Cette thèse caractérise les propriétés optiques des matériaux plasmoniques microstructurés et procède à l’évaluation des paramètres analytiques afin de les employer comme plateforme de biodétection en spectroscopie de résonance des plasmons de surface (SPR). Aux dimensions micrométriques, les matériaux plasmoniques présentent des caractéristiques optiques propres aux nano- et macromatériaux. La cartographie physicooptiques en SPR de matériaux méso- et microscopiques s’est effectuée à l’aide de films structurés de motifs périodiques triangulaires et circulaires fabriqués par une technique modifiée de lithographie par nanosphères (nanosphere lithography, NSL). À partir de cette vue d’ensemble, quelques films structurés ont été sélectionné en fonction d’aspects analytiques tels que la sensibilité et la résolution face aux variations d’indice de réfraction (RI) pour déterminer le potentiel de ces matériaux comme plateforme de biodetection. Les propriétés optiques distinctes des films microstructurés proviennent d’interactions résonantes entre les modes de plasmons de surface (SP) localisé et délocalisé identifiés par la relation de dispersion en SPR ainsi que l’imagerie Raman. Les conditions de résonance des modes SP dépendant de paramètres expérimentaux (λ, θ, η) tel qu’observés numériquement par rigorous coupled wave analysis (RCWA) et empiriquement. Ces travaux démontrent la nature plasmonique distincte des micro-matériaux et leur potentiel d’intégration aux techniques analytiques SPR existantes. Les matériaux plasmoniques micrométriques furent également étudiés pour l’implémentation de la SPR à une pointe de microscopie à force atomique (atomic force microscopy, AFM) combinant ainsi la spectroscopie à l’imagerie topographique. Des travaux préliminaires se sont concentrés sur la signature spectroscopique de leviers en silicium (Si) et en nitrure de silicium (Si3N4), l’impact d’un revêtement d’or sur les pointes et l’influence de milieu environnant. Une image d’origine plasmonique a été obtenue avec des leviers en Si3N4 revêtus d’or en transmission dans un environnement aqueux, indiquant ainsi le potentiel de ces pointes comme micro-biocapteur SPR. Ces résultats préliminaires servent de fondement pour orienter les prochaines investigations dans ce projet. / This thesis characterizes the optical properties of microstructured plasmonic materials and evaluates analytical parameters to use them as biosensing platforms in surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. At microscopic dimensions, plasmonic materials present optical characteristics unique to nano- and macromaterials. A SPR physico-optic mapping of meso- and microscopic materials was performed using structured films with triangular and circular periodic patterns fabricate by modified nanosphere lithography (NSL) technique. From this overview, a few structured films were selected based on analytical aspects such as sensitivity and resolution with respect to the refractive index (RI) to determine the potential of these materials as biosensing platforms. The distinct plasmonic properties of microstructured films emerge from resonant interactions between localized and propagating surface plasmons (SP) modes identified by the SPR dispersion relation and by Raman imaging. The conditions of SP modes resonant interactions depend on experimental parameters (λ, θ, η) as observed numerically in rigorous coupled wave analysis (RCWA) and empirically. These works show the distinct plasmonic nature of micromaterials and their potential integration to existing SPR techniques. Plasmonic micromaterials were also studied for the implementation of SPR to an atomic force microscopy (AFM) cantilever, hence combining spectroscopy to topographic imaging. Preliminanry works were focused on the spectroscopic response of silicon (Si) and silicon nitride (Si3N4) cantilever, the impact of gold coating on the cantilever is tip, and the influence of the adjacent environment. An image of plasmonic nature was obtained in transmission spectroscopy with gold coated Si3N4 cantilever in water environment, thus indicating the potential of these cantilevers as micro-SPR sensing probes. These preliminary results provide a basis to guide future investigations in this project.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Notre projet vise la conception d'un biocapteur ultra-sensible à base de bactéries pour la détection de métaux lourds (contrôle environnemental). Ces travaux concernent le développement de systèmes impédimétriques et à ondes acoustiques de Love, associés à une puce microfluidique et fonctionnalisés par des bactéries Escherichia coli immobilisées sur une multicouche de polyélectrolytes déposés par la méthode " Layer by Layer " . L' étude fondamentale des interactions physiques-chimiques-biologiques mises en jeu lors des étapes de fonctionnalisation du capteur, et de son application à la détection de cadmium et de mercure, est également abordée, à travers le suivi en temps réel par le capteur acoustique, ainsi que par microscopie à force atomique en milieu sec ou liquide.Des seuils de détection inférieurs à 10-12M en quelques minutes ont été observés.

Dans le cadre de la protection de l'environnement, l'eau et l'atmosphère sont deux milieux particulièrement surveillés. La réglementation impose la détection et le dosage d'une liste de produits mais les besoins analytiques sont considérables. Les méthodes biotechnologiques présentent l'avantage d'indiquer l'impact du produit sur la matière vivante. Ces méthodes sont mises en œuvre au laboratoire ou sur site. La détection d'une toxicité globale ou ciblée, <i>in situ</i> et en temps réel, est privilégiée. Les biocapteurs sont des outils répondant à cette attente. Au cours de l'étude, deux biocapteurs, l'un ampérométrique, l'autre fluorimétrique sont conçus. Tous deux intègrent le même biorécepteur, <i>Chlorella vulgaris</i>. Une nouvelle méthode d'immobilisation des micro-algues est mise au point. Elle permet d'obtenir des lots de membranes reproductibles, fonctionnelles 7 jours, donnant une réponse <i>in vivo</i> à valeur statistique, réutilisables et conservables. Des essais conduits sur des thylakoïdes extraits des cellules végétales ne donnent pas d'aussi bons résultats. L'association des membranes algales avec les deux types de transducteur montre que <i>Chlorella vulgaris</i> est sensible à des produits divers : herbicides, métaux, solvants. Les limites de détection pour des herbicides sont particulièrement basses, inférieures aux normes. Pour plusieurs produits testés, des courbes d'étalonnage sont données. Les deux types de biocapteur fonctionnent en milieu aqueux, en mode batch et en mode flux. Le biocapteur de fluorescence algale à fibres optiques possède des qualités de reproductibilité et de maniabilité plus intéressantes que le biocapteur ampérométrique. Le biocapteur de fluorescence est testé sur des lixiviats de bois, solutions naturelles complexes ; le biocapteur ampérométrique est adapté à l'utilisation en phase gazeuse, il détecte alors le méthanol vapeur et le perchloroéthylène en aérosol. Une autre partie de l'étude consiste à caractériser l'impact des toxiques sur <i>Chlorella vulgaris</i>. L'analyse est conduite en microscopie électronique à balayage et en microscopie optique couplée à l'analyse d'images. Ces deux méthodes originales restent à perfectionner. Les résultats de nos essais préliminaires semblent encourageants pour la détection du produit toxique et l'accès à son mécanisme d'action.

Dans cette thèse, des travaux de recherche ont été menés pour immobiliser différentes enzymes (oxydases et déshydrogénases) au sein d'une matrice de silice dans le but de construire un biocapteur ampérométrique. Des matériaux nanostructurés ont ensuite été introduit dans ce système afin d'améliorer les caractéristiques analytiques de ces biocapteurs. La méthode de dépôt sol-gel par assistance électrochimique a été choisie pour l'immobilisation des enzymes à la surface des électrodes et des nanomatériaux car elle donne la possibilité de contrôler finement l'épaisseur du film déposé afin de couvrir individuellement ces objets. La faisabilité de cette approche a été montrée par la modification de nanofibres de platine présentant une grande surface active pour l'oxydation de H2O2 produit en présence de biocomposite silice-glucose oxidase. Le dépôt sol-gel électrochimiquement assisté permet également la modification d'électrodes imprimées en or par un biocomposite silice-choline oxidase, ce qui donne la possibilité de construire rapidement un biocapteur à choline présentant de très bonnes caractéristiques analytiques. Les nanotubes de carbone ont également été choisis comme matrice pour l'immobilisation de déshydrogénases car ils permettent d'obtenir une grande aire spécifique et des propriétés catalytiques intéressantes pour l'oxydation du co-facteur enzymatique NADH. La méthode de dépôt électrophorétique a été utilisée pour créer des couches de nanotubes poreuses ayant une épaisseur contrôlée à la surface d'un support de carbone vitreux. Les électrodes ainsi préparées présentent de bonne performances électrochimiques, permettant notamment de déplacer le potentiel d'oxydation de NADH et d'augmenter la sensibilité de détection. Un biocomposite silice-sorbitol déshydrogénase a ensuite été déposé à la surface de la couche de nanotubes de carbone en utilisant la méthode de dépôt sol-gel assisté par électrochimie pour construire un biocapteur à sorbitol. La méthode de dépôt électrophorétique a enfin été appliquée pour la première fois à l'élaboration d'assemblages de nanotubes de carbone macroporeux. De tells assemblages ont été utilisés comme support pour co-immobiliser la sorbitol déshydrogénase et le co-facteur enzymatique au sein des macropores, ce qui a permis d'augmenter la sensibilité de la détection du sorbitol par comparaison avec un assemblage de nanotubes de carbone non macroporeux / In this thesis, the research work was focused on the immobilization of different enzymes (oxidases and dehydrogenases) into biocomposite silica matrix with the aim of amperometric biosensors construction. Then, the structured nanomaterials were introduced in the system in order to improve the characteristics of biosensors. The method of electrochemically-assisted deposition was chosen for the immobilization of enzymes on the surface of nanomaterials as it provides possibility of fine tuning of film thickness allowing covering each individual nanoobject. The feasibility of this was shown while modifying the platinum nanofibers, which demonstrate high electroactive surface and H2O2 oxidation rate, with silica-glucose oxidase biocomposite. The electrochemically-assisted deposition also allows the express modification of gold screen-printed electrodes with silica-choline oxidase biocomposite making possible the quick fabrication of cheap choline biosensors with high analytical characteristics. The carbon nanotubes was chosen as matrix for the immobilization of dehydrogenases as they have high surface area and electrocatalytic properties towards the oxidation of enzymatic co-factor NADH. The method of electrophoretic deposition was used for the creation of porous CNT-layer with controllable thickness on the surface of glassy carbon electrode. Created thereby matrix demonstrated good electrochemical performance significantly shifting the potential and increasing sensitivity of NADH oxidation. Then the biocomposite silica-sorbitol dehydrogenase film was deposited on the CNT-layer by means of electrochemically-assisted deposition for the construction of high-performance sorbitol biosensor. The method of electrophoretic deposition was also applied for the first time for the construction of thick macroporous CNT-assemblies with uniform pore size using template approach. Such macroporous CNT-electrode was used for the co-immobilization of sorbitol dehydrogenase and enzymatic co-factor inside the pores demonstrating higher sensitivity of sorbitol detection in comparison with nonporous CNT-electrode

Les protéines régulatrices de la transcription de type LysR (LTTR) appartient à la plus grande famille de facteur de transcription chez les procaryotes. Malgré l'importance de cette famille, les informations structurelles sur les protéines pleine-longueur sont très limitées car elles sont souvent insolubles et très difficiles à cristalliser. Les quelques structures existantes, couplés à d'autres analyses biophysiques ont pu montrer que ces protéines s'associent principalement sous forme d'homotétramère comprenant un dimère de dimères. Les dimères s'associent par un large domaine C-terminal dans une position " tête-bêche " et sont reliés en " tête-à-tête " par leurs domaines N-terminal et sont activées par la liaison de molécules inductrices. Le domaine dimèrique C-terminal qui contient la poche de liaison inductrice (Inducer Binding Cavity : IBC) est appelé domaine de liaison inductrice (Inducer Binding Domain : IBD), tandis que les dimères N-terminaux se lient chacun à une région de l'ADN par un motif hélice-tour-hélice ‘winged' (wHTH). Contrairement à d'autres facteurs de transcription, les protéines LTTR ne régulent pas l'expression par association/dissociation avec l'ADN. Ils se lient à l'ADN dans leur état actif et inactif. Le consensus actuel est qu'elles régulent l'expression des gènes par d'importants changements conformationnels qui relâchent la liaison avec l'ADN. À ce jour, aucune structure de LTTR pleine longueur homotétramérique dans une conformation active ou inactive n'a été résolu par cristallographie, et leur mécanisme d'action sur le gène reste structurellement non caractérisé.Le travail décrit dans cette thèse a utilisé DntR de la famille des LTTR. La première structure cristalline de l'apo-DntRis est présentée ici, ainsi que la structure du mutant H169TDntR, qui présente une activité en l'absence d'inducteur. L'analyse par fluorimétrie de différentiel thermique (TSA) montre que la température de dénaturation du mutant H169TDntR est similaire à DntR IBDs lié à une molécule inductrice. La comparaison de ces deux structures avec celle de DntR lié au salicylate révèle que la protéine dans son état apo adopte une conformation compacte de l'IBC, ce qui empêche la liaison d'une molécule inductrice. Dans l'IBC, les mouvements des résidus H169 et H206 permettent la liaison à l'inducteur. Pour éviter les limitations dues à l'empaquetage du cristal nous avons étudié la structure DntR en solution par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS).L'étude SAXS de DntR révèle que dans son état inactif, la conformation apo adopte un repliement plus compact par rapport à celle de la structure cristalline. Tout en maintenant un noyau compact de C-terminal, le repliement du dimère de wHTH est beaucoup plus fermé que dans la structure cristalline et adopte une conformation qui entrainerait une flexion beaucoup plus importante de l'ADN lié que postulé précédemment. Les études du mutant H169TDntR constitué actif ont confirmé comme l'analyse par TSA l'a suggéré que, la structure de cette protéine est nettement différente en solution que sous forme cristalline.En effet, la structure en solution de H169TDntR est très semblable à la forme ouverte de l'homotétramères observés dans la structure cristalline de TsaR. L'hypothèse de départ était que, lors de l'activation de LTTR, cet homotétramère subirait un changement de conformation d'une forme compact vers une forme ouverte, qui se traduirait par un relâchement de l'ADN lié. Cette hypothèse a été confirmée par des études de diffusion en solution de DntR activée par un inducteur.Le travail présenté dans cette thèse valide l'hypothèse précédemment, que lors de l'activation de DntR, et probablement tous les LTTRs homotétramériques, entraine un changement de conformation d'une forme compacte vers une forme beaucoup plus ouverte et permet l'accès aux régions promotrices par l'ARN polymerase et ainsi initier la transcription. / LysR type transcriptional regulatory (LTTR) proteins are the largest family of transcription factors amongst prokaryotes. In spite of the size of the family, structural information on full-length constructs of these proteins is very limited as they are often insoluble and very difficult to crystallize. From the few existing crystal structures, coupled with other biophysical evidence, it is known that the proteins mainly associate as homotetramers comprising a dimer of dimers. The dimers associate through large C-terminal domains in a “head-to-tail” fashion and are connected “head-to-head” through their N-terminal domains and the resulting homotetramers are activated by the binding of inducer molecules. Each C-terminal domain contain an inducer binding cavity (IBC) and is denoted an inducer binding domain (IBD), while the N-terminal dimers each bind a region of DNA via a winged helix-turn-helix (wHTH) motif.Unlike other transcription factors, LTTR proteins do not regulate expression by associating or disassociating with DNA. They bind to DNA in both their active and inactive states and the current consensus is that they regulate gene expression through large conformational changes that relax the bending of bound DNA. However, to this date, no crystal structures of a full length homotetrameric LTTR in both an active and inactive conformation exists, and thus their mechanism of transcriptional regulation remains structurally uncharacterized.The work described in this thesis has used the LTTR DntR as a model protein to futher structurally characterizes the activation mechanism of LTTR proteins. The first crystal structure of apo-DntR is presented as is the crystal structure of H169TDntR, a mutant which shows activity in the absence of an inducer molecule. Thermofluor assays performed on this mutant, show that it has a melting temperature similar to that of inducer bound DntR. Comparison of these crystal structures with the crystal structure of salicylate-bound DntR reveals that the protein in its apo-state adopts a compact IBC, which precludes the binding of an inducer molecule. Despite the evidence of thermofluor assays, the crystal structure of H169TDntR is very similar to that of apo-DntR suggesting that crystal packing effects impose strong limitations on the use of crystallography to elucidate the active and inactive conformations of DntR. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) was thus used to study the structure of DntR in solution.SAXS study reveals that in solution DntR in its inactive apo-state is found in a slightly different conformation compared to that seen in its crystal structure. While maintaining a compact tetrameric C-terminal core the DNA binding wHTH dimers pack much closer to this than seen in the crystal structure and adopt a conformation that would result in much higher bending of bound DNA than previously postulated.SAXS studies of the constitutively active H169TDntR mutant confirm, as thermofluor assays had suggested, that in solution the structure of this protein is markedly different from its crystal structure. Indeed the solution structure of H169TDntR appears very like that of open-form homotetramers seen in the crystal structure of TsaR. This same effect was observed in solution scattering studies of inducer bound-and thus activated, DntR.The work presented in this thesis thus appears to confirm, as previously hypothesized, that upon activation DntR, and presumably all homotetrameric LTTRs, undergo a conformational change from a compact, to a much more open form that allows the relaxation of the bound DNA promoter region, exposing it to solvent and allows RNA polymerase access and thus initiate transcription.

Le travail présenté dans cette thèse porte sur le développement de chimie de surface et de biocapteurs pouvant être utilisés dans le milieu hospitalier afin d’améliorer les méthodes de dépistages et de suivi de traitement de diverses maladies et cancers. Les méthodes actuelles de dépistage du cancer reposent principalement sur l’analyse histologique des cellules par des experts dans le domaine. Cela complique la transmission de l’information au patient et retarde le moment où un traitement approprié peut être entamé. Grâce à de nouvelles techniques d’analyses simples et peu coûteuses comme la spectroscopie de résonance des plasmons de surface (SPR), il est possible de développer des tests qui pourront être effectués par le personnel de l’hôpital, en peu de temps et à peu de frais. Afin de pouvoir utiliser la SPR en milieu clinique, une chimie de surface appropriée doit être développée afin d’empêcher les matrices biologiques de masquer le signal des analytes d’intérêt. En effet, qu’il s’agisse de lysat cellulaire, de sérum ou de tout autre fluide biologique, le contenu protéique et lipidique peut s’adsorber de façon non-spécifique aux surfaces d’analyse, compromettant ainsi les résultats obtenus. Afin de pallier ce problème, le développement de chimie de surface a été effectué. Des monocouches de peptides et de liquides ioniques ont été utilisées afin de réduire l’adsorption non-spécifique de lysat cellulaire non-dilué sur des capteurs SPR. Parmi les peptides, le plus efficace s’est avéré être le 3 MPA (His)2(Leu)2(Phe)2 OH, un peptide chargé positivement formé de 6 acides aminés plutôt hydrophobes. Grâce à cette surface, l’adsorption non-spécifique de lysat cellulaire a pu être réduite jusqu’à 159 ± 27 ng/cm2, par rapport à 929 ± 186 ng/cm2 sur une surface d’or non protégée. Une étude en spectrométrie de masse a permis de mieux comprendre le phénomène d’adsorption non-spécifique de lysat cellulaire et de confirmer que ce sont principalement des lipides qui s’adsorbent non-spécifiquement au capteur SPR lorsque celui-ci est exposé à du lysat cellulaire. Malgré la nette amélioration par rapport à un capteur non protégé, le phénomène d’adsorption non-spécifique était encore significativement présent avec les monocouches de peptides. L’adsorption non-spécifique de lysat cellulaire a ensuite été drastiquement réduite grâce aux liquides ioniques hydrophobes et chargés. Le liquide ionique le plus performant a montré une adsorption non-spécifique d’à peine 2 ± 2 ng/cm2. Par la suite, un biocapteur permettant la détection de HER2, un biomarqueur de cancer du sein présent dans environ 30% des cas de cancers du sein agressifs, a été développé. Cela a permis de démontrer que le liquide ionique pouvait être utilisé pour la construction d’un biocapteur, ouvrant ainsi la porte à un large domaine d’analyses en lysat cellulaire. Finalement, les défis de l’analyse SPR avec des échantillons cliniques ont été explorés par le développement d’un biocapteur pour l’anti-asparaginase, permettant de faire le suivi de traitement de patients atteints de leucémie. L’asparaginase est administrée aux patients leucémiques, en combinaison avec plusieurs autres composés chimiothérapiques, afin de combattre ce cancer. Toutefois, plusieurs patients ont une réaction allergique à cette protéine de source bactérienne, mais ne démontrent pas de symptômes physiques. Le biocapteur développé visait donc à détecter les réactions immunitaires des patients afin de modifier leur traitement lorsque cela s’avère nécessaire. Un biocapteur pour la détection de l’anti-asparaginase dans le sérum non-dilué de patients leucémiques a donc été développé. Des échantillons cliniques ont été étudiés et les résultats obtenus pour le nouveau biocapteur SPR ont montré une bonne concordance avec les résultats obtenus en ELISA. / This thesis describes the development of clinical biosensors. These biosensors were developed with the aim of improving diagnostic and treatment monitoring methods. Actual monitoring methods often rely on histological analysis performed by experts. This complicates the transmission of the information to the patient and delays the onset of an appropriate treatment. It is envisioned to develop simple experiments at low cost, which will allow untrained personnel to perform the testing on-site with biosensing technologies such as surface plasmon resonance (SPR). In order to perform SPR in clinical analysis, appropriate surface chemistry must be developed to prevent nonspecific adsorption. Nonspecific adsorption is the fouling of surfaces with biomolecules contained in the sample matrix such as proteins or lipids of biofluids. This leads to false positive signals preventing the correct measurement of the analyte concentration. Peptide and ionic liquid monolayers have been studied in this thesis to prevent nonspecific adsorption of undiluted cell lysate. The most efficient peptide was the 3 MPA (His)2(Leu)2(Phe)2 OH peptide, a 6 amino acids hydrophobic and positively charged peptide. The nonspecific adsorption of cell lysate was reduced to 159 ± 27 ng/cm2, compared to 929 ± 186 ng/cm2 on a bare gold surface. Also, mass spectrometry was performed to better understand the cell lysate nonspecific adsorption phenomenon. This study showed lipids were mostly adsorbed on the sensor when exposed to cell lysate. Despite a significant reduction of nonspecific adsorption with peptides, it remained unoptimal and should be improved. The newly developed hydrophobic and charged ionic liquids nearly eliminated the nonspecific adsorption of undiluted cell lysate, with only 2 ± 2 ng/cm2 of nonspecific material adsorbed on the surface. Then, a biosensor of an aggressive breast cancer biomarker, HER2, was developed. This proved that the ionic liquids could be used in the development of clinical biosensors. Finally, the challenges of the analysis of clinical samples with SPR sensing were explored with the development of an anti-asparaginase biosensor for leukemic patients. Asparaginase is a chemotherapeutic drug administered to patients in combination with various other drugs to treat leukemia. However, many patients suffer from silent allergic reactions due to the bacterial source of this drug. Therefore, a biosensor was developed to detect the antibodies in undiluted serum produced against the drug, which could ultimately serve to modify the patient’s treatment when necessary. Clinical samples from leukemia patients were studied and the results were in good agreement with ELISA experiments.

La gestion des eaux pluviales constitue un défi important à relever dans les villes du monde entier : aujourd’hui on ne compte plus les problèmes d’inondation et de pollution, problèmes chroniques qui tendent à s’amplifier à mesure que l’urbanisation grandit en parallèle du changement climatique. Une gestion durable de ces eaux est au cœur des enjeux du XXIe siècle et afin de faire face à ces problèmes le Ministère de l’Écologie et du Développement Durable a engagé une opération de recherche sur cette thématique. Parmi les problèmes posés par les eaux pluviales, notre étude se focalise sur les rejets urbains de temps de pluie (RUTP). Ces rejets constituent un apport important et imprévisible de nombreux polluants pour les masses d’eaux réceptrices. La pollution des RUTP est étudiée depuis de nombreuses années et, alors que les connaissances en la matière s’affinent, il n’existe à l’heure actuelle aucune étude de grande ampleur permettant d’identifier l’impact des RUTP sur les écosystèmes récepteurs. Notre travail a consisté à étudier l’impact environnemental de différents échantillons de RUTP collectés sur 3 sites d’assainissement pluvial de l’agglomération lyonnaise. Pour cela nous avons sélectionné des bioindicateurs pertinents, les microalgues d’eau douce, organismes unicellulaires à la base des chaînes trophiques et très sensibles aux polluants présents dans les RUTP. Nous avons réalisé des bioessais écotoxicologiques connus de la littérature et contribué au développement de nouveaux indicateurs de toxicité complémentaires. De plus nous avons cherché à adapter ces bioessais pour permettre leur utilisation sur le terrain. En parallèle nous avons travaillé à l’amélioration d’un biocapteur enzymatique à cellules algales. Ses performances ont été évaluées sur des échantillons de RUTP avant d’œuvrer à la construction d’une station automatisée qui nous a permis de réaliser des mesures directement sur les sites d’assainissement (on line monitoring). Ce travail contribue à mettre en évidence l’impact important des RUTP sur le milieu récepteur tout en confirmant le caractère hétérogène de ce type d’effluent et l’intérêt des dispositifs de surveillance in situ. / The stormwater management constitutes an important challenge for cities around the world: today there are countless problems of flooding and pollution, chronic problems that tend to amplify as urbanization grows. Sustainable management of these waters is at the heart of defies of the twenty-first century and to address these problems the Ministry of Ecology and Sustainable Development has launched a research operation. Among problems posed by stormwater, our study focuses on urban wet weather discharges (UWWD). These releases are an important and unpredictable contribution of many pollutants to the receiving water bodies. UWWD's pollution has been studied for many years and, while knowledge in the field matures, there is at present no large-scale study to identify the impact of UWWD on the receiving ecosystems. Our work consist in studying the impact of different UWWD samples collected at 3 storm sanitation sites of Lyon on the environment. We have relevant bioindicators, freshwater microalgae, unicellular organisms at the base of the trophic chain and very sensitive to pollutants present in the UWWD. We have undertaken ecotoxicological bioassays known from the literature and contributed to the development of new indicators of toxicity. Furthermore, we seek to adapt these bioassays to allow their use in the field. In parallel, we have worked to improve an enzyme biosensor algal cell. We evaluated its performances on samples of UWWD and then we built an automated measuring station to make measurements directly on the remediation site (online monitoring).

La manipulation de micro et nanoparticules magnétiques et leurs applications dans les domaines de la biologie, la biodétection et du diagnostic a continuellement gagné en intérêt ces dernières années. Ce travail de thèse explore l’utilisation des propriétés magnétiques des particules en suivant deux axes distincts.Dans un premier axe, nous avons utilisé des particules magnétiques dans une analyse par biocode barre pour la capture et la concentration de cibles biologiques. La détection a été effectuée à l’aide d’un nouveau biocapteur à onde évanescente. Le but était de pouvoir procéder à un génotypage plaquettaire sans utiliser la « Polymérase Chain Reaction » (PCR), en collaboration avec l’Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes. Nous nous sommes servis du système biallélique HPA-1 comme preuve de concept, en utilisant des cibles de type oligonucléotide synthétique pour valider nos protocoles d’analyse. Nous avons réussi à détecter une concentration de 2 fmol/l de cibles non marquées. Notre test permet de discriminer les deux allèles du gène HPA-1, qui ne diffèrent que d’un nucléotide. Notre approche par biocode barre permet d’abaisser le seuil inférieur de détection de notre biocapteur d’un facteur 125 000. Nous avons pu détecter 6.105 copies de cible synthétique, sans passer par une amplification PCR. La prochaine étape consistera à adapter le test pour analyser des échantillons biologiques réels.Dans un deuxième axe, nous avons exploré l’assemblage de particules magnétiques sous champ magnétique, de manière à fabriquer des filaments permanents ancrés sur une surface et orientables. Les filaments ont pu être greffés sur des supports homogènes de verre, d’or et sur des supports mixte verre/or fonctionnalisés de manière orthogonale. Les filaments ont pu être localisés dans des zones précises du support, soit en employant des pointes concentrant le champ magnétique localement (spots de 500 µm), soit en jouant sur la fonctionnalisation sélective sur support mixte (carrés d’or de 1 mm de côté). Typiquement l’assemblage de particules de 200 nm de diamètre a permis d’obtenir des filaments de 5 µm de longueur pour 200 à 400 nm de largeur. Les conditions de formation des filaments restent toutefois à améliorer.Les filaments magnétiques permanents ont été employés pour deux applications. Tout d’abord nous avons employé les filaments magnétiques orientables pour valider un banc d’imagerie polarimétrique par résonance de plasmon de surface (P-SPRI) développé par le LCFIO (Palaiseau). Les premières mesures tendent à montrer que l’anisotropie des filaments peut être détectée par le banc de P-SPRI, il est toutefois nécessaire de poursuivre les travaux pour mieux valider ces résultats. Deuxièmement nous avons employé des filaments magnétiques biofonctionnalisés avec des oligonucléotides sondes, pour procéder à un génotypage plaquettaire. Dans des conditions de mesure non optimisées, l’hybridation d’oligonucléotides cibles fluorescents sur les filaments ancrés sur support permet de multiplier par trois le signal de fluorescence par rapport à une hybridation sur surface plane, grâce à une augmentation de la surface spécifique du support. / Manipulation and utilization of magnetic nano/microparticles have raised some interest in the field of biology, biodetection and diagnostics during the last few years. This work explores the uses of magnetic properties of particles in two different axes.In a first part, we used magnetic particles in a bio-barcode assay for the capture and biological target concentration steps. The detection was done using a new evanescent wave biosensor. The aim was to perform a platelet genotyping without polymerase chain reaction (PCR) with the collaboration of the French national blood service (EFS). We used the biallelic system HPA-1 as proof-of-concept, using synthetic oligonucleotides as target in order to validate our protocols. The assay allows to specifically detect single nucleotide polymorphism for HPA-1 gene with a detection of 2 fmol/l of label-free target synthetic oligonucleotides. Our bio-barcode assay allows to lower the inferior limit of detection of our biosensor by a factor of 125 000. We can detect 6.105 copies of synthetic target without using a PCR amplification step. The next step will be to adapt our assay to analyze real biological samples.In a second part, we explored the assemblage of magnetic particles with a magnetic field to create permanent filaments anchored on a surface and that can be actuated. The filaments could be grafted on homogeneous glass or gold supports and also on mixed glass/gold supports with orthogonal functionalization. Filaments could be localized on precise support zones using either metallic tips concentrating locally the magnetic field (500 µm spots) or selective functionalization on mixed supports (1 mm gold squares). Assembling 200 nm diameter particles allowed to typically obtain filaments 5 µm long and 200 - 400 nm wide. The filament formation conditions could still be improved.Permanent magnetic filaments were used for two applications. Firstly, we used magnetic filaments which can be actuated to validate a polarimetric surface resonance imaging biosensor (P-SPRI) developed by the LCFIO (Palaiseau). First measurements tend to show that the anisotropy can be detected by the P-SPRI biosensor. It is necessary to continue this work to better validate the results already obtained. Secondly, we used magnetic filaments biofunctionalized by oligonucleotide probes to type platelets. In non-optimized measurement conditions, the hybridization of fluorescent target oligonucleotides on filaments anchored on a surface allows to multiply by 3 the fluorescence signal compared to hybridization on plane surface by increasing the support specific surface.

L’objectif de cette thèse était de mettre au point une interface électrochimique afin de caractériser les interactions entre le cytochrome c (cyt c), une protéine mitochondriale, et le cardiolipide (CL), un phospholipide présent dans les membranes des mitochondries. Le cyt c, dont la fonction est le transport d'électrons dans la chaîne respiratoire, est connu pour interagir avec le CL. Précédemment, un mécanisme d'accroche du cyt c sur une membrane contenant du CL a été mis en évidence par la théorie de l’« extented lipid anchorage ». Cette théorie prévoit, outre des interactions électrostatiques entre le CL (chargé négativement) et le cyt c (chargé positivement), des interactions hydrophobes issues de l'insertion d'une chaîne grasse du CL dans le cyt c. La nature particulière de la partie hydrophobe du CL, quatre chaines grasses dont la composition est très homogène, nous a amenés à émettre des hypothèses sur la présence d'interactions spécifiques entre le cyt c et différents types de chaines du CL. Dans le cadre de mes travaux, des techniques électrochimiques ont été utilisées pour étudier ces interactions. Une électrode de carbone vitreux a été modifiée par un dépôt de phosphatidylcholine (PC) et de CL en proportion 80/20 (mol/mol). Cette électrode modifiée au CL permet l'étude de l'électrochimie du cyt c. Nous avons montré que l’électroactivité du cyt c nécessite la présence de CL sur l'électrode modifiée, le cyt c étant électroinactif sur une électrode modifiée uniquement avec de la PC. De plus, le CL permet de retenir le cyt c à la surface de l'électrode. C'est la première fois que l'effet de « lipid anchorage » a été identifié sur une électrode modifiée. Une méthode électrochimique plus adaptée à l'étude des protéines adsorbées (AC voltamétrie) a été utilisée afin de caractériser les cinétiques de transfert électronique du cyt c. Par cette méthode, deux sous-populations de cyt c adsorbés ont été caractérisées. La sous-population 1 de cyt c, qui est majoritaire, possède un potentiel redox proche du potentiel du cyt c en solution (0V vs SCE). Sa vitesse de transfert électronique est de l'ordre de 20s-1. La sous-population 2, qui compte pour environ 10% du cyt c adsorbé total, possède un potentiel décalé vers les valeurs négatives (-0.15V vs SCE) et une vitesse de transfert électronique supérieure à la sous-population 1 (environ 500s-1). Afin de mieux cerner le type d'interaction dans ces deux sous-populations, l'effet d'une solution de forte force ionique (0.5M KCI), du pH, du calcium, de la classe de phospholipide ou de l'origine du cyt c a été testé. Ces expériences ont démontré que la sous-population 1 comporte des interactions de type électrostatiques et nécessite la présence d'un phospholipide ayant un motif glycérol terminal (comme le CL ou la PG), La nature de l'interaction protéine-lipide pour la sous-population 2 est plus complexe. Elle est sensible aux cations divalents ou au pH mais insensible aux fortes forces ioniques, laissant supposer la présence d'interactions de type hydrophobe.Les essais réalisés avec du cyt c de levure laissent entrevoir qu'il existe des spécificités entre cette protéine et les phospholipides d’un même organisme. La purification de cyt c de bivalve permettrait d'avancer pour valider cette hypothèse. / The main goal of this thesis was to set up an electrochemical interface in order to characterize interactions between cytochrome c (cyt c), a mitochondrial protein, and cardiolipin (CL), a phospholipid localized to the mitochondrial membrane.The cyt c, whereas the main function is to carrying electrons along the respiratory chain, is known to interact with CL.Previously, a mechanism of cyt c retention onto a CL containing membrane was highlighted by the “extended lipid anchorage” theory. This theory imply, with electrostatic interactions between CL (negatively charged) and cyt c (positively charged), the presence of hydrophobic interaction likely emanating from the insertion of an acyl chain of CL into the cyt c interior. The specificity of the hydrophobic moiety of CL, constituted of four similar chains lead us to make hypothesis about specific interactions between cyt c and acyl chains of CL. Attention have been made to the bivalves CL acyl chains carrying unique composition of 8O% DHA chains.Electrochemicals techniques have been used to study these interactions. A glassy carbon has been modified with a deposit by spin-coating of phosphatidylcholine (PC) and CL in 80/20 ratio (mol/mol). This CL modified electrode allows the study of the cyt c electrochemistry. Firstly, we showed that electroactivity of cyt c require the presence of CL onto the modified electrode meaning cyt c isn't electroactive on a modified electrode with PC only. ln add, CL allows retaining cyt c onto the electrode surface. lt is the first time that this lipid anchorage has been identified on a modified electrode.Electrochemical methods adapted to the study of adsorbed protein (AC voltametry) have been used in order to characterize the electrode transfer kinetics of cyt c. With these methods, two sub-populations of adsorbed cyt c have been characterized. The major part of cyt c, called sub-population 1, has a redox potential close to the formal potential of the native protein (around 0Vvs SCE). Electron transfer rate is in the range of 20s-1. The subpopulation 2, counting for ~10% of the total adsorbed cyt c, hold a negative shifted potential around -0.15V vs SCE and a faster electron transfer rate (~500s-1).To understand the nature of the interaction for the two subpopulations, the effect of an high ionic strength solution (0.5M KCI), pH, calcium, phospholipids classes or cyt c sources have been assayed. These tests shows that subpopulation t have electrostatics interactions and require the presence of a phospholipid holding a terminal glycerol pattern like PG or CL.The nature of the protein-lipid interaction in the case of the subpopulation 2 is more complex. lt is more sensitive to the presence of divalent cation or pH but high ionic strength solution doesn't affect it. This could be explained by hydrophobic interactions between lipid and the cyt c.The assays realized with cyt c from yeast let foresee specificity between these protein and the phospholipids carried by the same organism. The purification of bivalve cyt c could be a progress in order to validate this hypothesis.