O objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), a presença de microrganismos sob a forma de biofilme na região do ápice radicular de dentes decíduos de humanos, com diferentes graus de patologia pulpar e periapical. Dezoito dentes foram selecionados em três situações clínicas específicas: dentes decíduos portadores de vitalidade pulpar (Grupo I), portadores de necrose pulpar sem lesão periapical visível radiograficamente (Grupo II) e portadores de necrose pulpar e nítida lesão periapical visível radiograficamente (Grupo III). Após exodontia, os dentes foram lavados com solução salina e imersos em solução de tripsina a 0,03 g/mL por 20 minutos. A seguir, foram lavados com solução tampão de cacodilato de sódio a 0,1M e armazenados em solução de Karnowsky modificada. Após cinco dias, os dentes foram seccionados e desidratados em soluções crescentes de etanol e submetidos à secagem no ponto crítico, fixados em \"stubs\" e metalizados para análise em MEV. Nos dentes do Grupo I e II, a superfície radicular estava recoberta por fibras colágenas, sem a presença de bactérias, em 100% das amostras. Nos dentes portadores de necrose pulpar e nítida lesão periapical visível radiograficamente (Grupo III), o ápice radicular apresentava ausência de fibras e presença de áreas de reabsorção com microrganismos em seu interior, representados predominantemente por cocos e bacilos, porém filamentosos e espiroquetas também foram observados, em 100% dos casos. Assim, observou-se que houve a presença de microrganismos sob a forma de biofime apical na região do ápice radicular apenas nos dentes decíduos portadores de necrose pulpar e nítida lesão periapical visível radiograficamente. / The purpose of this study was to evaluate, by scanning electron microscopy (SEM), the presence of microorganisms organized as biofilms in the apical root third of vital and nonvital human primary teeth. Eighteen teeth were selected in three clinical situations: Group I - pulp vitality, Group II - pulp necrosis without periapical lesion and Group III - pulp necrosis with well defined radiographically visible periapical lesion. After extraction, the teeth were washed with saline and immersed in 0.03 g/mL trypsin solution during 20 minutes. Next, the teeth were washed in 0,1M sodium cacodilate buffer and stored in receptacles containing modified Karnovsky solution. After 5 days, the teeth were sectioned, dehydrated in an ethanol series, critical-point dried with CO2, sputter-coated with gold and examined by SEM. The results showed that in the teeth of Groups I and II, the root surface was covered by collagen fibers, without the presence of bacteria in all specimens (100%). In the teeth with pulp necrosis with well defined radiographically visible periapical lesion (Group III), the root apex showed no collagen fibers and presence of resorption areas containing microorganisms (cocci, bacilli, filaments and spirochetes) in all cases (100%). The presence of microorganisms organized as biofilms was detected only in the primary teeth with pulp necrosis and radiographically visible periapical lesion.

Em contraste com a vasta descrição na literatura científica dos biofilmes bacterianos, poucos trabalhos focam o estudo da formação e as estratégias de inibição da constituição do biofilme fúngico. Este trabalho objetiva a caracterização do potencial antifúngico e antibiofilme do sal imidazólico 1-metil-3-octilimidazol cloreto (C16MImCl), e das frações (F70 e F90) purificadas de saponinas mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), frente a células de biofilme de seis isolados clínicos de Candida tropicalis. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do C16MImCl foi de 0,014μg/mL frente às células planctônicas, ao passo que as Frações de Saponinas da Erva Mate (FSEM) não apresentaram atividade antifúngica. Utilizando o cateter traqueal (CT) como corpo de prova, foi utilizado para avaliar a capacidade de inibição e remoção do biofilme. Avaliou-se também a Concentração Mínima de Erradicação do Biofilme (CMEB) para remoção do biofilme pré-formado pelo método da microplaca. Para a atividade antibiofilme foi observado que o C16MImCl, apresentou melhor resultado quando comparado ao fluconazol. As FSEM também apresentaram atividade antibiofilme quando comparados ao fluconazol, entretanto menores do que o tensoativo sintético Pela análise dos resultados de CMEB, o C16MImCl foi o composto com maior capacidade de erradicar o biofilme pré-formado, na concentração de 0,9 μg/mL (92% a 100% de remoção do biofilme). Os demais compostos testados (fluconazol, FEM e a água) não apresentaram atividade removedora, observando-se valores menores que 80% de remoção. Tanto as concentrações nas quais C16MImCl inibiu as células planctônicas (0,014 μg/mL) como as de biofilme (0,028 -0,225 μg/mL) foram mais baixas que as obtidas pelo fluconazol. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destes tensoativos, principalmente o C16MImCl, que demonstrou baixa toxicidade e provável mecanismo de ação sobre a síntese do ergosterol. Assim, é possível afirmarmos que estes tensoativos representam uma potencial alternativa para o controle químico de fungos leveduriformes, especialmente as ocasionadas por células de biofilme por C. tropicalis. / In contrast to the extensive description in the literature of bacterial biofilms, few works focus on the study of the formation and strategies for inhibiting the formation of fungal biofilms. This work aims to characterize the antifungal potential and antibiofilm the imidazole salt 1 - methyl - 3 - octilimidazol chloride (C16MImCl), and fractions (F70 and F90) purified saponins mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), against to biofilm cells of six clinical isolates of Candida tropicalis. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C16MImCl was 0.014 mg / mL to planktonic cells, whereas the Saponin Fractions of Yerba Mate (SFYM) showed no antifungal activity. Using the tracheal catheter (CT) as a specimen was used to evaluate the ability of the biofilm inhibition and removal. We also assessed the Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) to remove the preformed biofilms by the microplate method. For antibiofilm activity was observed that C16MImCl, showed better results when compared to fluconazole. The SFYM also had antibiofilm activity when compared to fluconazole, however smaller than the synthetic surfactant. By analyzing the results MBEC, the compound C16MImCl was capacity to eradicate pre- formed biofilm in a concentration of 0.9 mg / mL (92% to 100% biofilm removal) The other tested compounds (fluconazole, SFYM and water) showed no activity remover, observing less than 80 % removal values. Both concentrations at which they inhibit planktonic cells C16MImCl (0.014 μg/mL) and the biofilm (0.028 -0.225 μg/ml) were lower than those obtained by fluconazole. The results obtained demonstrate the potential of these surfactants, especially C16MImCl, which demonstrated low toxicity and probable mechanism of action on the synthesis of ergosterol. Thus, it is possible to assert that these surfactants are a potential alternative to chemical control of yeasts, especially those caused by biofilm cells of C. tropicalis.

Biofilmes são aglomerados complexos de células microbianas que crescem na superfície de um material sólido, como um metal. As superfícies metálicas são amplamente utilizadas em dispositivos biomédicos cirúrgicos e em superfícies de mobiliário intra-hospitalares as quais podem ser infectadas por bactérias epidemiologicamente importantes e permitir o desenvolvimento de um biofilme. O objetivo desse trabalho foi avaliar a superfície topográfica dos metais puros, incluindo: chumbo, cromo, estanho, ferro e níquel, avaliar a aderência bacteriana nestas superfícies, com a consequente formação de biofilme e a potencial citotoxicidade dos metais por meio de microscopia de força atômica (MFA), microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A metodologia constou de observações microscópicas e procedimentos bacteriológicos. A aderência bacteriana foi verificada por meio de MEV e a viabilidade celular bacteriana por contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC). A citotoxicidade dos metais foi avaliada frente a células CHO-K1 por ensaio XTT. As bactérias selecionadas foram: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (gram-negativos); Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus (gram-positivos) Para realizar o estudo, foram preparados corpos de prova dos metais puros e colocados em contato com cada uma das bactérias (da ordem 108 UFC/mL). Os resultados mostraram a formação de biofilme em cada um dos corpos de prova. A contagem das células viáveis demonstrou a recuperação de 105 UFC/mL para Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus após contato com os metais chumbo, cromo, estanho, ferro e níquel, e para Staphylococcus epidermidis após contato com chumbo, níquel e cromo houve uma redução bacteriana de 103 UFC/mL. Para Staphylococcus epidermidis após contato com estanho foram recuperadas 1,14 x 102 UFC/mL e para o ferro, houve recuperação de 1,3 x 103 UFC/mL. A MEV demonstrou nestas superfícies metálicas, os bacilos e cocos aderidos e agrupados em uma massa amorfa formando biofilme. Os resultados da rugosidade (Ra) de cada uma destas superfícies obtidos por MFA em varredura em 2 microns da superfície, mostram que o Ra do chumbo foi de 38.258 &#956m; estanho 13.481 &#956m; níquel 3.929 &#956m; ferro 3.689 &#956m e cromo 2.097 &#956m. Os resultados do teste XTT, após contato com as células CHO-K1, mostram que o ferro foi citotóxico para estas células (p<0,05) diferença estatisticamente significante em relação ao controle negativo. Os metais puros avaliados nas condições experimentais do estudo mostram que as superfícies dos metais puros não impedem a aderência bacteriana e formação de biofilme das bactérias selecionadas. / Biofilms are complex microbial cell clusters that are growing on the solid material surface, as a metal. The metalic surfaces are widely used in surgical biomedical devices and hospital furniture surfaces which can be infected by important bacteria and to allow biofilm development. The aim of this work was to evaluate the topographic surface of the lead, chromium, tin, iron and nickel pure metals, evaluate bacterial adhesion in these surfaces with subsequent biofilm formation and the potential cytotoxicity of metals through force microscopy atomic (AFM), optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). The methodology consisted of microscopic observations and bacteriological procedures. Bacterial adherence was observed by SEM and the bacterial cell viability by colony forming units colony counts (CFU). The cytotoxicity of metals was evaluated using CHO-K1 cells by XTT assay.The isolated bacteria were: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (gram-negative), and Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus (gram positive). In order to realize this study, samples of pure metals were prepared and put in touch with each bacteria (in 108 CFU/mL). The results show biofilm formation in each of the specimens. The counting of viable cells demonstrated a recovery 105 CFU/mL for Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus after contact with lead, chromium, tin, iron and nickel metals and Staphylococcus epidermidis after contact with lead, nickel and chromium there was a bacterial reduction of 103 CFU/mL. For Staphylococcus epidermidis after contact with tin were recovered 1.14 x 102 CFU / mL and the iron, there was a recovery of 1.3 x103 CFU/mL. The data show that there was a bacterial reduction of 103 CFU/mL viable cells. Staphylococcus epidermidis on contact with tin were recovered 1,14 x 102 and the iron recovery was 1,3 x 103 UFC/mL. SEM showed the metal surfaces, bacilli and coccus adhered and grouped in an amorphous mass forming biofilm. The results of the roughness (Ra) of each of the surfaces obtained by AFM scan of 2 microns from the surface, show that the RA lead was 38,258 uM; Tin 13,481 uM; Nickel 3,929 uM; iron 3,689 &#956m and chrome 2,097 &#956m. The results of XTT, after contact with the CHO-K1 cells, show that iron was cytotoxic to these cells (p <0.05) statistically significant difference compared to the negative control. Pure metals evaluated in the experimental conditions of the study show that the surfaces of pure metals do not prevent bacterial adherence and biofilm formation of the bacteria selected.

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito de filmes finos depositados por plasma nas propriedades de superfície, ópticas, microbiológicas e mecânicas de materiais restauradores indiretos. Utilizou-se discos de porcelana (PC) (VM9, VITA, Zahnfabrik) e compósitos indiretos (Enamic (EN) e Lava Ultimate (LU) ) (12 x 1,1 mm). Diferentes metodologias de deposição dos filmes foram estabelecidas: polimerização a plasma (PECVD) com 70%HMDSO/30%argônio (PAr); PECVD com 70%HMDSO/30%oxigênio (PO2); implantação iônica e deposição por imersão em plasma usando 70%HMDSO/30%argônio (PIDP). Um grupo sem filme foi usado como grupo controle (CTL) O reator de plasma foi bombeado até 2,0 Pa e HMDSO, oxigênio ou argônio foram admitidos no reator estabelecendo a pressão de 20 e 24 Pa. O plasma foi estabelecido pela aplicação de radiofrequência (13,56 MHz, 50-150 W, 30 ou 10 min) à um porta amostra em um sistema capacitivamente acoplado. A rugosidade e a espessura do filme foram determinadas por perfilometria; a molhabilidade foi medida pelo ângulo de contato. A morfologia foi avaliada utilizando microscopia eletrônica de varredura e de força atômica e a composição química foi investigada por espectroscopia de energia dispersiva (EDS), de fotoelétrons excitados por raios-x (XPS) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier. A razão de contraste e diferenças de cor foram estudadas pela espectrofotometria no visível. As propriedades mecânicas e tribológicas dos filmes foram determinadas por nanoindentação e nanoriscos. O crescimento do biofilme foi avaliado por microscopia confocal de varredura a laser. As propriedades mecânicas foram determinadas pela resistência à flexão biaxial e fadiga. Todos os dados foram analisados estatisticamente (?=0,05). A rugosidade não foi alterada para a maioria dos grupos com filme, exceto para PC-PAr (p=0,023) e EN-PIDP (p=0,001), que tiveram uma diminuição e aumento, respectivamente. As espessuras dos filmes foram de 620 nm (PAr), 540 nm (PO2) e 70 nm (PIDP). A molhabilidade para todos os grupos com filmes diminuiu, exceto o grupo LU-PIDP (p<0,001). A análise morfológica demonstrou que os filmes revestiram os substratos uniformemente sem descontinuidades. Os filmes PO2 apresentaram estruturas granulares que se apresentaram em menor tamanho e quantidade para PAr e PIDP. A composição química dos filmes revelou três elementos principais: silício, oxigênio e carbono. PAr apresentou uma composição mais orgânica, enquanto PO2 e PIDP mostraram uma natureza mais inorgânica. A razão de contraste diminuiu apenas em LU-PIDP (p<0.001) e os valores de ?E ficaram abaixo de 3,3 para todos os grupos com filme. As propriedades mecânicas e tribológicas foram alteradas com a presença dos filmes, de acordo com cada substrato. Os filmes PAr demonstraram a menor dureza e o maior coeficiente de atrito. Os filmes PO2 e PIDP apresentaram maior dureza e menor coeficiente de atrito. Os filmes alteraram o biofilme formado e a viabilidade das colônias em parâmetros específicos. Não houve mudança na resistência e probabilidade de falha dos materiais com filmes. Conclui-se que os filmes finos depositados alteraram as propriedades de superfície e a formação do biofilme, mantendo a cor e rugosidade abaixo de valores críticos e não influenciaram na resistência mecânica ou probabilidade de falha dos materiais restauradores. / The aim of this study was to investigate the effect of plasma deposited thin films on surface, optical, microbiological and mechanical properties of indirect restorative materials. A porcelain (VM9, VITA, Zahnfabrik) and indirect composite disks (Enamic, VITA; Lava Ultimate, 3M ESPE), were used (12 x 1.1 mm). Different methodologies of film deposition were established: plasma-enhanced chemical vapor deposition (PECVD) with 70%HMDSO/30%argon (PAr); PECVD with 70%HMDSO/30%oxygen (PO2); plasma immersion ion implantation and deposition using 70%HMDSO/30%argon (PIDP). Samples with no films were used as control group (CTL). The plasma reactor was pumped down to 2.0 Pa and HMDSO, oxygen or argon were admitted to the reactor establishing the pressure of 20 and 24 Pa. The plasma was ignited by the application of radiofrequency power (13.56 MHz, 50-150 W, 30 or 10 min) to the lowermost sample holder of a capacitivelly-coupled system. Surface roughness and film thickness were determined by perfilometry. Wettability was measured with a goniometer. Morphological analysis was evaluated using scanning electron microscopy and atomic force microscopy. Surface chemical composition was investigated by energy-dispersive and x-ray photoelectron spectroscopy and Fourier-transform infrared spectroscopy. Optical properties were studied by contrast ratio and color differences. Mechanical and tribological properties of the coatings were determined by nanoindentation and scratching test. Biofilm growth was evaluated by confocal laser scanning microscopy. Mechanical properties were determined by biaxial flexural strength and fatigue test. Data were analyzed by statistically (alpha=0.05). Surface roughness was not changed for most of groups after film deposition, PC-PAr and EN-PIDP groups, showed a decrease (p=0.023) and an increase (p=0.001), respectively. The films\' thicknesses were 620 nm (PAr), 540 nm (PO2) and 70 nm (PIDP). A decrease in wettability for all film groups was detected, except LU-PIDP (p<0.001). Morphological analysis demonstrated that films coated the substrates uniformly without any discontinuities. For all materials in PO2, granular structures covered the surface. For PAr and PIDP, these structures decreased. The films\' chemical composition revealed three main elements: silicon, oxygen and carbon. PAr presented a more organic behavior. PO2 and PIDP showed an inorganic nature. For contrast ratio there was only a decrease for LU-PIDP (p<0.001) and color differences continued below 3.3. Mechanical and tribological properties were changed with the presence of the coatings, according to each substrate. PAr films demonstrated the lowest hardness and highest friction coefficient. PO2 and PIDP films had higher hardness and lower friction coefficient values. The films, in different parameters, altered biofilm structure and colony viability. There was no change in strength and failure probability for all coated groups. It can be concluded that plasma-deposited thin films altered specific surface characteristics and biofilm growth, maintaining color properties and surface roughness below established thresholds and strength and failure probability didn\'t differ with the presence of the thin films.

A mastite subclínica em caprinos é causada principalmente pelo Staphylococcus spp., sendo os estafilococos coagulase negativa (SCN) os patógenos de maior ocorrência e o S. aureus, a espécie de estafilococos mais pesquisada. Dessa forma, pouco se conhece sobre a patogenicidade de SCN e outros estafilococos coagulase positiva (SCP), além do S. aureus. Também há poucos estudos sobre a variação da viabilidade celular na mastite subclínica de cabras. Assim, o objetivo do presente estudo foi determinar os fatores de virulência de adesão e produção de biofilme de estirpes de Staphylococcus spp. isoladas de amostras de leite de cabras, verificando possíveis associações com a viabilidade celular. Para realizar a colheita das amostras, primeiramente, foi efetuada um exame físico da glândula mamária, com posterior realização dos testes da caneca de fundo preto e California mastitis test (CMT). A colheita do leite foi efetuada em três alíquotas: análises microbiológicas, contagem de células somáticas (CCS) e viabilidade celular. Realizou-se a identificação, teste de antibiograma e PCR (Reação em cadeia polimerase) dos Staphylococcus spp. isolados nas amostras de leite. Os genes de virulência pesquisados no PCR foram: cna, eno, ebpS, fnbA, fnbB, fib e bap. Avaliou-se a quantidade de CCS, em equipamento de citometria de fluxo, e a viabilidade celular, após centrifugações das amostras de leite e visualização das células em microscópio, utilizando o corante azul de Trypan. Os resultados foram: 122 amostras com crescimento bacteriano e dessas, 110 (90,2%) foram identificadas como Staphylococcus spp., sendo 90 (73,8%) de SCN e 12 (16,4%) de SCP. As espécies mais isoladas de estafilococos foram: S. epidermidis (24,55%), S. lugdunensis (15,40%) e S. intermedius (13,64%). As amostras apresentaram maior resistência aos antimicrobianos: penicilina (81,8%), oxacilina (60,0%) e ampicilina (55,5%). Observou-se maior sensibilidade para: enrofloxacina (99,1%), eritromicina (98,2%), gentamicina (98,2%) e vancomicina (98,2%). Com relação aos fatores de virulência pesquisados, foram encontradas amostras positivas para todos os genes, com exceção do gene fnbB: eno (53,6%), bap (43,7%), ebpS (19,1%), fnbA (18,2%) e fib (16,4%). Mais de um gene foi detectado em algumas estirpes, sendo que as associações de maior ocorrência foram: bap/eno em SCN e ebpS/eno/fib/fnbA em SCP. Os valores da CCS das amostras de leite com isolamento de Staphylococcus spp., SCN e SCP foram maiores do que nas amostras sem isolamento bacteriano e as estirpes com presença da associação de genes ebpS/eno/fib/fnbA apresentaram maior CCS do que bap/eno. Com relação à viabilidade celular, as amostras com isolamento de Staphylococcus spp. apresentaram maior viabilidade celular do que as amostras sem isolamento bacteriano e não houve associação dos genes identificados nas estirpes com a viabilidade celular. Concluiu-se que os genes eno e bap apresentaram maior ocorrência nas estirpes de Staphylococcus spp., sendo os mais encontrados nos isolados de SCN e os genes ebpS, fib e fnbA foram os mais detectados nos SCP. A viabilidade celular foi maior nas amostras com isolamento de Staphylococcus spp. em relação as sem isolamento bacteriano e não houve associação entre os fatores de virulência das estirpes de Staphylococcus spp. e a viabilidade celular. / Subclinical mastitis in goats is mainly caused by Staphylococcus spp., coagulase-negative staphylococci (CNS) is the most frequent pathogens and S. aureus, the most researched specie of staphylococci. Thus, little is known about the pathogenicity of SCN and other coagulase-positive staphylococci (CPS), beyond the S. aureus. There are few studies on the variation of cell viability in subclinical mastitis of goats. The aim of the present study was to determine the virulence factors of adhesion and biofilm production of Staphylococcus spp. strains isolated from milk samples of goats, verifying for possible associations with cell viability. To collect samples, firstly, was performed a physical examination of the mammary gland, with subsequent tests for mug of black background and California mastitis test (CMT). Three aliquots of milk were collected: microbiological analysis, somatic cell count (SCC) and cell viability. Identification, antibiotic susceptibility testing and PCR (polymerase chain reaction) were performed of Staphylococcus spp. isolated from milk samples. Virulence genes researched in PCR were: cna, eno, ebpS, fnbA, fnbB, fib and bap. Evaluation of CCS, using flow cytometry equipment, and cell viability, after centrifugation of milk samples and visualization the cells in the microscope using Trypan blue dye, were performed. The results were: from 122 samples with bacterial growth, 110 (90.2%) were identified as Staphylococcus spp., 90 (73.8%) of CNP and 12 (16.4%) of the CNP. The most isolated staphylococci species were: S. epidermidis (24.55%), S. lugdunensis (15.40%) and S. intermedius (13.64%). Samples showed higher resistance to antimicrobials: penicillin (81.8%), oxacillin (60.0%) and ampicillin (55.5%). We observed higher sensitivity to: enrofloxacin (99.1%), erythromycin (98.2%), gentamicin (98.2%) and vancomycin (98.2%). Regarding virulence factors researched, positive samples were found for all genes, except fnbB gene: eno (53.6%), bap (43.7%), ebpS (19.1%), fnbA (18.2%) and fib (16.4%). More than one gene were detected in some strains, with the most frequent associations were bap/eno in CNS and ebpS/eno/fib/fnbA in CNP. The values of SCC of milk samples with isolation of Staphylococcus spp., CNS and CNP were higher than samples without bacterial isolation and the isolation of strains with combination of ebpS/eno/fib/fnbA genes showed higher SCC than bap/eno. Regarding cell viability, samples with isolation of Staphylococcus spp. showed higher cell viability than samples without bacterial isolation and there was no association of the genes identified in strains with cell viability. In conclusion, eno and bap genes were more frequent in Staphylococcus spp. strains, eno and bap genes were mostly found in isolated CNS and ebpS, fib and fnbA genes were more detected in CNP. Cell viability was higher in samples with isolation of Staphylococcus spp. compared those without bacterial isolation and there was no association between the virulence factors of Staphylococcus spp. strains and cell viability.

O biofilme bacteriano é o agente etiológico primário no desenvolvimento da resposta inflamatória observada na doença periodontal. Os receptores do tipo NOD (NLRs) são proteínas citosólicas que reconhecem componentes microbianos presentes no citoplasma liberados por bactérias invasoras. Sabendo que bactérias periodontopatogênicas têm a capacidade de invadir e colonizar diversas células do tecido periodontal, o presente projeto tem o objetivo de estudar a participação dos receptores do tipo NOD (NOD1 e NOD2) no reconhecimento das bactérias Porphyromonas gingivalis, na modulação da resposta imune e no processo de reabsorção óssea. Camundongos isogênicos machos da linhagem C57BL/6 (WT) e camundongos deficientes para o receptor NOD1 (NOD1-/-) e receptor NOD2 (NOD2-/-) foram infectados com Phorphyromonas gingivalis utilizando um modelo experimental de doença periodontal. O grau de reabsorção óssea foi avaliado por análise morfométrica macroscópica e histológica da maxila, além da quantificação do número de osteoclastos na crista óssea alveolar. O grau de inflamação local foi realizado por contagem do número total de bactérias orais, quantificação de neutrófilos no tecido gengival (MPO) e avaliação dos mediadores inflamatórios por ELISA. Foi também avaliada a expressão de marcadores osteogênicos e osteoclastogênicos no tecido gengival pela técnica de qPCR. Animais NOD1-/- e NOD2-/- apresentaram menor delta de reabsorção óssea quando comparados aos animais WT. Animais NOD2-/- infectados apresentaram debilitado controle bacteriano quando comparados aos animais WT infectados. Animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados apresentaram baixa expressão de Cxcl1 e MPO quando comparados aos animais WT infectados. Além disso, foi observado que animais NOD2-/- infectados apresentaram reduzida produção de TNF-&alpha; e elevada produção de IL-10 quando comparados aos animais WT infectados. Não foi detectado diferença estatística na expressão de fatores osteogênicos, Runx2 e osteocalcina, entre animais WT, NOD1-/- e NOD2-/- infectados. Embora não houve diferença no número de células TRAP positivas presentes na crista óssea alveolar entre os grupos no tempo avaliado, animais WT infectados apresentaram elevada expressão gênica de RANKL/OPG quando comparados aos animais NOD2-/- infectados. Além disso, a expressão de marcadores de atividades dos osteoclastos, catepsina k e matrix metaloproteinase-9, foi significantemente baixa nos animais NOD1-/- e NOD2-/- infectados quando comparados aos animais WT infectados. Esses resultados permitem sugerir que independente das variáveis observadas, verificamos que a ausência dos dois receptores impede a rápida progressão da reabsorção óssea alveolar observada na periodontite, portanto os receptores NOD1 e NOD2 contribuem para progressão da reabsorção óssea no modelo experimental de periodontite. / The bacterial biofilm has been identified as an etiological agent in the pathogenesis of periodontal disease. The NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins that sense microbial by products released by invasive bacteria. Since periodontopathogenic bacteria are able to invade and colonize some periodontal tissue cells, the purpose of this study is to determine the role of NOD1 and NOD2 receptors in the recognition of invasive periodontopathogenic bacteria such as Porphyromonas gingivalis, modulating the immune response and bone resorption. Isogenic strain C57BL/6 males (WT), NOD1 (NOD1-/-) and NOD2 (NOD2-/-) knockout mice were infected with Porphyromonas gingivalis in an experimental model of periodontal disease. Alveolar bone resorption was evaluated by macroscopic and histological morphometric analysis, quantification of osteoclasts numbers in bone crest alveolar. Imune inflammatory response was evaluated by, bacterial load, neutrophils quantification and inflammatory mediators levels by ELISA. We also evaluated the osteogenic and osteoclastogenic markers expression in gingival tissue by Real time PCR techniques. NOD1-/- and NOD2-/- animals showed lower bone resorption when compared to WT animals. NOD2-/- infected animals expressed higher bacterial load compared to WT infected ones. NOD1-/- and NOD2-/- infected animals presented lower Cxcl1 and MPO levels compared to WT infected animals. In addition, NOD2-/- infected animals presented lower level of TNF-&alpha; and higher level of IL-10 when compared to WT infected animals. There was no significant difference in the osteogenic factors expression, Runx2 and osteocalcin, when compared NOD1-/- and NOD2-/- infected animals to WT infected ones. Although there was no difference in TRAP-positive cells number evaluated in the alveolar bone crest among the studied groups, WT infected animals showed elevated ratio RANKL/OPG when compared to NOD2-/- infected animals. Moreover, the expression of osteoclasts activity markers, cathepsin k and matrix metalloproteinase-9, was significantly lower in NOD1-/- and NOD2-/- infected animals compared to WT infected ones. These results suggest that NOD1 and NOD2 receptors contribute to progression of bone resorption in experimental model of periodontitis, since the lack of NOD like receptors impair the bone resorption.

Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, still poses a huge global health threat today. During infection, the bacilli are believed to confront with various stresses, including hypoxia. Hypoxia is known to trigger the bacteria to adapt into a nonreplicating dormant state associated with reduced drug susceptibility. In addition to dormancy, mycobacteria, like other bacteria, may switch to sessile biofilm growth that is generally associated with augmented drug and stress tolerance. Bacterial biofilm is physically heterogeneous and may harbor cells displaying distinct metabolic activities. It is therefore likely that some cell populations within an established biofilm are in a nonreplicating dormant state. A better understanding of mycobacterial dormancy establishment and biofilm growth could unveil crucial bacillary survival strategies that will provide insights into a rational design of chemotherapy regimen.The mycobacterial chaperonin 60.1 (Cpn60.1, also known as GroEL1), a probable chaperonin and/or nucleoid associated protein, is necessary for mycobacterial cell wall virulence lipid biosynthesis, which was reported to be enhanced at the early stage of mycobacterial hypoxic adaptation, and for reduced drug susceptibility under aerobic condition. We therefore investigated whether Cpn60.1 was essential for mycobacterial adaptation to hypoxic dormancy using Mycobacterium bovis BCG as the model organism. We found that Cpn60.1, although nonessential for mycobacterial survival, reduced isoniazid (INH) susceptibility under hypoxia. Unexpectedly and interestingly, INH’s bactericidal activity was found to involve electron transport chain perturbation (e.g. enhanced oxygen consumption and increased adenosine triphosphate level) via NADH dehydrogenases, succinate dehydrogenases, cytochrome bc1 and F0F1 ATP synthase. Moreover, respiratory reprogramming to cytochrome bd was observed to protect against INH-induced killing.Intriguingly, we found that Cpn60.1 was required for respiratory and energetic downregulation under excess glycerol as well as in response to drugs (such as Q203 inhibiting cytochrome bc1). Cpn60.1 also played a role in lipidomic adaptation under excess glycerol (e.g. enhanced phthiocerol dimycocerosate and glycerol-based lipids synthesis but repressed trehalose-based lipids synthesis). Defective energetic downregulation in the absence of Cpn60.1 compromised the establishment of the Crabtree effect characterized by respiratory downregulation, glycolytic enhancement and secretion of several metabolites (i.e. pyruvate, succinate, acetate and glutamate). The Crabtree effect was necessary for mycobacterial adaptation to excess glycerol and biofilm growth. Due to a compromised Crabtree effect, a Cpn60.1-deficient Mycobacterium bovis BCG strain, i.e. the Δcpn60.1 strain, suffered from methylglyoxal-induced growth stasis under excess glycerol, leading to the biofilm defect under the standard biofilm medium. Given the essentiality for Cpn60.1 in mycobacterial respiratory adaptation under stresses, it is likely that the enhanced INH susceptibility of the Δcpn60.1 strain under hypoxia was due to a problematic respiratory reprogramming.In summary, Mycobacterium bovis BCG Cpn60.1 is not required for bacillary survival under hypoxic dormancy. However, it participates in various adaptations (e.g. respiratory downregulation) necessary for mycobacterial biofilm growth and for escaping INH’s bactericidal mechanism. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Geraldo Batista de Melo / Banca: Silvana Soléo Ferreira dos Santos / Banca: Rosilene Fernandes da Rocha / Resumo: Na procura de meios preventivos e curativos para doença periodontal e cárie dentária, plantas medicinais com finalidade fungicida, bactericida e antiinflamatória vêm sendo investigadas. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar a atividade antimicrobiana utilizando-se óleos essenciais de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Curcuma zedoaria Roscoe e Tagetes minuta L. sobre cepas de Staphylococcus spp., Streptococcus mutans e Candida spp. em crescimento planctônico e em biofilme. Para estudo dos microrganismos em crescimento planctônico, foram determinadas a Concentração Inibitória Mínima e a Concentração Fungicida Mínima de nove cepas clínicas e uma cepa padrão para cada espécie: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, S. aureus, S. epidermidis e S. mutans. Para avaliação dos efeitos dos óleos essenciais em biofilme, foram utilizadas cepas padrão de Candida albicans (ATCC 18804), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Streptococcus mutans (ATCC 35688) isolados e em associações em corpos-de-prova durante cinco dias. A seguir, os corpos-de-prova em resina acrílica foram lavados e colocados em contato com óleos essenciais durante 5 min. O número de unidades formadoras de colônias obtidas em cada biofilme (UFC/mL) foram submetidos à análise estatística descritiva e teste t-Student utilizando-se o software Minitab considerando-se o nível de significância p ≤ 0,05. Também foi realizada microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos corpos-de-prova em resina acrílica com biofilme com tratamento e controle. Foram observadas reduções significativas do número de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) tanto no biofilme como em associação. As maiores reduções ocorreram no tratamento do óleo essencial de C. citratus, seguidas pelo óleo de T. minuta e C. zedoaria. Os óleos essenciais de Cymbopogon citratus, Tagetes minuta e Curcuma zedoaria apresentaram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the search for preventive and curative means for periodontal disease and tooth decay, herbal-purpose fungicide, antibacterial and anti-inflammatory have been investigated. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity using the essential oils of Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, Curcuma zedoaria Roscoe and Tagetes minuta L. on strains of Staphylococcus spp., Streptococcus mutans and Candida spp. in planktonic and biofilm growth. For the study of microorganisms in planktonic growth, were determined Minimum Inhibitory Concentration and Minimum Microbicidal Concentration of nine clinical strains and one ATCC for each species: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, S. aureus, S. epidermidis and S. mutans. To assess the effects of essential oils in biofilm, was used strains of Candida albicans (ATCC 18804), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and Streptococcus mutans (ATCC 35688) alone and in associations in acrylic resin discs immersed in sterile brain heart infusion broth (BHI) containing 5% sucrose, inoculated with microbial suspension and incubated for 5 days. On the fifth day, the discs were washed in sterile saline solution in order to remove loosely bound material. Next, the acrylic resin discs were washed and placed in contact with essential oils for 5 min. The number of CFU obtained in each biofilm (CFU/mL) were subjected to descriptive statistical analysis using Minitab software considering with significance level p ≤ 0.05. It was also performed scanning electron microscopy (SEM) acrylic resin disc with biofilm with treatment and control. It was identified significant reductions in the number of colony forming units (CFU/mL) in both planktonic and biofilm associated. The largest reductions occurred in the treatment of essential oil of C. citratus, followed by oil of T. minuta and C. zedoaria. We conclude that the essential oils of Cymbopogon citratus... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae. / Plasmids are extrachromosomal DNA that have the ability to duplicate independently of the host cells. Plasmids are responsible for the expression of a variety of characteristics of the cells, such as virulence factors. The present study utilized a receptor strain of E. Coli K12-R23 and strains of Klebsiella pneumoniae and E. coli which were R plasmids donor strains and transconjugant ones. The objective of this study was to analyze the attributed phenotypes of transconjugant strains in both bacteria caused by transference of R plasmids from the donor strains to the receptor ones. In order to analyze these phenotypes, the following variables were selected: sensitivity to antimicrobials and ROS, adherence to HEp-2 cells, and slime and biofilm structures. The marker of the presence of plasmids was gentamycin resistance in the donor strains. The observed results indicated that there was plasmid transfer; given that Klebsiella pneumoniae and E. coli strains presented the marker (e.g. they became resistant to gentamycin). Moreover, transconjugant strains have showed distinct profiles from the receptor strain concerning sensitivity to antimicrobials, ROS, adherence patterns to HEp-2 cells and slime structure. On the other hand, the biofilm structure of these strains did not present modifications. Yet, it was observed that several characteristics of the donor strains were not found in the transconjugant strains of E. coli and K. pneumoniae.