted analysis were selected to evaluate their effect on Lxx growth in vitro. Although some compounds caused inhibition, further optimization of the methodology is needed to confirm these results. / O Raquitismo-da-soqueira (RSD) é uma grave doença que afeta todos os paises produtores de cana-de-açúcar. O principal sintoma do RSD é tamanho reduzido das plantas, observado apenas nas plantas-soca, o que pode resultar em perdas de biomassa em até 80%, dependendo das condições climáticas. A doença é causada por Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), uma bactéria gram-positiva e fastidiosa, descrita até o presente momento como hospedeira natural apenas da cana-de-açúcar, colonizando principalmente os vasos do xilema. Todavia, a detecção precoce deste patógeno é o principal desafio para prevenção do RSD. O melhoramento genético para resistência ao RSD, apesar de viável, não é uma medida de controle adotada na prática. Como existe diferenças entre as variedades de cana em relação ao grau de colonização por Lxx e as perdas estão diretamente relacionadas ao título bacteriano, uma estratégia de melhoramento promissora é a seleção de genótipos que apresentam resistência à multiplicação bacteriana. Portanto, o conhecimento das respostas da cana-de-açúcar ao RSD em termos \"ômicos\" é um passo inicial primordial para a identificação de alvos-chave para melhorar variedades resistentes. O objetivo geral deste estudo foi determinar os perfis metabólicos de duas variedade, uma suscetível (CB49-260) e uma resistente (SP80-3280) inoculada ou não com Lxx e comparar os resultados com dados já existentes de proteômica e transcriptômica para definir um núcleo de alvos (proteínas, genes e metabólitos) que possam ser testados como marcadores de resistência em uma coleção de cana-de-açúcar. Os títulos bacterianos foram quantificados por PCR em tempo real (qPCR). Os perfis metabólicos foram elaborados a partir de folhas e fluído xilemático coletados aos 30 e 120 dias após inoculação (DAI). A análise não-direcionada foi realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), usando folhas e extratos coletados aos 120 DAI. Já a análise direcionada foi efetivada via cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), em ambos tecidos e tempos de coleta. Para validar os resultados de metabolômica, um grupo de metabólitos destacado nas análises de metabolômica foi escolhido para testes in vitro e por fim detectar alterações no crescimento de Lxx. O resultado do qPCR confirmou a suscetibilidade da CB49-260, pois esta continha títulos superiores à SP80-3280. A análise global revelou que ambos variedades e tecidos possuem perfis metabólicos distintos, porém essas diferenças foram mais quantitativas que qualitativas. A análise direcionada identificou mais aminoácidos, açúcares, ácidos organicos e compostos fosforilados no genótipo suscetível não-inoculado, enquanto que o resistente apresentou maior abundância de compostos fenólicos. Também foi demonstrado que a inoculação com Lxx resultou em maior quantidade de aminoácidos, ácidos orgânicos, compostos fosforilados e fenólicos. Ademais, um aminoácido essencial à sobrevivência de Lxx foi relacionado à inoculação de ambas variedades, assim como um composto fenólico relacionado a defesa de plantas. O teste in vitro mostrou que, apesar de alguns compostos causarem inibição, é necessário aprimorar a metodologia utilizada para confirmar os resultados obtidos.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-02-22T14:28:38Z No. of bitstreams: 1 Adriana Soares Leite.pdf: 443532 bytes, checksum: aecae8c9b89ee037b16d8d03ce6267a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-22T14:28:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana Soares Leite.pdf: 443532 bytes, checksum: aecae8c9b89ee037b16d8d03ce6267a9 (MD5) Previous issue date: 2004-06-09 / An epidemiological study was performed to evaluate the prevalence of serum antibody to B. abortus, BVDV, BHV – 1 and tuberculin sensitivity to M. bovis, and the association among these infections. Sera from 241 dairy buffaloes were analyzed by buffered plate antigen test (BPAT), serum agglutination test (SAT) and by 2-mercaptoethanol (2-ME) for the diagnosis of Brucella abortus, virusneutralization (VN) for BVDV and BHV – 1 and comparative cervical tuberculin test for M. bovis. The results showed 32,34% of positive samples to B. abortus, 24,07% of positive tuberculin reactors, 76,76% of reactive samples to BVDV and 49,79% to BHV – 1. Association was found between reagent and non reagent animals to the tests to B. abortus and BHV – 1 (p<0,001). / Foi realizado um estudo epidemiológico para determinar a prevalência de anticorpos séricos anti-Brucella abortus e a associação com as infecções por Mycobacterium bovis, vírus da diarréia viral bovina (BVDV) e vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina - IBR (BHV–1). Foram analisadas 241 amostras séricas de bubalinos com aptidão leiteira no Município de Taipu – RN, empregando o teste do antígeno acidificado tamponado (AAT) e as provas de soroaglutinação lenta em tubos (SAL) e 2–mercaptoetanol (2-ME) para o diagnóstico da brucelose; prova de virusneutralização (VN) para detecção de anticorpos para BVD e IBR. Os animais foram também submetidos ao teste cervical comparativo para tuberculose. Os resultados mostraram 32,34% de amostras soropositivas para B. abortus, 24,07% de animais com reação positiva ao teste alérgico para Tuberculose, 76,76% de animais sororreagentes para BVDV e 49,79% para BHV – 1. Foi detectada associação entre animais reagentes e não reagentes aos testes para B. abortus e BHV – 1 (p<0,001).

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a reação de oito variedades comerciais e dois acessos selvagens de maracujá amarelo (P.edulis Sims f. flavicarpa), quanto à resistência a Xanthomonas campestris pv. passiflorae e elaborar uma escala diagramática de sintomas para auxiliar na avaliação da severidade da mancha bacteriana. A escala foi desenvolvida a partir de 100 folhas com sintomas da doença. Desta amostra foram estabelecidos cinco níveis de severidade utilizados na escala (2%, 5%; 11%, 26% e 59%). A escala foi validada por sete avaliadores, que utilizaram 48 folhas com diferentes níveis de severidade. A validação da escala mostrou que os avaliadores apresentaram alta precisão nas suas avaliações, com coeficientes de determinação (R2) variando de 0,86 a 0,95. A maioria dos avaliadores apresentou uma leve tendência em superestimar a severidade da doença. A escala mostrou-se útil ao trabalho, permitindo avaliações com alta precisão e boa acurácia. Para avaliar a reação das dez populações (oito variedades comerciais e dois acessos selvagem) de maracujá amarelo em relação a X. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a reação de oito variedades comerciais e dois acessos selvagens de maracujá amarelo (P.edulis Sims f. flavicarpa), quanto à resistência a Xanthomonas campestris pv. passiflorae e elaborar uma escala diagramática de sintomas para auxiliar na avaliação da severidade da mancha bacteriana. A escala foi desenvolvida a partir de 100 folhas com sintomas da doença. Desta amostra foram estabelecidos cinco níveis de severidade utilizados na escala (2%, 5%; 11%, 26% e 59%). A escala foi validada por sete avaliadores, que utilizaram 48 folhas com diferentes níveis de severidade. A validação da escala mostrou que os avaliadores apresentaram alta precisão nas suas avaliações, com coeficientes de determinação (R2) variando de 0,86 a 0,95. A maioria dos avaliadores apresentou uma leve tendência em superestimar a severidade da doença. A escala mostrou-se útil ao trabalho, permitindo avaliações com alta precisão e boa acurácia. Para avaliar a reação das dez populações (oito variedades comerciais e dois acessos selvagem) de maracujá amarelo em relação a X. campestris pv. passiflorae, dois experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, o primeiro entre os meses de setembro a dezembro de 2002 e o segundo entre os meses de janeiro a março de 2003. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com nove tratamentos e quatro repetições em ambos os ensaios, sendo que as parcelas experimentais consistiram de 30 e 25 plantas de cada material, respectivamente, no primeiro e segundo experimentos. As avaliações de severidade da doença foram realizadas aos 7, 14 e 21 dias após inoculação, através da escala diagramática de sintomas elaborada neste trabalho. Com os dados das três avaliações, estimou-se a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) para cada material estudado. Os resultados permitiram detectar diferentes níveis de resistência entre as populações avaliadas. Os materiais mais resistentes a X. campestris pv. passiflorae foram as variedades Sul Brasil e IAC- serie 270, enquanto que as variedades IAC-277, Maguary e Flora foram as mais suscetíveis. / This study aimed to evaluate the reaction of eight populations of commercial yellow passion fruit and two of wild passion fruit (P.edulis Sims f. flavicarpa) to Xanthomonas campestris pv. passiflorae and elaborate a diagrammatic scale of symptoms for the evaluation of the severity of the disease. This scale was developed based on 100 leaves with different levels of disease. Out of this sample, five levels of severity were depicted in the scale (2%, 5%, 11%, 26%, and 59%). The scale was used by seven evaluators to assess the symptoms of 48 leaves with different degrees of severity. The evaluators showed high precision judging by the high correlation coefficients (R2) which ranged from 0.86 to 0.95. Most evaluators showed a tendency to super-estimate the severity of the disease. Notwimstanding, the scale allowed precise and accurate evaluations. Two experiments were performed in the greenhouse to determine the level of resistance of ten populations (eight commercial and two wild) of yellow passion fruit to X. campestris pv passiflorae. The first trial was conducted between September and December 2002, and the second between January and March 2003. The experimental design consisted of random blocks, with nine treatments and four replicates in both experiments. The experimental plot consisted of 30 and 25 plants of each variety, respectively in the first and second trials. Disease severity was evaluated 7, 14, and 21 days after inoculation using the diagrammatic scale. With the data of the three evaluations, the area under the disease progress curve (AUDPC) for each material was estimated and used in the analysis of variance. The results detected different levels of resistance among populations. The most resistant materials were the varieties Sul Brasil and IAC- serie 270, while the varieties IAC-277, Maguary e Flora were the most susceptible.

A bacteriose, ou mancha oleosa, doença causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é um sério problema em muitas áreas de produção de maracujá no Brasil, especialmente se associada à antracnose. A transformação genética é uma alternativa para obter plantas resistentes. Proteínas bactericidas, como as atacinas encontradas na hemolinfa de insetos, têm sido usadas para conferir resistência a espécies vegetais. Como as atacinas têm um peptídeo sinal que as direciona para o espaço extracelular em insetos, nós iniciamos este estudo investigando o direcionamento da atacina A em plantas. A seqüência do gene da atacina A (attA) com e sem o peptídeo sinal foi fusionada com os genes repórteres uidA e gfp e epidermes de cebola foram transformadas, via biobalística, com essas construções gênicas. A atacina A, de fato, é acumulada no apoplasto onde, justamente, bactérias fitopatogênicas se multiplicam antes de invadir as células vegetais. Visando obter plantas transgênicas resistentes à bacteriose, foram transformados tecidos foliares e hipocotiledonares com as linhagens LBA 4404 e EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene attA. De um total de 313 explantes infectados, foram obtidos 31 brotos PCR+, o que representa uma eficiência de transformação da ordem de 10%. A expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR e a resistência ao patógeno foi avaliada pela inoculação de X. axonopodis pv. passiflorae em folhas destacadas de plantas mantidas in vitro. Em dez plantas não houve formação de lesão foliar, indicando uma possível resistência ao patógeno. / Bacterial spot disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is a serious problem in many passion fruit production areas in Brazil, especially if associated with anthracnose. Genetic transformation provides an alternative for obtaining resistant plants. Bactericide proteins such as attacins, found in the haemolymph of insects, have been used to confer resistance on plant species. As the attacins have a sign peptide that dispatches them to extracellular space in insects, we initiated our studies investigating the attacin A directing in plants. The attacin A gene (attA) sequence, with and without the sign peptide, was fused to uidA and gfp reporter genes, and onion epidermis were transformed using bioballistics with gene constructions. The protein did accumulate in the apoplast, where bacteria multiply before attacking plant cells. With the aim of obtaining transgenic plants of yellow passion fruit resistant to bacterial disease, leaf and hypocotyl-derived tissues were transformed with LBA 4404 and EHA 105 strains of Agrobacterium tumefaciens containing the attA gene. From a total of 313 infected explants, we obtained 31 PCR+ shoots, a transformation efficiency of 10%. Expression of the attA gene was confirmed by RT-PCR, and pathogen resistance evaluated by X. axonopodis pv. passiflorae inoculation in leaves obtained from in vitro plants. Leaf lesions were not observed in 10 shoots, suggesting a possible resistance to pathogen.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.

A bacteriose, ou mancha oleosa, doença causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae, é um sério problema em muitas áreas de produção de maracujá no Brasil, especialmente se associada à antracnose. A transformação genética é uma alternativa para obter plantas resistentes. Proteínas bactericidas, como as atacinas encontradas na hemolinfa de insetos, têm sido usadas para conferir resistência a espécies vegetais. Como as atacinas têm um peptídeo sinal que as direciona para o espaço extracelular em insetos, nós iniciamos este estudo investigando o direcionamento da atacina A em plantas. A seqüência do gene da atacina A (attA) com e sem o peptídeo sinal foi fusionada com os genes repórteres uidA e gfp e epidermes de cebola foram transformadas, via biobalística, com essas construções gênicas. A atacina A, de fato, é acumulada no apoplasto onde, justamente, bactérias fitopatogênicas se multiplicam antes de invadir as células vegetais. Visando obter plantas transgênicas resistentes à bacteriose, foram transformados tecidos foliares e hipocotiledonares com as linhagens LBA 4404 e EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene attA. De um total de 313 explantes infectados, foram obtidos 31 brotos PCR+, o que representa uma eficiência de transformação da ordem de 10%. A expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR e a resistência ao patógeno foi avaliada pela inoculação de X. axonopodis pv. passiflorae em folhas destacadas de plantas mantidas in vitro. Em dez plantas não houve formação de lesão foliar, indicando uma possível resistência ao patógeno. / Bacterial spot disease caused by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae is a serious problem in many passion fruit production areas in Brazil, especially if associated with anthracnose. Genetic transformation provides an alternative for obtaining resistant plants. Bactericide proteins such as attacins, found in the haemolymph of insects, have been used to confer resistance on plant species. As the attacins have a sign peptide that dispatches them to extracellular space in insects, we initiated our studies investigating the attacin A directing in plants. The attacin A gene (attA) sequence, with and without the sign peptide, was fused to uidA and gfp reporter genes, and onion epidermis were transformed using bioballistics with gene constructions. The protein did accumulate in the apoplast, where bacteria multiply before attacking plant cells. With the aim of obtaining transgenic plants of yellow passion fruit resistant to bacterial disease, leaf and hypocotyl-derived tissues were transformed with LBA 4404 and EHA 105 strains of Agrobacterium tumefaciens containing the attA gene. From a total of 313 infected explants, we obtained 31 PCR+ shoots, a transformation efficiency of 10%. Expression of the attA gene was confirmed by RT-PCR, and pathogen resistance evaluated by X. axonopodis pv. passiflorae inoculation in leaves obtained from in vitro plants. Leaf lesions were not observed in 10 shoots, suggesting a possible resistance to pathogen.

Submitted by GABRIELLE VIEIRA null (gabriellevieir@gmail.com) on 2018-04-05T12:53:30Z No. of bitstreams: 1 Metabólitos secundários de fungos da Antártica com ação antimicrobiana em Xanthomonas spp.pdf: 8795008 bytes, checksum: 0df6b298004d2d27c6a56a8a8367648b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T14:02:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_g_me_rcla.pdf: 8781866 bytes, checksum: e535d140907c0db6ece0255e817ca841 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande importância econômica no Brasil. O controle destas doenças realizado pela utilização de produtos químicos, entre outras práticas, causa impactos negativos na saúde e ao meio ambiente. Isso torna a busca de alternativas sustentáveis de combate a estas doenças cada vez mais importante. Uma possível alternativa aos produtos químicos que tem despertado grande interesse é a aplicação de metabólitos secundários. Suspeita-se que fungos que vivem em ambientes extremos como a Antártica podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos. Dessa maneira, este projeto teve como objetivo principal investigar a potencial atividade de metabólitos secundários produzidos por 33 fungos isolados do solo contra três espécies de Xanthomonas economicamente importantes para a agricultura do país. Para tanto, foram utilizados fungos coletados em solo em expedição à Antártica (2013) no âmbito do INCT Criosfera, que estão preservados junto à Central de Recursos Microbianos da UNESP. Os extratos (n=66) foram testados contra Xanthomonas patogênicas das culturas de tomate (Xanthomonas euvesicatoria), frutas cítricas (Xanthomonas citri subsp. citri) e maracujá (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). Do total de extratos brutos submetidos a bioensaio contra os fitopatógenos, 18 (27,27%) apresentaram taxa de inibição ≥ 90%. Os extratos com potencial inibitório tiveram origem em fungos identificados por sequenciamento da região ITS4 e ITS5 como pertencentes ao filo Ascomycota, gênero Pseudogymnoascus. Alguns extratos ativos foram purificados utilizando diversas técnicas cromatográficas por fracionamento bioguiado como cromatografia por exclusão molecular, cromatografia em coluna em fase normal, cromatografia em coluna de fase reversa e cromatografia líquida de alta eficiência por interação hidrofílica. As frações obtidas foram testadas frente à Xanthomonas citri subsp. citri. Duas frações, obtidas por cromatografia líquida de alta eficiência, C2F2 e C2F5 apresentaram atividade inibitória contra o fitopatógeno. / Bacteria of the genus Xanthomonas affect agricultural crops of great economic importance in Brazil. Control of these diseases is made by the use of chemicals, among other practices, that causes negative impacts on human health and the environment. This makes the search for sustainable alternatives to combat these diseases increasingly important. A possible alternative to chemicals that have aroused great interest is the application of secondary metabolites. It is suspected that fungi living in extreme environments such as Antarctica may produce secondary metabolites as of yet unknown. Therefore this study had as main objective investigate the potential activity of secondary metabolites produced by 33 fungi isolated from the soil against three economically important Xanthomonas species. For this purpose fungi previously collected in the Antarctic expedition (2013) under the INCOS Criosfera and preserved at the Microbial Resource Center of UNESP were utillized. The extracts produced by the 33 isolates (n = 66) were tested against pathogenic Xanthomonas of tomato crops: Xanthomonas euvesicatoria; citrus: Xanthomonas citri subsp. citri; and of passion fruit culture, Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. From the total of extracts submitted to bioassay against phytopathogens, 18 (27.27%) presented inhibition rate ≥ 90%. The extracts with inhibitory potential were produced by fungi identified through sequencing of the ITS4 and ITS5 regions as belonging to the Ascomycota phylum, genus Pseudogymnoascus. Some active extracts were purified using chromatography techniques by bioguided fractionation such as solid phase chromatography by molecular exclusion, normal phase column chromatography, reverse phase column chromatography, and high performance liquid chromatography by hydrophilic interaction . The fractions obtained by cromatography were tested for antibacterial activity in Xanthomonas citri subsp. citri. Two fractions, obtained by high performance liquid chromatography, C2F2 and C2F5, showed inhibitory activity against the phytopathogen. / FAPESP: 2015/20629-6.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a reação de oito variedades comerciais e dois acessos selvagens de maracujá amarelo (P.edulis Sims f. flavicarpa), quanto à resistência a Xanthomonas campestris pv. passiflorae e elaborar uma escala diagramática de sintomas para auxiliar na avaliação da severidade da mancha bacteriana. A escala foi desenvolvida a partir de 100 folhas com sintomas da doença. Desta amostra foram estabelecidos cinco níveis de severidade utilizados na escala (2%, 5%; 11%, 26% e 59%). A escala foi validada por sete avaliadores, que utilizaram 48 folhas com diferentes níveis de severidade. A validação da escala mostrou que os avaliadores apresentaram alta precisão nas suas avaliações, com coeficientes de determinação (R2) variando de 0,86 a 0,95. A maioria dos avaliadores apresentou uma leve tendência em superestimar a severidade da doença. A escala mostrou-se útil ao trabalho, permitindo avaliações com alta precisão e boa acurácia. Para avaliar a reação das dez populações (oito variedades comerciais e dois acessos selvagem) de maracujá amarelo em relação a X. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a reação de oito variedades comerciais e dois acessos selvagens de maracujá amarelo (P.edulis Sims f. flavicarpa), quanto à resistência a Xanthomonas campestris pv. passiflorae e elaborar uma escala diagramática de sintomas para auxiliar na avaliação da severidade da mancha bacteriana. A escala foi desenvolvida a partir de 100 folhas com sintomas da doença. Desta amostra foram estabelecidos cinco níveis de severidade utilizados na escala (2%, 5%; 11%, 26% e 59%). A escala foi validada por sete avaliadores, que utilizaram 48 folhas com diferentes níveis de severidade. A validação da escala mostrou que os avaliadores apresentaram alta precisão nas suas avaliações, com coeficientes de determinação (R2) variando de 0,86 a 0,95. A maioria dos avaliadores apresentou uma leve tendência em superestimar a severidade da doença. A escala mostrou-se útil ao trabalho, permitindo avaliações com alta precisão e boa acurácia. Para avaliar a reação das dez populações (oito variedades comerciais e dois acessos selvagem) de maracujá amarelo em relação a X. campestris pv. passiflorae, dois experimentos foram conduzidos em casa de vegetação, o primeiro entre os meses de setembro a dezembro de 2002 e o segundo entre os meses de janeiro a março de 2003. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso, com nove tratamentos e quatro repetições em ambos os ensaios, sendo que as parcelas experimentais consistiram de 30 e 25 plantas de cada material, respectivamente, no primeiro e segundo experimentos. As avaliações de severidade da doença foram realizadas aos 7, 14 e 21 dias após inoculação, através da escala diagramática de sintomas elaborada neste trabalho. Com os dados das três avaliações, estimou-se a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) para cada material estudado. Os resultados permitiram detectar diferentes níveis de resistência entre as populações avaliadas. Os materiais mais resistentes a X. campestris pv. passiflorae foram as variedades Sul Brasil e IAC- serie 270, enquanto que as variedades IAC-277, Maguary e Flora foram as mais suscetíveis. / This study aimed to evaluate the reaction of eight populations of commercial yellow passion fruit and two of wild passion fruit (P.edulis Sims f. flavicarpa) to Xanthomonas campestris pv. passiflorae and elaborate a diagrammatic scale of symptoms for the evaluation of the severity of the disease. This scale was developed based on 100 leaves with different levels of disease. Out of this sample, five levels of severity were depicted in the scale (2%, 5%, 11%, 26%, and 59%). The scale was used by seven evaluators to assess the symptoms of 48 leaves with different degrees of severity. The evaluators showed high precision judging by the high correlation coefficients (R2) which ranged from 0.86 to 0.95. Most evaluators showed a tendency to super-estimate the severity of the disease. Notwimstanding, the scale allowed precise and accurate evaluations. Two experiments were performed in the greenhouse to determine the level of resistance of ten populations (eight commercial and two wild) of yellow passion fruit to X. campestris pv passiflorae. The first trial was conducted between September and December 2002, and the second between January and March 2003. The experimental design consisted of random blocks, with nine treatments and four replicates in both experiments. The experimental plot consisted of 30 and 25 plants of each variety, respectively in the first and second trials. Disease severity was evaluated 7, 14, and 21 days after inoculation using the diagrammatic scale. With the data of the three evaluations, the area under the disease progress curve (AUDPC) for each material was estimated and used in the analysis of variance. The results detected different levels of resistance among populations. The most resistant materials were the varieties Sul Brasil and IAC- serie 270, while the varieties IAC-277, Maguary e Flora were the most susceptible.

O Brasil é o principal produtor de maracujá amarelo. Entretanto, a produtividade é baixa, cerca de 1 0.000 t por hectare. A produção de frutos varia com o cultivar, condições climáticas, manejo e outros fatores, principalmente doenças causadas por bactérias e vírus. Metodologias de transformação genética são alternativas modernas para obter plantas resistentes. A proteína derivada de inseto, atacina A atua como bactericida, e tem sido utilizada para conferir resistência a espécies vegetais. Os objetivos do presente estudo foram (i) obter a regeneração de brotos in vitro, (ii) testar a eficiência de agentes seletivos durante o processo organogênico, (iii) construir o cassete contendo o gene atacína A, e (iv) determinar as condições físicas e biológicas para a transformação genética de plantas de maracujá amarelo utilizando o método de biobaiística. Em relação a estudos in vitro, três recipientes de cultura foram avaliados como também diferentes concentrações de benzylaminopurina (BA) e água de coco que foram adicionadas ao meio basal. Phytagei e agar também foram testados como agentes solidificantes. As culturas foram avaliadas quanto à resposta morfogênica dos discos foliares. O gene atacina A foi sequenciado e clonado para receber o promotor CAMV 35S com um enhancer duplicado e o terminador 35S. Este vetor foi denominado pFFatacina. O cassete de expressão foi cionado nos vetores pcambia 1300 e pcambia 2300 que contêm os genes higromicina (hpt) e canamicina (nptll), respectivamente. Discos foliares, assim como segmentos entrenodais e hipocotiledonares que induzem calos, foram usados nos experimentos de biobaiística. A expressão do gene uida foi avaliada para testar os parâmetros de bombardeamento, pressão de gás Hélio (psi) e a distância da tela de retenção até o tecido alvo (cm). A resposta organogênica dos discos foliares não diferiu quando placas de petrí, tubos ou frascos foram usados, embora os tubos (2,4 x 8,5 cm, 30 mi) mostraram uma resposta ligeiramente melhor. O meio MS (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum, 15, 1962) solidificado com agar (0,6%) e suplementado com 0,5 mg/L BA e 5% de água de coco (w/v) provou ser eficiente na indução de organgênese. Brotos foram obtidos após 30 dias. Segmentos entrenodais e hipocotiledonares produziram 300 estruturas semelhantes a gemas por explante. Microscopia de varredura e análises histológicas demonstraram ser estruturas foliares, as quais evoluíram em brotos após 50 dias em Y2 MS. Higromicina a 5 mg/L provou ser um agente seletivo apropdado, inibindo organogênese em 60% dos explantes. Canamicina a 50 mg/L foi também efetiva. Calos morfogênicos de até 10 dias e discos foliares de 3 dias de cultivo mostraram elevados níveis de expressão transiente sob 80016,5 ou 100019,5 (psi de gás Héliolcm de distância de võo dos microprojéteis). Foram realizados experimentos de co-transformação com pB[426 (8,7 kb) que contém o gene npdi e pFFatacina (5,25 kb), como também utilizando-se um único vetor (pcatacina 1300), Freqüência de transformação estável de 0,85% foi obtida. A integração do transgene foi confirmada por PCR para o gene atacina A. Este é o primeiro trabalho que relata a transferência de um gene de interesse para plantas de maracujá amarelo por biobalística. / Brazil is the leading producer of the yellow passion fruit. However, the productivity is fairly low, about 10,000 t per hectare. Fruit yields vary with cultivars, climatic conditions, management and other factors, namely bacterial and virus díseases. Genetic transformation methodologies are modern alternatives to obtain plant resistance. The insectderived protein, attacin A acts as bacterícide, and it has been used to confer resistance to plant species. The objectives of the present study were (i) to obtain in vitro shoot regeneration, (ii) to test the efficiency of certain selective agents during the organogenesis process, (iií) to construct the cassette containing the attacin A gene, and (iv) to determine the physical and biological conditions for genetic transformation of passion fruit plants by using the biolistic approach. Regarding the ín vítro studies, three culture recipients were evaluated as well as different concentrations of benzylaminopurine (BA) and coconut water that suppiemented the basal medium. Phytagei and agar were aiso tested as solidifying agents. Cultures were evaluated with respect to leaf dises morphogenic responses. The attacín A gene was sequenced, and cioned to receive the CAMV 35S promoter with a duplicated enhancer sequence, and the 35S terminator. This vector was denoted pFFatacina. The cassette was cioned in pcambia 1300 and pcambia 2300 vectors that contain the hygromícin (hpt) and kanamycin (nptil) genes, respectively. Leaf discs, as well as internodal segments and hypocotyl-derived sections chosen to índuce calii, were used in the biolistic experiments. The uida gene expression was evaluated for testing bombardment parameters, namely the helium pressure (psi) and the distance from the stopping screen to the target tissue (cm). The organogenic response of the leaf discs did not differ when petri dishes, tubes or culture vesseis were used although the tubes (2,4 x 8,5 cm, 30 ml capacity) showed to be slightly better. The agar (0.6%)-solidifíed MS (Murashige & Skoog, Physíología Plantarum, 15, 1962) medium suppiemented with 0.5 mg/L BA and 5% (wlv) coconut water proved to be efficient to induce organogenesis. Shoots were obtained after 30 days. Internada[ and hypocotyl-derived segments produced 300 bud-like structures per explant. Scanning microscopy and histologícal anaiyses provided evidences that they were leaf structures, which last 50 days in 1/2 MS to evolve into shoots. Hygromicin at 5 mg/L proved to be proper as selective agent, inhibiting organogenesis in 60% of the explants. Kanamycin at 50 mg/L was also effective. Morphogenic calli up to 10 days old and 3 d-leaf discs showed high levels of transient uida gene expression under 80016.5 or 1000/9.5 helium pressureldistance from the stopping screen to the target tissue. Cotransformation experiments with pBI426 (8.7 kb) that contain the nptil gene and pFFatacina (5.25 kb) were carried on as well singre vector transformation tríals (pcatacina 1300). Stable transformation frequency of 0.85% was obtained. Transgene integration was confirmei by PCR for the attacin A gene. This is the first report on agronomicaily useful-gene transfer to yeilow passion fruit plants by biolistics.