Candida albicans, le pathogène opportuniste le plus commun, peut subir des transitions morphologiques entre la forme levure et la forme hyphe, jouant un rôle dans la formation de biofilm. Le farnésol, un lipide endogène produit par C. albicans, est une molécule de quorum sensing qui inhibe cette transition morphologique. Certaines souches ne répondent pas au farnésol et nous avons vérifié les hypothèses que : 1) l’isolat clinique SC5314, la souche la mieux caractérisée, est un répondeur au farnésol; 2) la germination, la croissance et la formation de biofilm des non répondeurs diffèrent des répondeurs; 3) l’absence de la réponse au farnésol se manifeste en dehors de conditions de culture précises; 4) le farnésol agit via un récepteur nucléaire qui présente des altérations chez les non répondeurs; 5) la différence de la réponse au farnésol entre les souches s’explique par des variations au niveau transcriptionnel de certains gènes (CHK1, HST7, CPH1, GAP1, RAM2 et DPP3). Les non répondeurs produisent un plus grand nombre d’hyphes, forment 60% plus de biofilm et croissent 50% moins vite que les répondeurs. La souche SC5314 se comporte comme un répondeur. L’absence de la réponse au farnésol se manifeste indépendamment des conditions de culture. Cependant, elle ne s’explique pas par une différence dans le niveau d’expression des gènes proposés, excepté pour DPP3 qui est surexprimé chez le non répondeur ATTC® 36802, suggérant ainsi une surproduction de farnésol chez cette souche. De plus, si le farnésol agit via un récepteur nucléaire, il sera d’un type non décrit précédemment. / Candida albicans, the most common fungal pathogen, can undergo morphological transitions between yeast and hyphal forms, which are associated with biofilm formation. Farnesol, an endogenous lipid produced by C. albicans, is a quorum sensing molecule that inhibits this transition. Previous work identified two clinical isolates that didn’t respond to farnesol in colony morphology and biofilm assays. Our goal is to better understand C. albicans response to farnesol using these natural farnesol non responders. We have hypothesized that : 1) clinical isolate SC5314, the most characterized strain, is a farnesol responder; 2) non responders’ germination, growth and biofilm formation are different from those of responders; 3) lack of response to farnesol occurs even outside specific culture conditions; 4) farnesol acts through a nuclear receptor that is altered in non responders; 5) difference in farnesol response between strains is explained by transcriptional variations of specific genes (CHK1, HST7, CPH1, GAP1, RAM2 and DPP3), that were previously shown to be potentially involved in farnesol’s mechanism of action. Non responders produce more hyphae, form 60 % more biofilm and grow 50% slower than responders. The SC5314 strain acts like a responder. Lack of response to farnesol occurs regardless of culture conditions. However, the refractory response to farnesol is not explained by a difference in the proposed genes expression level, except for DPP3 that is upregulated in ATTC® 36802 non responder, suggesting an overproduction of farnesol by this strain. Furthermore, if farnesol acts trough a nuclear receptor, it will be a type not previously described.

Actinobacillus pleuropneumoniae est un bacille Gram-négatif de la famille des Pasteurellaceae. A. pleuropneumoniae est l'agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, une maladie hautement contagieuse et endémique qui cause encore à ce jour d’énormes pertes économiques dans le monde de l’industrie porcine. La pathogenèsedes infections à A. pleuropneumoniae implique plusieurs facteurs de virulence de la bactérie dont les principaux sont les lipopolysaccharides (LPS) et la capsule polysaccharidique (CPS). Ces derniers sont impliqués dans l'adhérence d’A. pleuropneumoniae. Très récemment, il a été démontré qu’A. pleuropneumoniae était capable de produire, sous certaines conditions un biofilm riche en poly- N-acétyl-D-glucosamine (PGA). Cependant, le rôle de cette structure dans la pathogenèse ainsi que les facteurs intervenant dans sa formation et ses signaux déclencheurs sont peu connus à ce jour. Dans cette étude, nous avons démontré que l’antigène O du LPS joue un rôle important dans la formation d’un biofilm mature par A. pleuropneumoniae que ce soit dans un modèle statique ou dans un modèle dynamique en flux, le «drip flow reactor», plus représentatif de l’environnement pulmonaire. Alors que l’absence de la capsule ou du noyau oligosaccharidique du LPS ne semble pas affecter la formation du biofilm, le défaut de formation du biofilm chez le mutant antigène O semble être lié à un problème de production de PGA. En effet, des tests d’immunodétection du PGA associé aux bactéries, à l’aide d’anticorps spécifiques, et les études d’expression du PGA démontrent que le mutant antigène O produit moins de polysaccharide. De plus, les gènes codant pour le système de stress exocytoplasmique CpxRA semblent être moins exprimés chez le mutant antigène O. I L’expression du système CpxRA a également été étudiée lors de l’exposition de souches faiblement productrices de biofilm à des doses sous inhibitrices de pénicilline G (sous-CMI de PG). L’expression des gènes cpxR et cpxA ainsi que d’un gène codant pour la biosynthèse du PGA est augmentée après exposition à des doses sous-CMI de PG. Cette augmentation est suivie d’une augmentation de la capacité des souches étudiées à former un biofilm ainsi que d’une modification de la composition de la matrice extracellulaire. Ces résultats suggèrent que des doses sous-CMI de PG semblent agir comme signaux activateurs de la formation de biofilm chez A. pleuropneumoniae. Finalement, des expériences visant à établir l’implication du biofilm dans l’échappement d’A. pleuropneumoniae au système immunitaire ont démontré que les bactéries du biofilm sont moins susceptibles d’activer des cellules immunitaires que les bactéries planctoniques. À l’aide de la spectrométrie de masse, nous avons démontré une distribution différente des structures du lipide A du LPS entre les bactéries planctoniques et ceux du biofilm. Ces modifications structurelles au niveau du lipide A pourraient expliquer, du moins en partie, cette diminution de la réponse inflammatoire suite à l’exposition des macrophages aux bactéries du biofilm d’A. pleuropneumoniae. Au cours de ce projet, nous avons ainsi pu identifier de nouveaux facteurs importants pour la formation du biofilm d’A. pleuropneumoniae nous permettant de mieux comprendre les mécanismes de formation du biofilm ainsi que son implication dans la pathogénicité. / Actinobacillus pleuropneumoniae is a Gram-negative bacterium belonging to the Pasteurellaceae family and the causative agent of porcine pleuropneumonia, a highly contagious disease that causes important economic losses to the swine industry worldwide. Several virulence factors of A. pleuropneumoniae have been identified. These factors include the Apx toxins, iron uptake systems and surface polysaccharides. Surface polysaccharides including lipopolysaccharides (LPS) and capsular polysaccharides (CPS) are implicated in the adhesion of A. pleuropneumoniae. Recent literature indicates that A. pleuropneumoniae has the ability to rapidly form a biofilm rich in poly-N-acetyl-D-glucosamine (PGA). However, the role of the biofilm in the pathogenesis as well as factors and signals involved in are little known to date. In this study, we demonstrated that the LPS O antigen plays an important role in the biofilm formation by A. pleuropneumoniae whether in a static model or a dynamic model under continuous flow, the "drip flow reactor" which is more representative of the lung environment. While truncation of the LPS core oligosaccharide or the absence of CPS did not have any effect, absence of O antigen markedly reduced the ability of A. pleuropneumoniae serotype 1 to form a mature biofilm. This finding was linked for the O-antigen mutant to a reduced pgaA expression and, consequently, a reduced PGA production. Indeed, compared to the parental or other strains, the biofilm of the O-antigen mutant was dramatically reduced and it had less cell-associated PGA. Real-time PCR analyses revealed a significant reduction in the level of pgaA which encodes for biosynthesis of PGA. Interestingly, the O-antigen mutant also exhibited reduced expression of stress extracytoplasmic CpxRA system. Expression of CpxRA system was also investigated during the exposure of field isolates of A. pleuropneumoniae to sub-minimal inhibitory concentrations of penicillin G (sub-MICs of PG). III Surprisingly, cpxR, cpxA and pgaA expression was increased after exposure to sub-MICs of PG. The up-regulation of these genes was followed by an increase of the capacity of the studied strains to form a biofilm as well as a change in the composition of the induced biofilm extracellular matrix. These results suggest that sub-MICs of PG seem to act as activators signal towards biofilms of A. pleuropneumoniae. Finally, experiments to establish the involvement of the biofilm in the immune evasion of A. pleuropneumoniae have shown that biofilm cells have weaker ability to stimulate innate immune cells compared to planktonic bacteria. Using mass spectrometry, we demonstrated a different distribution of structures of lipid A of LPS between planktonic bacteria and those of the biofilm. These structural changes in the lipid A could explain, at least in part, the reduction of the inflammatory response following exposure of macrophages to A. pleuropneumoniae biofilm cells compared to their planktonic counterparts. During this project, we were able to identify new factors important for biofilm formation of A. pleuropneumoniae allowing us to better understand the biofilm formation and its involvement in pathogenicity.

Cystic fibrosis (CF) is a fatal, incurable genetic disease that affects over 30,000 people in the United States alone. People with this disease have a homozygous mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) which causes defects in chloride transport and leads to build up of mucus in the lungs and disruption of function in various organs. CF patients often suffer from chronic bacterial infections within the lungs, wherein the bacteria persist as a biofilm, leading to poor prognosis. Two of these pathogens, <i>Stenotrophomonas maltophilia</i> and <i>Pseudomonas aeruginosa</i>, are often found in the lungs of patients with CF and are an increasing medical concerns due to their intrinsic antimicrobial resistance. Both species can readily form biofilms on biotic and abiotic surfaces such as intravascular devices, glass, plastic, and host tissue. Biofilm formation starts with bacterial attachment to a surface and/or adjacent cells, initiating the acute infection stage. Chronic, long-term infection involves subsequent or concurrent altered genetic regulation, including a downregulation of virulence factors, resulting in the bacteria committing to a sessile lifestyle, markedly different from the planktonic one. Many of these genetic switches from an acute to chronic lifestyle are due to pressures from the host immune system and lead to permanently mutated strains, most likely an adaptive strategy to evade host immune responses. Biofilms are extremely problematic in a clinical setting because they lead to nosocomial infections and persist inside the host causing long-term chronic infections due to their heightened tolerance to almost all antibiotics. Understanding the genetic networks governing biofilm initiation and maintenance would greatly reduce consequences for CF and other biofilm-related infections and could lead to the development of treatments and cures for affected patients. This study showed that in<i> S. maltophilia</i>, isogenic deletion of phosphoglycerate mutase (<i>gpmA</i>) and two chaperone-usher pilin subunits, <i>S. maltophilia</i> fimbrae-1 (<i>smf-1</i>) and<i> cblA</i>, lead to defects in attachment on abiotic surfaces and cystic fibrosis derived bronchial epithelial cells (CFBE). Furthermore, Δ<i>smf-1</i> and Δ<i>cblA</i> showed defects in long-term biofilm formation, mimicking that of a chronic infection lifestyle, on abiotic surfaces and CFBE as well as stimulating less of an immune response through TNF-α production. This study also showed that in <i>P. aeruginosa</i>, the Type III secretion system (T3SS), an important virulence factor activated during the acute stage of infection, is downregulated when <i>polB</i>, a stress-induced alternate DNA polymerase, is overexpressed. This downregulation is due to post-transcriptional inhibition of the master regulatory protein, ExsA. Taken together, this project highlights important genes involved in the acute and chronic infection lifestyle and biofilm formation in <i>S. maltophilia</i> and genetic switches during the acute infection lifestyle in <i>P. aeruginosa</i>.

[pt] O tratamento de águas de resfriamento normalmente é feito com a adição de cloro, porém este produto apresenta algumas desvantagens em sua aplicação. Como alternativa ao cloro, algumas indústrias no Brasil e no exterior estão começando a utilizar outros biocidas, dentre estes o peróxido de hidrogênio, um poderoso oxidante que apresenta forte ação biocida. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência do cloro e do peróxido de hidrogênio como biocidas em diferentes condições, através de testes em água da torre de resfriamento de uma indústria siderúrgica localizada no Rio de Janeiro. A contaminação microbiológica desta água foi medida sem a adição dos biocidas e com a adição de cloro e peróxido de hidrogênio, permitindo assim comparar o desempenho destas substâncias no combate aos grupos bacterianos presentes na amostra. Foi realizado também um estudo sobre o efeito corrosivo destas substâncias através de testes de corrosão em aço carbono 1020, que permitiram avaliar a taxa de corrosão por perda de massa provocada pela aplicação destes produtos na água. Os resultados mostraram que o peróxido de hidrogênio possui uma ação biocida satisfatória para aplicações em águas de resfriamento. Foi constatado que o efeito biocida do peróxido de hidrogênio é mais limitado do que o cloro e que sua eficiência depende do tempo de contato e pode ser afetada pela presença de impurezas dissolvidas na água. Os ensaios de corrosão revelaram que o peróxido de hidrogênio provoca um efeito corrosivo comparável ao do cloro no material testado. / [en] Cooling water treatment generally is made with the addition of chlorine, although it´s application has some disadvantages. There is an active development in Brazil and other countries to use alternative chemical disinfectants in place of chlorine, such as hydrogen peroxide, a powerful oxidant which is known for its high biocidal efficiency. The aim of this research is to study the effectiveness of hydrogen peroxide as a disinfectant compared to chlorine in different operational conditions. The experiments were carried out using an water sample from a cooling water system of a steelmaking plant in the city of Rio de Janeiro. The microbial contamination of this water sample was measured without adding any kind of disinfectant. After that, water sample was treated by adding hydrogen peroxide and chlorine, in order to compare and evaluate the efficiency of the two biocides to control bacterial growth in water. Besides microbiological tests, experiments were conducted to compare the degree of corrosion caused by the addition of hydrogen peroxide and chlorine in water. The experimental methodology employed 1020 carbon steel specimens and corrosion rates were measured by weight loss determination after the period of exposure. The results showed that the application of hydrogen peroxide leads to satisfactory bacterial control. However, compared to chlorine, hydrogen peroxide is a rather poor disinfectant. The efficiency of hydrogen peroxide depends on reaction time and it is affected by dissolved polluants in water. Evaluation of corrosion rates showed that hydrogen peroxide causes basically the same corrosion rates than chlorine.

Neste estudo foi proposto um modelo de formação de biofilme fúngico formado por Candida albicans em dois diferentes substratos associado ou não à glicose para o estudo dos efeitos da terapia fotodinâmica (PDT) utilizando o azul de metileno (AM) como fotossensibilizador, avaliando os efeitos de dois comprimentos de onda distintos incluindo a investigação na captação do AM quando sensibilizados previamente com a glicose. Foi avaliada a susceptibilidade da levedura em suspensão de células crescidas por 24 h (início da fase estacionária) com e sem a adição prévia da glicose. Foram investigadas duas linhagens de C. albicans para a padronização do biofilme, ATCC 90028 e ATCC 10231. Com os biofilmes formados, avaliamos a captação de AM para determinarmos a mais eficiente concentração e tempo de pré-irradiação (PIT). Por último, avaliamos sua sensibilidade à PDT em dois comprimentos de onda distintos (&lambda; = 645 nm e &lambda; = 660 nm) em função do tempo de irradiação (potência = 16 mW, taxa de fluência = 127,3 mW/cm2). A linhagem de célula que possibilitou a formação de biofilme foi a ATCC 10231 em discos de hidrogel. A menor concentração que possibilitou uma melhor captação do AM foi de 500 &mu;M com um PIT de 30 min e em contato prévio com a glicose 50 mM por 90 min. O comprimento de onda mais eficiente, que promoveu redução em leveduras e biofilmes foi o de &lambda; = 660 nm, reduzindo melhor no estudo de leveduras quando sensibilizados com glicose. Nos biofilmes, a redução foi iniciada mais precocemente sem a adição de glicose (com 6 min de irradiação e fluência = 46 J/cm2), porém, em 12 min (fluência = 92 J/cm2) o grupo com glicose passou a ter maior eficiência. / In this study we propose a fungal biofilm model of Candida albicans developed on different substrates for photodynamic effect of photodynamic therapy (PDT) study, using the methylene blue (MB) as photosensitizer, evaluating the effects on two wavelengths distinct, including investigating the difference in uptake of MB when sensitized with glucose. Susceptibility was evaluated in the yeast cell suspension with or without the prior addition of glucose to cells grown for 24 h (early stationary phase). Two strains of C. albicans were investigated for the standardization of the biofilm, ATCC 90028 and ATCC 10231. In biofilms, we evaluated the uptake of MB including cell suspension to determine the most efficient concentration and pre-irradiation time (PIT). Finally, we assess its sensitivity to PDT in two distinct wavelengths (&lambda; = 645 nm and &lambda; = 660 nm) as a function of irradiation time (power = 16 mW, fluence rate = 127,3 mW/cm2). The ATCC strain that allowed the biofilm formation was ATCC 10231 on hydrogel disks. The lowest concentration that enabled better uptake of MB was 500 &mu;M with a PIT 30 min and prior contact with 50 mM glucose f or 90 min. The most effective wavelength, which promoted a reduction in biofilms and yeasts was &lambda; = 660 nm, reducing yeast best when primed with glucose and reduction in biofilms started earlier without the addition of glucose (6 min irradiation, fluence = 46 J/cm2), but at 12 min (fluence = 46 J/cm2) the glucose group now has greater efficiency.

A utilização de enxaguatórios bucais é um recurso importante na manutenção da saúde oral, uma vez que esta pode suprir as limitações da higienização tradicional mecânica, devido ao maior acesso às bactérias do biofilme dental. Em função de sua fácil utilização, palatabilidade e poder de refrescância, os enxaguatórios podem ser considerados um produto de fácil adesão, sendo especialmente importantes na manutenção da saúde bucal de usuários com menor destreza ou impossibilidade de realizar uma escovação adequada. Entre os diversos componentes ativos que podem estar presentes nos enxaguatório bucais estão os constituintes de óleos essenciais como mentol, eucaliptol e timol. Uma grande vantagem da utilização de óleos essenciais em produtos para saúde bucal é a existência de uma gama de propriedades biológicas e organolépticas que os mesmos podem conferir às formulações, uma vez que podem atuar como agentes antimicrobianos, inibidores da produção de ácidos e sulfetos voláteis por bactérias orais, antioxidantes, anti-inflamatórios, aromatizantes e flavorizantes simultaneamente. Dessa forma, formulações contendo óleos essenciais podem ser potenciais agentes na prevenção e tratamento das afecções bucais mais comuns como a cárie dental, placa, tártaro, gengivite, periodontite e halitose. O presente trabalho teve por objetivo inicial realizar um estudo comparativo das atividades antimicrobianas e anticariogênicas dos óleos essenciais de Cymbopogon citratus, Illicium verum, Zingiber officinale, Eucalyptus globulus, Tithonia diversifolia e Aldama arenaria, por meio da determinação de suas concentrações inibitórias mínimas (CIM) e concentrações bactericidas mínimas (CBM) e através da medida potenciométrica do pH de suspensões bacterianas, as quais foram tratadas com concentrações seriadas dos óleos essenciais. Entre os componentes voláteis analisados, o óleo essencial das inflorescências de A. arenaria demonstrou-se o mais promissor, apresentando-se ativo contra S. mutans (CIM = 15,6 ?g/mL e CBM = 62,5 ?g/mL) e S. mitis (CIM = 31,2 ?g/mL e CBM = 31,2 ?g/mL) e moderadamente ativo contra L. casei (CIM = 125?g/mL e CBM = 250 ?g/mL) e S. salivarius (CIM = 250 ?g/mL e CBM = 250 ?g/mL). A concentração capaz de inibir 50% da produção de ácidos orgânicos por S. mutans foi de 26,5 ?g/mL. Este óleo essencial foi caracterizado quimicamente e avaliado quanto à sua segurança para incorporação em produtos de higiene bucal. Os principais componentes majoritários identificados foram os sesquiterpenos carotol (12,67%), falcarinol (6,71%) e espatulenol (5,48%). Quanto à citotoxicidade, não foi observado efeito anti-proliferativo do óleo essencial em fibroblastos gengivais humanos tratados com concentrações iguais ou menores que 250 ?g/mL, após 30 minutos de exposição. Assim, esta concentração de óleo essencial foi escolhida para ser veiculada na microemulsão de enxaguatório bucal. A microemulsão obtida apresentou-se como um sistema translúcido e estável, de densidade relativa 1,22 g/mL, viscosidade de 2,28 cP, tamanho de gotícula 24,96 nm, condutividade 1.246,67 ?S/cm e pH final igual a 6,56. Embora o sistema da microemulsão tenha sido caracterizado como físico-quimicamente estável, por meio de análise cromatográfica foi possível constatar que óleo não se encontrava homogeneamente disperso no sistema. Considerando a não homogeneidade da formulação e, visando determinar o real potencial do óleo essencial, optou-se por avaliar seu efeito isoladamente sobre o biofilme de S. mutans. Em concentrações equivalentes a 250 e ii 1.000 ?g/mL, o óleo essencial não apresentou atividade inibitória sobre o crescimento e a produção de ácidos dos micro-organismos sésseis. No entanto, a atividade significativa contra a proliferação e a produção de ácidos orgânicos de S. mutans planctônico, o qual é considerado um dos principais iniciadores do processo de formação da cárie e do próprio biofilme, abrem perspectivas para a aplicação dos constituintes deste óleo essencial em formulações de enxaguatórios bucais. / The use of mouthwashes are an important resource in maintaining oral health as it can overcome the limitations of traditional mechanical cleaning because of their greater access to bacterial biofilm. Due to their ease of use, palatability and freshness, mouthwashes are considered as products of easy adhesibility, being especially important in maintaining oral health of users with less dexterity or inability to perform a proper teeth brushing. Among the several active components which may compose mouthwashes are the constituents from essential oils such as menthol, eucalyptol and thymol. A major advantage of the use of essential oils in oral health products is the range of biological and organoleptic properties that can be confered to the formulations, once these oils can work as antimicrobials that inhibit the production of acids and volatile sulfides by oral bacteria, also as antioxidants, antiinflammatory and flavoring agents simultaneously. Thus, essential oil containing formulations can work for preventing and treating the most common oral diseases such as dental caries, plaque, tartar, gingivitis, periodontitis and halitosis. The initial goal of the present work was to conduct a comparative study of antimicrobial and anticariogenic activities of essential oils extracted from Cymbopogon citratus, Illicium verum, Zingiber officinale, Eucalyptus globulus, Tithonia diversifolia and Aldama arenaria, by determining their minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentrations (MBC) and by the potentiometric measurement of the pH from bacterial suspensions treated with serial essential oils concentrations. Among the volatile compounds analyzed, the essential oil from A. arenaria inflorescences was considered the most promising, for being active against S. mutans (MIC = 15.6 ?g/ml and MBC = 62.5 ?g/ml) and S. mitis (MIC = 31.2 ?g/ml and MBC = 31.2 ?g/ml) and moderately active against L. casei (MIC = 125 ?g/mL and CBM = 250 ?g/ml) and S. salivarius (MIC = 250 ?g/ml and MBC = 250 ?g/ml). The concentration that inhibits 50% of organic acids production by S. mutans was determined as 26.5 ?g/mL. This essential oil was chemically characterized and evaluated about its safety for incorporation in oral hygiene products. The major identified constituents were the sesquiterpenes carotol (12.67%), falcarinol (6.71%) and spathulenol (5.48 %). The essential oil displayed no anti-proliferative effects against human gingival fibroblasts treated during 30 minutes with concentrations up to 250 ?g/mL. Thus, this concentration of essential oil was chosen to be conveyed in the microemulsion mouthwash. The microemulsion was characterized as a translucent and stable system, with 1.22 g/ml relative density, 2.28 cP viscosity, 24.96 nm droplet size, 1246.67 ?S/cm of conductivity and final pH 6.56. Although characterized as a physical-chemically stable system, through a chromatograph analysis it was found that the oil was not homogeneously dispersed in the system. Considering the inhomogeneity of the formulation and, in order to determine the real potential of the essential oil, it was decided to evaluate the isolated effect of the oil against S. mutans biofilm. The essential oil displayed no inhibitory activity on the growth and acid production of sessile microorganisms at concentrations equal to 250 and 1,000 ?g/mL. However, the significant activity against proliferation and organic acid production of planktonic S. mutans, which is considered one of the main initiators of dental caries process and biofilms,indicated good perspectives for its constituents application in mouthwashes formulations.

Biofilmes de Listeria monocytogenes são fontes potenciais de contaminação de alimentos processados e podem diminuir a efetividade de procedimentos de higienização e sanitização nas indústrias. No presente estudo foi avaliada a estrutura e a dispersão de biofilmes formados por duas cepas de L. monocytogenes em diferentes superfícies, como aço inoxidável, vidro e poliestireno. Foram utilizados diferentes sistemas de cultivo como microplacas de 96 poços de poliestireno e de aço inoxidável, microplacas de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro e, câmaras de poliestireno contendo 8 poços com fundo de borossilicato (vidro). Os experimentos foram realizados com incubação por 1, 4 e 8 dias a 25°C. A formação de biofilme foi verificada em microplacas de 96 de poliestireno e de aço inoxidável através do método de quantificação de biomassa do biofilme por coloração com cristal violeta, e também em sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável ou de vidro, através de enumeração em placa das células aderidas nas superfícies. As estruturas dos biofilmes foram observadas por meio de microscopia de fluorescência (para o sistema de microplaca de 24 poços contendo lâminas circulares de aço inoxidável) e através de microscopia confocal a laser (para o sistema com câmaras com fundo de vidro). Para isso, os biofilmes foram corados com o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD®, a fim de diferenciar as células viáveis (coradas com Syto 9) das células mortas (coradas com iodeto de propídeo), sendo feitas estimativas do número de células aderidas à superfície de vidro através de quantificação por fluorescência. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de óleos essenciais de plantas de Cymbopogon citratus (capim-limão) e de Zingiber officinale (gengibre) e de dois sanitizantes comerciais (um à base de óleo de coco babaçu e outro à base de dióxido de cloro) frente a L. monocytogenes. Posteriormente, foi testada a eficácia desses antimicrobianos na remoção de biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias a 25ºC, em superfície de aço inoxidável e de vidro, através da enumeração em placas de células aderidas e de observações microscópicas. Foi também avaliada a presença de moléculas relacionadas ao estresse oxidativo e nitrosativo em biofilmes maduros de duas cepas de L. monocytogenes formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, para o estudo do possível efeito do óxido nítrico (NO) exógeno e de inibidores de NO na dispersão de células do biofilme e na alteração dos níveis de expressão de genes de L. monocytogenes relacionados ao estresse oxidativo e nitrosativo (Lmo0990, Lmo0807 e Lmo1485), bem como à regulação do gene de virulência e formação de biofilme (PrfA). Foi verificada a presença de intermediários de oxigênio reativo (ROI - reactive oxygen intermediates) e de intermediários de nitrogênio reativo (RNI - reactive nitrogen intermediates) nos biofilmes de L. monocytogenes com 4 e 8 dias de incubação a 25ºC formados em superfícies de aço inoxidável e de vidro, por meio de marcadores ii fluorescentes específicos e visualizações microscópicas. A fim de confirmar indiretamente a presença de óxido nítrico (NO) em cultivos de L. monocytogenes incubados por 4 e 8 dias a 25ºC, foi realizada a dosagem de nitrito com o emprego do reagente Griess. Foram realizados testes de concentração inibitória mínima (CIM) do doador de óxido nítrico como nitroprussiato de sódio (SNP) e dos inibidores de NO como N?-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) e 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5- tetrametilimidazolina-1-oxi-3-óxido (Carboxi-PTIO sal de potássio, C-PTIO) frente a L. monocytogenes. Foi testada a eficácia do SNP e dos inibidores de NO na remoção de biofilmes pré-formados por 4 e 8 dias de L. monocytogenes em superfície de aço inoxidável. Os resultados deste trabalho demonstraram que o biofilme de L. monocytogenes formado em vidro e em aço inoxidável apresentou uma arquitetura microscópica semelhante a um \"favo de mel\", com presença de canais de água, bem como cavidades de tamanhos variados devido à dispersão de grupos de células planctônicas ou morte celular. A utilização de óleos essenciais e/ou sanitizantes comerciais por 1h em biofilmes de L. monocytogenes formados por 4 e 8 dias, foi eficaz na redução do número de células aderidas na superfície de aço inoxidável e de vidro. No biofilme de L. monocytogenes foram detectadas moléculas relacionadas ao estresse oxidativo como peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais superóxidos, bem como moléculas de estresse nitrosativo como óxido nítrico (NO) e peroxinitrito. A adição de NO exógeno (por meio do doador SNP) e a adição de inibidores de NO no meio de cultivo não alteraram o crescimento planctônico de L. monocytogenes. Foi observado que a exposição a SNP e a inibidores de NO por 1h em biofilmes de L. monocytogenes pré-formados por 4 e 8 dias, não induziu a dispersão celular. A adição de NO exógeno bem como a remoção de NO do meio de cultura por moléculas inibidoras não alteraram o nível de expressão dos genes Lmo1485, Lmo0990, Lmo0807 e PrfA, em culturas de L. monocytogenes de 8 dias. A utilização de óleos essenciais de plantas e/ou sanitizantes comerciais em biofilmes pré-formados pode ser uma alternativa eficaz na eliminação de L. monocytogenes em superfícies de manipulação de alimentos, mas a melhor estratégia de controle é impedir a formação de biofilme pelo emprego de tratamentos combinados nos estágios iniciais de contaminação. Em conclusão, L. monocytogenes formou biofilme com estruturas bem definidas que podem contribuir para a sobrevivência e disseminação da bactéria no ambiente de processamento de alimentos. Apesar de L. monocytogenes não formar um biofilme espesso com multicamadas, as células aderidas apresentam geralmente maior resistência à ação dos antimicrobianos em comparação com as células planctônicas, conseguindo sobreviver e persistir na superfície, com mecanismos regulatórios bastante eficientes frente a diferentes tipos de estresse. / Biofilms of Listeria monocytogenes are potential sources of contamination of processed foods, and may interfere in the effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in food industry. In the present study the structures and dispersion of biofilms formed by two strains of L. monocytogenes on different abiotic surfaces, such as stainless steel, glass and polystyrene were evaluated. Different cultivation systems such as polystyrene and stainless steel 96-wells microplates, 24-wells microplates containing round stainless steel or glass slides, and 8-wells polystyrene chambers with borosilicate bottom were used. The experiments were done for 1, 4 and 8 days of incubation at 25°C. Biofilm formation was observed in 96-wells microplates of polystyrene and stainless steel by the quantification of biofilm biomass by staining with crystal violet, and also in 24-wells microplates system with circular slides of stainless steel or glass, with enumeration of adhered cells on agar plates. The structure of biofilms were observed by fluorescence microscopy (for the system of 24-wells microplates containing circular slides of stainless steel) and by confocal laser scanning microscopy (for the system of glass bottom chambers). For this, biofilms were stained with the LIVE/DEAD® bacterial viability kit, in order to differentiate viable cells (stained with Syto 9) from dead cells (stained with propidium iodide). The estimative of the number of viable cells was done by measurement of fluorescence. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oils plants of Cymbopogon citratus (lemon grass) and Zingiber officinale (ginger) and two commercial sanitizers (babassu coconut oil-based sanitizer and chlorine dioxide-based sanitizer) against L. monocytogenes were also determined. Subsequently, the antimicrobials were evaluated against L. monocytogenes biofilms formed by 4 and 8 days at 25°C on the stainless steel and glass surfaces by enumeration on agar plates of adhered cells and microscopic observations. The presence of molecules related to oxidative and nitrosative stresses in mature biofilms of two strains of L. monocytogenes formed on glass and stainless steel surfaces was also evaluated, and the possible role of exogenous nitric oxide (NO) and inhibitors of NO were studied for induction of biofilm dispersal cells and changed of genic expression levels of L. monocytogenes related to oxidative and nitrosative stress genes (Lmo0990, Lmo0807 and Lmo1485), as well as the regulation of virulence and biofilm formation gene (PrfA). The presence of reactive nitrogen intermediates (RNI) and reactive oxygen intermediates (ROI) was investigated in biofilms of L. monocytogenes formed on stainless steel and glass surfaces with 4 and 8 days-old at 25°C, using specific fluorescent dyes and microscopic views. In order to indirectly confirm the presence of nitric oxide (NO) in cultures of L. monocytogenes incubated for 4 and 8 days at 25°C, the dosage of nitrite was carried out with Griess reagent. The minimum inhibitory concentration (MIC) of a nitric oxide donor as sodium nitroprusside (SNP) and two NO inhibitors such as N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5- tetrametilimidazoline-1-oxy-3-oxide (Carboxy-potassium salt, C-PTIO), were iv evaluated for L. monocytogenes. It was also determined the effectiveness of SNP and of the two inhibitors of NO to eliminate biofilms of L. monocytogenes preformed for 4 and 8 days on stainless steel surfaces. The results of this work showed that L. monocytogenes biofilms formed on glass and on stainless steel surfaces, presented similar microscopic architectures in a \"honeycomb\" like structure, with water channels and hollows of different sizes, possibly due to cell dispersion or death. The exposure to essential oils and/or commercial sanitizers for 1h for L. monocytogenes biofilms formed for 4 and 8 days was effective in reducing the number of cells adhered on stainless steel and on glass surfaces. In biofilms of L. monocytogenes, molecules were detected related to oxidative stress such as hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide radicals, as well as molecules related to nitrosative stress as nitric oxide (NO) and peroxynitrite. The addition of exogenous NO (SNP) and inhibitors of NO in the culture medium did not inhibit planktonic growth of L. monocytogenes, and exposure to SNP and to inhibitors of NO for 1 h for biofilms of L. monocytogenes preformed by 4 and 8 days did not induce cell dispersion. The addition of exogenous NO and NO removal from the culture medium by inhibitory molecules did not alter the level of expression of Lmo1485, Lmo0990, and PrfA Lmo0807 genes in cultures of 8- days-old of L. monocytogenes. The use of essential oils from plants and/or sanitizing commercial agents on pre-formed biofilms can be an effective alternative in the control of L. monocytogenes in food handling surfaces, but the best control strategy is avoid the biofilm formation by applying combined treatments in initial stages of contamination. In conclusion, L. monocytogenes formed biofilms with well defined structures that may contribute to the survival and spread of bacteria in food processing environment. Despite L. monocytogenes do not form a multilayer thick biofilms, adherent cells generally have greater resistance to antimicrobial activity compared to planktonic cells, surviving and persisting on the surface with regulatory mechanisms effective against different types of stress.

Listeria monocytogenes é um micro-organismo Gram-positivo que está comumente associado a doenças de origem alimentar. Possui a capacidade de sobreviver a condições adversas e de formar biofilme em diferentes superfícies abióticas, tornando-se um problema constante para a indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização e aumentar o risco de contaminação pós-processamento. A formação de biofilme pode ser regulada por um mecanismo denominado quorum sensing, no qual ocorre intensa comunicação célula-célula, mediada por moléculas químicas, chamadas de autoindutoras. Pouco se sabe sobre a ocorrência de interação entre bactérias Gram- positivas e negativas na formação de biofilmes, sendo mais frequentes estudos entre bactérias do mesmo grupo. A fim de avaliar a ocorrência de interação entre Escherichia coli e L. monocytogenes (Lm), desenvolveu-se esta pesquisa com os seguintes objetivos: i) verificar a capacidade de Lm sorotipo 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (&#916;prfA &#916;sigB) formar biofilme em presença de Escherichia coli, avaliando-se a importância dos reguladores de virulência, prfA e sigB, no processo; e ii) verificar a produção e interferência de moléculas autoindutoras de E. coli E2348/69 na formação de biofilme por Lm. Os ensaios de formação de biofilme foram realizados utilizando-se lâminas de aço-inoxidável AISI 304 #4 imersas em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e em meio pré-condicionado (MPC) por E. coli, com incubação a 25 ºC. Foram testadas duas concentrações iniciais de Lm (102 e 106 UFC.mL-1) e amostragens em diferentes tempos de incubação. Utilizou-se um método de quantificação indireto com coloração do biofilme por cristal violeta e posterior leitura da absorbância. Observou-se que Lm 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (&#916;prfA &#916;sigB) são capaz de formar biofilme na presença de Escherichia coli e que uma maior quantidade de biofilme foi formada por Lm selvagem quando comparada à sua mutante, em meio não pré-condicionado (controle), indicando que prfA e sigB estão envolvidos no processo de formação de biofilme. Quando em MPC, o biofilme formado pela cepa selvagem foi menor que no meio controle (BHI), indicando que E. coli E2348/69, utilizada no pré-condicionamento do meio, produz moléculas capazes de interferir no processo de formação e na quantidade de biofilme formado por Lm; e para o biofilme formado pela cepa mutante, houve uma maior quantificação em MPC em comparação ao meio controle, o que sugere que os genes deletados possam estar envolvidos no reconhecimento das moléculas autoindutoras. Assim, os dados obtidos permitem concluir que há interação e interferência por parte de E. coli na formação de biofilme por Lm mediante produção de moléculas autoindutoras. / Listeria monocytogenes (Lm) is a Gram-positive microorganism commonly associated with foodborne diseases. Due to its ability to survive under adverse environmental conditions and to form biofilm in different abiotic surfaces, this bacterium is a concern for the food industry, since it can compromise sanitation procedures and increase the risk of post-processing contamination. Biofilm formation can be regulated by a quorum sensing mechanism, in which there is intense cell-cell communication mediated by chemical molecules, called autoinducers. Little is known about the occurrence of interaction between Gram-positive and Gram-negative bacteria on biofilm formation. Thus, in order to evaluate the occurrence of interaction between Escherichia coli and Lm, this study was developed including the following objectives: i) to evaluate the ability of Lm 1/2a and its isogenic mutant strain (&#916;prfA&#916;sigB) to form biofilm on the presence of Escherichia coli, assessing the importance of virulence regulators, prfA and sigB, in this process; and ii) to verify the production and interference autoinducers of E. coli E2348/69 on biofilm formation by Lm. Biofilm formation assays were conducted using stainless steel AISI 304 #4 immersed into broth brain heart infusion (BHI) and into preconditioned medium (MPC) by E. coli, following incubation at 25 °C. Lm at two initial concentrations (102 and 106 CFU.mL-1) and under different incubation time was tested. An indirect method for quantification of cells was applied, using crystal violet to color the biofilm, followed by optical density measurement. It was observed that Lm 1/2a and its isogenic mutant (&#916;prfA &#916;sigB) are able to form biofilm in the presence of Escherichia coli and a larger amount of biofilm was formed by wild strain Lm compared to its mutant, in a non-preconditioned medium (control), indicating that prfA and sigB are involved in biofilm formation. For MPC, the biofilm formation by the wild strain was lower than in the control (BHI), indicating that E. coli E2348/69, used in the preconditioned medium, produces molecules that can affect the formation process and the amount of biofilm formed by Lm; and in the biofilm formed by the mutant strain, there was a higher quantification of MPC compared to the control, suggesting that the deleted genes may be involved in recognition the of autoinducers. These results suggest that there is an interaction and interference of E. coli on biofilm formation by Lm due the production of autoinducers.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Fusobacterium nucleatum são microrganismos gram-negativos presentes nos processos inflamatórios e nas diferentes formas da doença periodontal. Ambos formam parte da microbiota residente da cavidade bucal humana podendo levar ao desenvolvimento de infecções endógenas ou exógenas. Neste estudo, as avaliações qualitativa, quantitativa e genotípica de A. actinomycetemcomitans e F. nucleatum isolados de pacientes com gengivite, periodontite crônica e indivíduos sadios foram realizadas. Biofilmes subgengivais de 70 pacientes com gengivite, 75 com periodontite crônica e 95 indivíduos saudáveis foram avaliados. A. actinomycetemcomitans foi isolado em 2 (2,8%) pacientes com gengivite, 4 (5,3%) com periodontite e 5 (5,3%) sadios; e F. nucleatum em 13 (18,6%) pacientes com gengivite, 20 (26,6%) com periodontite crônica e 19 (20%) sadios. Ambos os microrganismos foram isolados em 5 (7,1%) pacientes com gengivite, 9 (12%) com periodontite crônica e 3 (3,15%) sadios. Por PCR, os DNA de A. actinomycetemcomitans foram detectados em 23 (32,8%) pacientes com gengivite, 20 (26,6%) com periodontite crônica e 38 (40%) indivíduos saudáveis; e de F. nucleatum em 17 (24,3%) pacientes com gengivite, 11 (14,6%) com periodontite e 19 (20%) sadios. Em associação esses microrganismos foram detectados em 23 (32,8%) pacientes com gengivite, 40 (53,3%) com periodontite crônica e 17 (17,8%) sadios. A. actinomycetemcomitans isolados de pacientes com gengivite pertenceram aos biotipos I, II, IV, V e X, e aos sorotipos a, c, e e. Em pacientes com periodontite foram encontrados os biotipos II, VI e X, e os sorotipos a, b, e c, sendo o sorotipo c o mais predominante (80%); e em indivíduos sadios os biotipos II e X, e os sorotipos b e c. Os valores quantitativos de A. actinomycetemcomitans para os três grupos analisados variaram em número de cópias de 0 a 1,14 x 108, e de F. nucleatum de 0 a 3,98 x 106. Os resultados obtidos por AP-PCR mostram a heterogeneidade dos isolados de A. actinomycetemcomitans e de F. nucleatum nos diferentes grupos clínicos de pacientes avaliados. Esses resultados comparativos poderão ser levados em consideração pelos clínicos para melhor direcionar o tratamento da doença periodontal, colaborando de forma efetiva para o seu monitoramento. / Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Fusobacterium nucleatum are gram-negative microorganisms observed in inflammatory processes and different forms of periodontal disease. Both are part of the human oral resident microbiota which may cause endogenous or exogenous infections. In this study, a qualitative, quantitative and genotypic analysis of A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum isolated from patients with gingivitis, chronic periodontitis and healthy subjects were determined. Subgingival biofilms of 70 patients with gingivitis, 75 with chronic periodontitis and 95 healthy subjects were evaluated. A. actinomycetemcomitans was isolated in 2 (2,8%) patients with gingivitis, 4 (5,3%) with periodontitis and 5 (5,3%) healthy individuals; and F. nucleatum in 13 (18,6%) patients with gingivitis, 20 (26,6%) with chronic periodontitis and 19 (20%) healthy. Both microorganisms were identified in 5 (7,1%) patients with gingivitis, 9 (12%) with chronic periodontitis and 3 (3,15%) healthy. By PCR, DNA of A. actinomycetemcomitans were detected in 23 (32,8%) patients with gingivitis, 20 (26,6%) with chronic periodontitis and 38 (40%) healthy individuals; and F. nucleatum 17 (24,3%) patients with gingivitis, 11 (14,6%) with periodontitis and 19 (20%) healthy. In association, microorganisms were detected in 23 (32,8%) patients with gingivitis, 40 (53,3%) with chronic periodontitis and 17 (17,8%) healthy. A. actinomycetemcomitans isolated from patients with gingivitis belonged to biotype I, II, IV, V, X, and serotypes a, c and e. In patients with periodontitis biotypes II, VI and X and serotypes a, b, and c were found and serotype c was the most predominant (80%); and healthy individuals biotypes II and X, and serotypes b and c. Quantitative values for A. actinomycetemcomitans in the three patients groups were ranged from 0 to 1.14 x 108 and F. nucleatum 0 to 3.98 x 106. The results of this study by AP-PCR showed the heterogeneity of A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum in the different clinical status. These comparative results can be considered by dentists for the treatment of periodontal disease and its effective monitoring.

A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period