Orientador: Fernando Antonio Santos Coelho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andre_MarceloFabiano_M.pdf: 7456902 bytes, checksum: 8a8b77c97023eb4ce17c25791c0a18f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As b-piperonil-g-butirolactonas são intermediários importantes, tendo em vista que a partir delas é possível dar origem a uma série de lignanas, classe de substâncias de grande interesse científico, por apresentarem diversas atividades biológicas, tais como: antiretroviral, antitumoral, antimalárica, entre outras. Neste trabalho realizamos estudos visando melhorar a diastereosseletividade na preparação de g-butirolactonas com estereoquímica relativa trans, já que a cis já era preparada com boa diastereosseletividade em nosso laboratório. A metodologia desenvolvida baseia-se na redução de um b-ceto-éster obtido a partir da oxidação de um a-ciano-metil-b-hidroxi-éster, este último obtido com um bom rendimento a partir de uma reação de adição de Michael sobre um aduto de Morita-Baylis-Hillman ( MBH). Na segunda parte do trabalho preparamos b-amino-ésteres a partir dos adutos de Morita-Baylis- Hillman (MBH). Utilizamos como estratégia uma reação de adição do tipo Michael com várias aminas. Os b-amino-ésteres foram obtidos com rendimentos variando de 78-93%. Os produtos foram caracterizados e a estereoquímica relativa foi determinada, por nOe, através da formação de um intermediário oxazinanona. Esses b-amino-ésteres são importantes intermediários para a síntese de heterociclos, tais como b-lactamas e oxazinanonas funcionalizadas. / Abstract: The b-piperonil-g-butirolactones are important synthetic intermediates, since they can be used as substrates for the synthesis of different type of lignans, a class of substances of great scientific interest. Lignans exhibit relevant biological activites, as anti-tumoral, anti-retroviral, anti-malarial, etc. In this work, studies have been carried out aiming at improving the diastereoselectivity for the preaparation of butirolactones having anti relative stereochemistry. A method to synthesize g-butirolactone have already been established in our laboratory. The methodology used was based on the the stereoselective reduction of a b-ketoester prepared from the oxidation of a a-cyanomethyl-b-hydroxy-ester. The latter was promptly prepared, in good yields, from a cyanide 1,4 addition over the double bond of Morita-Baylis-Hillman (MBH) adducts. In the second part of this work, we have prepared several b-amino-esters from Morita-Baylis- Hillman (MBH) adducts. The strategy was based also on a Michael addition of different amines over the double bond of MBH adducts. The b-amino-esters were obtained in good yield. Their stereochemistries were determined by nOe experiments of the corresponding oxazinanones. These b-amino-esters are important intermediates for the synthesis of heterocycles, as b-lactams and functionalized oxazinanones. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.

O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.

Orientadores: Mateus Borba Cardoso, Edvaldo Sabadin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T01:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JessicaFernandaAffonsode_M.pdf: 5384717 bytes, checksum: 6d1c629858f4001ec680da7a8614ad33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O trabalho aqui descrito teve como objetivo a obtenção de um sistema com duplo poder de inibição bacteriana baseado em nanopartículas de prata (AgNPs) recobertas com sílica mesoporosa (SM) para subsequente funcionalização com antibióticos b-lactâmicos. O agente b-lactâmico utilizado durante o desenvolvimento do projeto foi a ampicilina. Além disso, o trabalho teve como foco: (1) analisar o possível sinergismo da utilização das AgNPs e do antibiótico b-lactâmico contra bactérias suscetíveis à ampicilina e (2) investigar uma possível ação bactericida dos sistemas sintetizados contra Escherichia coli resistente ao agente b-lactâmico escolhido. Durante o trabalho, duas sínteses distintas para a obtenção das AgNPs foram testadas. A primeira delas é baseada na redução química dos íon Ag+ por boroidreto de sódio (NaBH4) utilizando citrato de sódio como agente protetor. Através desse método, não foi possível recobrir as AgNPs com sílica. No entanto, essa metodologia possibilitou estudar o fenômeno de crescimento e agregação parcial das nanopartículas sintetizadas. Dessa forma, a segunda alternativa para sintetizar as AgNPs foi baseada na redução química dos íons Ag+ em etileno glicol (EG), na presença de polivinilpirrolidona (PVP). Essa estratégia permitiu o recobrimento das AgNPs com sílica e essas nanopartículas foram então utilizadas para os procedimentos de funcionalização com a ampicilina. Foram realizados experimentos de atividade biológica com as bactérias Escherichia coli e Escherichia coli resistente à ampicilina (Gram-negativas) e Staphylococcus aureus (Gram-positiva), através da incubação do material juntamente com as bactérias, seguida pela cultura das mesmas em placas de ágar. Todos os materiais sintetizados apresentaram propriedades antibacterianas, que aumentam com o aumento da concentração dos materiais utilizados. A partir dos ensaios biológicos, foi possível observar que as nanopartículas de prata recobertas com sílica mesoporosa (Ag@SiO2) possuem elevado efeito antimicrobiano, ocasionando 100% de redução do número de colônias para todas as bactérias estudadas. Além disso, é possível notar que a funcionalização com ampicilina aumentou as propriedades bactericidas das nanopartículas de sílica e, em altas concentrações, o sistema de prata funcionalizado com ampicilina (Ag@SiO2-Ampicilina), apresentou resultados semelhantes ao seu respectivo precursor sem funcionalização. Uma explicação viável para a menor eficiência do sistema Ag@SiO2-Ampicilina em baixas concentrações pode estar relacionada à oclusão dos poros da sílica mesoporosa, ocasionada pelo processo de funcionalização, impedindo assim a lixiviação da prata iônica. Apesar dos resultados satisfatórios obtidos para o sistema Ag@SiO2-Ampicilina, ainda é preciso investigar uma alternativa que não ocasione a obstrução dos poros da sílica e, dessa forma não reduza o efeito da prata presente no sistema estudado / Abstract: The work described here aimed to obtain a dual bacterial inhibition system based on silver nanoparticles (AgNPs) coated with mesoporous silica (MS) for further functionalization with b-lactams antibiotics. Ampicillin was the b-lactam chosen for the project development. Moreover, this work is focused on: (1) analyzing the possible synergism of using AgNPs combined with b-lactam antibiotic against ampicillin susceptible bacteria and (2) investigating a possible bactericidal action of the synthesized systems against Escherichia coli strain which is resistant to b-lactam. Two different methodologies for AgNPs synthesis were tested. The first one is based on the chemical reduction of Ag+ ions by sodium borohydride (NaBH4) in the presence of sodium citrate as capping agent, which did not allow the silica coating. However, it allowed us to study growth and partial aggregation of these nanoparticles. Therefore, the second alternative to synthesize AgNPs was based on the chemical reduction of Ag+ ions solubilized by ethylene glycol (EG) in the presence of polyvinylpyrrolidone (PVP). This strategy allowed us coating the AgNPs with silica and these nanoparticles were used for functionalization with ampicillin. Biological activity experiments were conducted with Escherichia coli and Escherichia coli resistant to ampicillin (Gram-negatives) and Staphylococcus aureus (Gram-positive), through nanoparticles incubation test in tubes containing the bacteria, followed by culturing on agar plates. All synthesized materials showed antibacterial properties, which increase with increasing concentration of the materials tested. From the biological tests, it is observed that silver nanoparticles coated with mesoporous silica (Ag@SiO2) have high antimicrobial effect, promoting 100% reduction in the number of colonies for all bacteria studied. Furthermore, it is noticed that the functionalization with ampicillin increased the bactericidal properties of silica nanoparticles, and in high concentrations, silver functionalized with ampicillin (Ag@SiO2-Ampicillin) presented similar results to its respective precursor without functionalization. One possible explanation for the lower efficiency of the Ag@SiO2-Ampicillin system at low concentrations may be related to the occluded pores of mesoporous silica, caused by the functionalization process, while preventing the leaching of ionic silver. Despite the satisfactory results obtained for Ag@SiO2-Ampicillin system, it is still necessary to investigate an alternative which does not cause occlusion of silica pores and, consequently, does not reduce the effect of silver in the studied system / Mestrado / Físico-Química / Mestra em Química

Orientador: Maria Clara Padovese / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:51:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_GleiceCristina_M.pdf: 1716360 bytes, checksum: 2b5c8037802c8dcf2b8ce4fd235a1089 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Staphylococcus aureus é reconhecido como um dos principais patógenos humanos capazes de causar uma grande variedade de infecções. As infecções causadas pelo Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) tiveram grande aumento na última década. MRSA é capaz de produzir uma proteína ligadora de penicilina (PBP) específica, chamada PBP2a ou PBP2' que possui baixa afinidade de ligação aos antibióticos _-lactâmicos. Esta proteína é codificada pelo gene mecA, o qual é carreado por um elemento genético móvel, denominado cassete cromossômico estafilocócico (SCCmec) e está integrado ao cromossomo dos MRSA. Foram descritos cinco tipos de SCCmec, sendo eles tipo I, II, III, IV e V e seus variantes, onde o tipo IIIA é característico do clone endêmico brasileiro. Os objetivos do presente estudo foram identificar o perfil de SCCmec de um conjunto de amostras de MRSA obtidas de pacientes atendidos no Hospital das clínicas da Unicamp (HC-Unicamp), descrever sua distribuição nas diversas unidades do HC e comparar o perfil de SCCmec utilizando-se as técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR-multiplex) com o perfil genômico definido por meio de eletroforese em campo pulsado - Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE). Foram estudadas 99 amostras obtidas, por razões clínicas, no período de 1999 a 2004. Todas as amostras foram submetidas ao teste de difusão em disco para confirmação da resistência a oxacilina. Como resultados, foram identificados 26 diferentes perfis de PFGE e seus respectivos perfis relacionados. Os perfis genômicos apresentaram uma distribuição temporal, podendo ser agrupados em conjuntos clonais que foram substituídos ao longo do período, com exceção de uma única cepa, que apresentou ocorrências esporádicas durante o período do estudo. Dentre os 99 isolados, 92% apresentaram SCCmec tipo IIIA, característico do clone endêmico brasileiro e 7% apresentaram SCCmec tipo IV. A revisão de prontuários não indica fatores que possam sugerir aquisição extra-hospitalar das cepas estudadas / Abstract: Staphylococcus aureus has been recognized as an important human pathogen capable of causing a wide variety of infections. Infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) had greatly increased over the past decade. MRSA is capable of produce a specific penicillin-binding protein (PBP) called PBP2a or PBP2' that hold reduced affinities for binding to _-lactam antibiotics. This protein is encoded by the mecA gene, which is carried by a mobile genetic element, called staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and is integrated to the chromosome of MRSA. It has been described five types of SCCmec, which are type I, II, III, IV and V and its variants, where the type IIIA is characteristic of Brazilian endemic clone. The goals of the study were to identify the SCCmec type from a set of MRSA samples obtained from patients seeking assistance at Hospital das Clínicas da Unicamp (HC-Unicamp), to describe its distribution in various units of HC and to compare the SCCmec profile with the genomic profile defined using the polymerase chain reaction (PCR-multiplex) techniques and pulsed-field electrophoresis (PFGE), respectively. It was studied 99 samples collected for clinical reasons during a period that extended from 1999 to 2004. All the samples have been submitted to the disk diffusion test for oxacilina resistance confirmation. It was carried through PFGE for genomic evaluation and PCR-multiplex for SCCmec type detection. It have been found 26 different PFGE profiles and their respective related profiles which have presented a temporal distribution, showing clonal groups of strains that have been substituted throughout the period, except of only one strain that was present sporadically during all the period of the study. Among 99 isolated, 92% have shown SCCmec type IIIA, characteristic of Brazilian endemic clone and 7% have shown SCCmec type IV, in a way that all strains seem to have been acquired in the hospital environment / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

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La pipéracilline-tazobactam est une combinaison d’un antibiotique bêta-lactamine et d’un inhibiteur des bêta-lactamases fréquemment prescrite aux soins intensifs. Les patients admis aux soins intensifs présentent souvent une réponse très variable au traitement en raison des multiples changements pathophysiologiques présents dans cette population qui modifient le profil pharmacocinétique du médicament. La modélisation pharmacocinétique de population est une approche qui permet d’expliquer une partie de cette variabilité au moyen d’équations mathématiques. À l’aide d’un modèle pharmacocinétique, il est possible de décrire le devenir systémique du médicament à l’aide de paramètres clés comme la clairance et le volume de distribution. Également, ce type de modèle offre la possibilité d’effectuer des simulations de régimes posologiques pour faciliter l’atteinte des cibles thérapeutiques, dans une optique d’individualisation de la pharmacothérapie. Ce projet de maîtrise avait trois objectifs. Le premier était de documenter la variabilité associée à la pharmacocinétique de la pipéracilline-tazobactam aux soins intensifs en réalisant une revue de la littérature. Cette revue a pu relever certaines covariables significatives dans les modèles qui expliquaient une partie de la variabilité observée, comme la clairance de la créatinine et le poids. Le second avait pour but d’évaluer la performance prédictive des modèles pharmacocinétiques déjà disponibles dans la littérature pour la pipéracilline-tazobactam à l’aide d’une base de données indépendante. Parmi les modèles évalués, le meilleur a été retenu afin d’optimiser les régimes posologiques aux soins intensifs. Ainsi, grâce à ce modèle, un nomogramme prenant en considération la fonction rénale du patient a été développé pour faciliter l’atteinte des cibles thérapeutiques lors de l’administration de la pipéracilline-tazobactam. Finalement, le troisième objectif était d’évaluer l’impact d’une variation de la fraction libre de la pipéracilline-tazobactam sur la performance prédictive du modèle ainsi que son impact sur la pharmacocinétique du médicament. Cette évaluation a fait ressortir l’importance d’utiliser la concentration libre plutôt que d’utiliser la concentration totale de la pipéracilline-tazobactam pour le suivi thérapeutique, car l’assomption d’une fraction libre théorique unique pour tous les patients peut nuire à la prédiction adéquate des concentrations par un modèle pharmacocinétique en milieu clinique. / Piperacillin-tazobactam is a beta-lactam/beta-lactamase inhibitor antibiotic combination frequently prescribed in intensive care units. Admitted patients often show a large variability in treatment response due to multiple pathophysiological changes that alter the pharmacokinetic profile of the drug. Population pharmacokinetic modeling is an approach that can explain some of this variability using mathematical equations. Using a pharmacokinetic model, key parameters such as clearance and volume of distribution can be retrieved to describe the systemic exposure of the drug. Also, this type of model offers the possibility to perform simulations to find optimized dosing regimens that may facilitate the achievement of target concentrations to individualize drug therapy. This master's project had three objectives. The first was to document the variability in the pharmacokinetics of piperacillin-tazobactam in the intensive care unit by conducting a literature review. This review was able to highlight key covariates, such as creatinine clearance and body weight, that could explain the variability observed in this population. The second was to evaluate the predictive performance of pharmacokinetic models available in the literature for piperacillin-tazobactam using an independent database. Among the models evaluated, the best one was selected to offer optimized dosing regimens for critically ill patients. Thus, with this model, a nomogram that accounts for the patient's renal function was developed to facilitate the achievement of therapeutic targets of piperacillin-tazobactam. Finally, the third objective was to evaluate the impact of fluctuations in the unbound fraction of piperacillin-tazobactam on the predictive performance of the model as well as its impact on the pharmacokinetics of the drug. This evaluation highlighted the importance of using unbound piperacillin concentrations for drug monitoring over total concentrations, as applying a theoretical unbound fraction to every individual may hinder the predictive performance of pharmacokinetic model if it is used in a clinical setting.

[ES] Los fármacos pertenecientes a la familia de los ß-lactámicos son los antibióticos más usados en todo el mundo. Estudios recientes revelan que hasta un 10% de la población refiere haber presentado síntomas alérgico, esta porción de la población se considera "alérgica". En el diagnóstico de la alergia a antibióticos ß-lactámicos existen varios tipos de pruebas que sirven para orientar y confirmar la presencia de una alergia, clasificadas como ensayos in vivo e in vitro. En lo que se refiere a los ensayos in vivo, la detección de los procesos alérgicos más comunes se realiza mediante pruebas de exposición oral controladas, y pruebas intraepidérmicas e intradérmicas. No obstante, estas pruebas tienen sus limitaciones como es el riesgo de inducir reacciones alérgicas sistémicas graves. Por todo ello, su práctica requiere personal entrenado. Este requisito limitan la realización de este tipo de pruebas a centros hospitalarios especializados. La aplicación y desarrollo de técnicas de diagnóstico in vitro tiene como objetivo llegar a un diagnóstico de la alergia sin riesgos para el paciente. Entre las distintas pruebas serológicas y celulares que se pueden emplear, la detección de IgE específica es una de las más extendidas debido a que, dada su sensibilidad y especificidad, y mayor seguridad. Los sistemas de diagnóstico in vitro actuales utilizan una instrumentación analítica cara y de gran tamaño, así como materiales desechables caros, manejados por personal cualificado, por lo que este tipo de pruebas se realizan únicamente por servicios de alergia y/o análisis clínicos de grandes centros sanitarios. En consecuencia, hay una necesidad de desarrollar nuevos métodos de diagnóstico que cumplan los requisitos de sensibilidad, rapidez, sencillez, multiplexado y portabilidad, a un precio reducido para su implantación en todo tipo de laboratorios clínicos de los diferentes niveles de atención sanitaria. Por este motivo, en esta tesis doctoral se plantea como objetivo principal la puesta a punto de un inmunoensayo múltiple, utilizando la tecnología de disco compacto para la detección y cuantificación in vitro de niveles de IgE específica a un amplio espectro de antibióticos ß-lactámicos en muestras de suero humano. Las limitaciones más críticas para la determinación de IgE específica multianalito mediante métodos inmunoquímicos son las relacionados con la sensibilidad y selectividad. Por lo tanto, una parte importante de la tesis se ha centrado en la preparación y caracterización de un panel antígenos ß-lactámicos, selección de inmunoreactivos, formato y estudio de diferentes parámetros claves del inmunoensayo. Otra parte importante de la tesis se ha enfocado en abordar la mejora de la reproducibilidad de los resultados. La estrategia ha consistido en estudiar diferentes sistemas de calibración con el objetivo de estandarizar la cuantificación de los métodos in vitro de diagnóstico de este tipo de alergias. Para ello, se han evaluado las prestaciones de la calibración homóloga, heteróloga y el uso de un patrón interno, comparado sus prestaciones analíticas (relación señal ruido, sensibilidad, reproducibilidad, etc.) con el sistema de referencia. Finalmente, la validación del inmunoensayo se realizó con un conjunto de 101 muestras de suero de pacientes y controles. Los resultados obtenidos han sido comparados con los obtenidos mediante las técnicas de referencia, mostrando una mejor sensibilidad, especificidad, precisión, y linealidad. La capacidad múltiplex de la tecnología de disco compacto permitió llevar a cabo paralelamente estudios de reactividad cruzada frente a diferentes antibióticos ß-lactámicos esclareciendo el patrón de reconocimiento de los pacientes. En esta línea de trabajo, el uso de otras estrategias de conjugación de haptenos ha resultado en la mejora de la sensibilidad clínica del ensayo, identificando nuevos epítopos / [CA] Els fàrmacs que pertanyen a la família dels beta-lactams, són els antibiòtics d'us més estès a tot el món. Estudis recents posen de manifest que fins un 10% de la població ha presentat símptomes d'al·lèrgia, essent considerats població al·lèrgica als beta-lactams. En el diagnòstic de l'al·lèrgia front aquest tipus d'antibiòtics, existeixen diferents tipus de proves que serveixen per orientar i confirmar la presència d'una al·lèrgia, classificades com assajos in vivo i in vitro. Pel que fa als assajos in vivo, la detecció dels processos al·lèrgics més comuns es realitza mitjançant proves d'exposició oral controlades, i proves intra-epidèrmiques i intradèrmiques. No obstant això, aquestes proves tenen les seues limitacions com és el risc d'induir reaccions al·lèrgiques sistèmiques greus. Per tot això, la seua pràctica requereix personal entrenat. Aquests requisits limiten la realització d'aquesta mena de proves a centres hospitalaris especialitzats. L'aplicació i desenvolupament de tècniques de diagnòstic in vitro té com a objectiu arribar a un diagnòstic de l'al·lèrgia sense riscos per al pacient. Entre les diferents proves serològiques i cel·lulars que es poden emprar, la detecció d'IgE específica és una de les més esteses donada la seua sensibilitat, especificitat, i major seguretat. Els sistemes de diagnòstic in vitro actuals utilitzen una instrumentació analítica cara i de gran grandària, així com materials d'un sol ús també cars, que requereixen de personal qualificat, per la qual cosa aquest tipus de proves es realitzen únicament per serveis d'al·lèrgia i/o anàlisis clíniques de grans centres sanitaris. En conseqüència, hi ha una necessitat de desenvolupar nous mètodes de diagnòstic que complisquen els requisits de sensibilitat, rapidesa, senzillesa, multiplexatge i portabilitat, a un preu reduït per a la seua implantació en tota mena de laboratoris clínics dels diferents nivells d'atenció sanitària. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral es planteja com a objectiu principal la posada a punt d'un immunoassaig múltiple, utilitzant la tecnologia de disc compacte per a la detecció i quantificació in vitro de nivells d'IgE específica a un ampli espectre d'antibiòtics ß-lactáms en mostres de sèrum humà. Les limitacions més crítiques per a la determinació d'IgE específica multianàlit mitjançant mètodes inmunoquímics estan directament relacionades amb la sensibilitat i selectivitat. Per tant, una part important de la tesi s'ha centrat en la preparació i caracterització d'un panell antígens ß-lactáms, selecció d'inmunoreactius, del format d'assaig i estudi de diferents paràmetres claus de l'immunoassaig. Una altra part important de la tesi s'ha enfocat a abordar la millora de la reproductibilitat dels resultats. L'estratègia ha consistit a estudiar diferents sistemes de calibratge amb l'objectiu d'estandarditzar la quantificació dels mètodes in vitro de diagnòstic d'aquesta mena d'al·lèrgies. Per a això, s'han avaluat les prestacions del calibratge homòleg, heteròleg i l'ús d'un patró intern, comparant les seues prestacions analítiques (relació senyal soroll, sensibilitat, reproductibilitat, etc.) amb el sistema de referència. Finalment, la validació de l'immunoassaig es va realitzar amb un conjunt de 101 mostres de sèrum de pacients i controls. Els resultats obtinguts han sigut comparats amb els obtinguts mitjançant les tècniques de referència, mostrant una millor sensibilitat, especificitat, precisió, i linealitat. La capacitat múltiplex de la tecnologia de disc compacte va permetre dur a terme paral·lelament estudis de reactivitat creuada enfront de diferents antibiòtics ß-lactáms esclarint el patró de reconeixement dels pacients. En aquesta línia de treball, l'ús d'altres estratègies de conjugació d'haptens ha resultat en la millora de la sensibilitat clínica de l'assaig, identificant nous epítops / [EN] ß-lactam antibiotics are one of the most widely used antimicrobials worldwide. However, up to 10% of the population reports having presented allergic symptoms derived from their consumption. Consequently, this portion of the population is considered "allergic". In the diagnosis of allergy to ß-lactam antibiotics there are several types of tests that serve to orient and confirm the presence of an allergy. These diagnostic methods are classified as in vivo and in vitro assays. Regarding in vivo tests, the most standardized tests are the provocation, prick and intradermal test. The aim of these assays is to observe the response produced by the different beta-lactam antibiotics in the patient after oral or cutaneous administration. Despite their wide use, these tests have their limitations, such as the risk of inducing severe systemic allergic reactions. Therefore, their practice requires specialized professionals for their indication, performance and interpretation. This requirement limit the performance of this type of test to specialized hospitals. The use and development of in vitro diagnostic techniques can overcome these disadvantages and allow the diagnosis of allergy without risks. In vitro assays are less invasive and therefore neither pose a risk of adverse reactions. Among the different serological and cellular tests that can be used, the detection of specific IgE is one of the most widespread due to its sensitivity and specificity. Current in vitro diagnostic systems use expensive and bulky analytical instrumentation and high-cost single-use materials, handled by qualified professionals. Therefore, such tests are performed only by allergy and/or clinical analysis services of hospitals or by companies specialized in clinical diagnostics. Consequently, there is a need to develop new diagnostic methods that can be implemented in all types of clinical laboratories at diverse levels of health care, meeting the requirements of sensitivity, speed, simplicity, multiplexing and portability at a reduced price. For this reason, the main objective of this doctoral thesis is the development of a multiplex immunoassay using compact disc technology for the detection and quantification of specific IgE levels to a wide variety of ß-lactam antibiotics in human serum samples. The most crucial limitations for the determination of multianalyte specific IgE by immunochemical methods are those related to sensitivity and selectivity. Hence, an important part of the thesis has been focused on the preparation and characterization of a pool of beta-lactam antigens, selection of immunoreagents, format and optimization of different critical parameters of the immunoassay. Another important aspect of the thesis has been focused on improving the reproducibility of the results. The strategy consisted of studying different calibration systems with the aim of standardizing the quantification of in vitro diagnostic tests for this type of allergy. To achieve that goal, the performance of homologous and heterologous calibration and the use of an internal standard have been evaluated, comparing their analytical performance (signal-to-noise ratio, sensitivity, reproducibility, etc.) with the reference system. Finally, the validation of the immunoassay was performed with a total of 101 serum samples from patients and controls. The results obtained have been compared with those obtained using the reference techniques, showing improved sensitivity, specificity, precision, and linearity. The multiplex capability of the compact disc technology allowed carrying out parallel cross-reactivity studies against different beta-lactam antibiotics both from the penicillin family and from other families, elucidating the recognition profile. Following this working line, the use of other hapten conjugation strategies improved clinical sensitivity of the assay by identifying new epitopes. / Juárez Rodriguez, MJ. (2022). Metodologías bioanalíticas para el diagnóstico in vitro de alergia a antibióticos ß-lactámicos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/184011 / Premios Extraordinarios de tesis doctorales