Resumo: A maioria dos casos de fraturas ósseas é utilizada nas cirurgias, implantes ortopédicos de osteossíntese (placa-parafuso e parafusos) confeccionados em aço inoxidável austeníticos, devido à sua baixa relação custo-benefício. As infecções associadas aos implantes de osteossintese estão relacionadas com o crescimento de microrganismos em biofilmes, resultando em um processo infeccioso de difícil erradicação. O objetivo do estudo foi identificar os microrganismos recuperados do conjunto metálico placaparafuso e parafusos após remoção cirúrgica, avaliar a capacidade de aderência dos microrganismos, verificar a viabilidade celular, caracterizar genotipicamente os isolados Gram-positivos e detectar a resistência aos antimicrobianos. Os conjuntos placa-parafuso e parafusos de aço inoxidável austenítico ASTM F138/F139 e ISO NBR 5832-1/9 foram transportados em bolsa de polietileno para o Laboratório de Microbiologia Clínica. Os implantes foram lavados em solução tampão fosfato-salino, armazenados em bolsa contendo solução Ringer e submetidos ao banho ultrassônico em freqüência de 40±2 kHz por 5 minutos. O fluido sonicado foi transferido para tubos Falcon e centrifugado a 3.000g durante 20 minutos. O sedimento foi resuspendido em nova solução Ringer, homogeneizado por vortex e 10μL semeados em ágar Sangue de carneiro 5%, MacConkey e Sabouraud. Os meios foram incubados em diferentes condições de temperatura por 7 a 14 dias para recuperação de microrganismos. O perfil de resistência dos isolados foi obtido de acordo com CLSI 2011. Para análise da viabilidade celular foi utilizado o kit Live/Dead e microscópio de fluorescência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The majority of cases of bone fractures is used in surgery, internal fixation of orthopedic implants (screw-plate and screws) manufactured in austenitic stainless steel due to its low cost-benefit. Infections associated with implant fixation are related to the growth of microorganisms in biofilms, resulting in an infection difficult to eradicate. The objective of study was to identify the microorganisms recovered from the set screwplate and screws metallic after surgical removal, evaluate the capacity of adherence of microorganisms, check the cell viability and characterize the isolates genotypically Gram-positive and detect antimicrobial resistance. The sets screw-plate and screws of austenitic stainless steel ASTM F138/F139 and ISO NBR 5832-1/9 were transported in polyethylene bag to the Laboratory of Clinical Microbiology. The implants were washed in phosphate buffered saline solution, stored in bags containing Ringer's solution and submitted to ultrasonic bath at a frequency of 40 kHz ± 2 for 5 minutes. The sonicate fluid was transferred to falcon tubes and centrifuged at 3.000g for 20 minutes The new sediment was re-suspended in Ringer's solution, homogenized by vortex and 10μL seeded agar 5% sheep blood, MacConkey and Sabouraud. The media were incubated at different temperatures for up to 7 days for growth of CFU mL-1. The resistance profile of the isolates was obtained according to CLSI 2011. For analysis of cell viability kit was used for Live/Dead and fluorescence microscope. After microbiological analysis the isolation was observed in some samples of polymicrobial implants. The data obtained showed that bacteria were the most isolated coagulase-negative... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Clarice Queico Fujimura Leite / Coorientador: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Banca: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Denise Crispin Tavares / Mestre

Made available in DSpace on 2015-02-24T17:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MagdaRAF_DISSERT.pdf: 2639129 bytes, checksum: 3c6efd5066d343bdfde86e4cf41e1a70 (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The increase in the incidence of fungal infections due to the drug-resistance or to the number of patients with immune alterations such as AIDS, chemotherapy or organ transplantation, has done the research necesseray for new antifungal drugs. The species from Northeastern Brazil may become an important source of innovative natural molecules. To evaluate the antifungal activity of 10 medicinal plants from Northeastern Brazil, traditionally used as antimicrobial agents, 30 crude extracts (CE) were tested in vitro against four standard species of Candida spp. The CE most promising of these plants were evaluated against yeasts of the oral cavity of kidney transplant patients and through a bioassay-guided fractionation. The extracts form leaves of E. uniflora, the stem bark of L. ferrea and leaves of P. guajava showed significant activity against all yeasts evaluated, with MIC values between 15.62 and 62.5 μg/mL. E. uniflora also showed fungicidal properties against all yeasts, especially against Candida dubliniensis. In patients with immune systems compromised, such as transplanted, oral candidiasis manifests mainly due to immunosuppressive therapy, and resistance to conventional antifungals. The CE of E. uniflora presented range of MIC values between 1.95 to 1000 μg/mL, and lower MIC50 and MIC90 values were observed against C. non-albicans. Due the better results, the CE of E. uniflora was elected to performe the bioassay-guided fractionation. Thus it was possible to obtain enriched fractions, which showed good inhibitory ability against ATCC strains of Candida spp. It was also possible to perform experiments to verify the production of biofilm in two strains of C. dubliniensis and action of extracts and fractions on the same. With this, we observed a behavior between the yeast ATCC and clinical isolate. In addition, CE, fractions and subfractions of E. uniflora inhibit planktonic cells to preventing the growth of biofilm. The preliminary chemical characterization of the fractions obtained revealed the presence of polyphenols (especially flavonoids and tannins). Finally, the results suggests that among the plant species studied, E. uniflora showed a pattern very promising as regards the antifungal, requiring further study of purification and structural elucidation of compounds in order to verify that the antifungal effect found can be attributed to a specific compound or some mechanism depends on synergistic the mixture of polyphenols / O aumento na incid?ncia de infec??es por fungos, devido ? resist?ncia ?s drogas ou ao n?mero de pacientes com altera??es imunol?gicas, tais como SIDA, quimioterapia ou transplante de ?rg?os; tem feito a investiga??o de novas drogas antif?ngicas necess?ria. As esp?cies vegetais da regi?o Nordeste do Brasil podem se tornar uma importante fonte de mol?culas naturais inovadoras. Para avaliar a atividade antif?ngica de 10 plantas medicinais da regi?o Nordeste do Brasil, tradicionalmente usadas como antimicrobianas, 30 extratos brutos (EB) foram submetidos ? teste in vitro contra quatro cepas padr?o ATCC de Candida spp. Extratos das folhas de E. uniflora, cascas do caule de L. ferrea, e folhas de P. guajava mostraram atividade significativa contra as leveduras avaliadas, com valores MIC entre 15,62 e 62,5 μg/mL. E. uniflora tamb?m mostrou propriedade fungicida contra todas as leveduras, principalmente contra C. dubliniensis. O EB de E. uniflora apresentou intervalo de valores CIM entre 1,95-1000 μg/mL, e menores valores de MIC50 e MIC90 foram observados contra C. n?o albicans. Devido ao melhor desempenho, o EB de E. uniflora foi eleito para realiza??o do fracionamento biomonitorado. Assim, foi poss?vel obter fra??es enriquecidas, as quais apresentaram boa capacidade inibit?ria, na faixa entre 0,48 a 500 μg/mL, frente ?s cepas ATCC de Candida spp. Tamb?m foi poss?vel realizar experimentos para verificar a produ??o de biofilme de duas cepas de C. dubliniensis e a??o dos extratos e fra??es sobre o mesmo. Com isso, observou-se um comportamento diferente entre a levedura ATCC e o isolado cl?nico. Al?m disso, extrato bruto, fra??es e subfra??es de E. uniflora inibiram as c?lulas planct?nicas impedindo de se agragarem ao biofilme. A caracteriza??o qu?mica preliminar das fra??es obtidas revelou a presen?a de polifen?is (principalmente, flavon?ides e taninos). Por fim, os resultados permitiram afirmar que entre as esp?cies vegetais estudadas, E. uniflora apresentou comportamento bastante promissor no que diz respeito a a??o antif?ngica, sendo necess?rio a continua??o do estudo de purifica??o e elucida??o estrutural dos compostos presentes, a fim de verificar se a a??o antif?ngica encontrada poder? ser atribu?da a um composto espec?fico ou depende de algum mecanismo sin?rgico da mistura de polifen?is

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:31:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BrunaRafaelaMS.pdf: 1773532 bytes, checksum: 553ecb49ceff7440e7c16d387e2a1ca2 (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The aim of this study was determine the prevalence and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp. from patients with periodontal disease and periodontally healthy, correlate them with factors to host, local environment and traits of the diseases. To this, thirty adults from 19 to 55 years old were selected. They had not periodontal treatment and no antibiotic or antimicrobial was administered during three previous months. From these individuals, sites periodontally healthy, with chronic gingivitis and/or periodontitis were analyzed. Eighteen subgingival dental biofilm samples were collected through sterile paper points being six from each tooth randomly selected, representing conditions mentioned. They were transported to Oral Microbiology laboratory, plated onto Mannitol Salt Agar (MSA) and incubated at 370C in air for 48 h. Staphylococcus spp. were identified by colonial morphology, Gram stain, catalase reaction, susceptibility to bacitracin and coagulase activity. After identification, strains were submitted to the antibiotic susceptibility test with 12 antimicrobials, based on Kirby-Bauer technique. To establish the relation between coagulase-negative Staphylococcus (CSN) presence and their infection levels and host factors, local environment and traits of diseases were used Chi-square, Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests to a confidence level of 95%. 86,7% subjects harbored CSN in 11,7% periodontal sites. These prevalence were 12,1% in healthy sites, 11,7% in chronic gingivitis, 13,5% in slight chronic periodontitis, 6,75% in moderate chronic periodontitis and in sites with advance chronic periodontitis was not isolated CSN, without difference among them (p = 0,672). There was no significant difference to presence and infection levels of CSN as related to host factors, local environm ent and traits of the diseases. Amongst the 74 samples of CSN isolated, the biggest resistance was observed to penicillin (55,4%), erythromycin (32,4%), tetracycline (12,16%) and clindamycin (9,4%). 5,3% of the isolates were resistant to oxacilin and methicillin. No resistance was observed to ciprofloxacin, rifampicin and vancomycin. It was concluded that staphylococci are found in low numbers in healthy or sick periodontal sites in a similar ratio. However, a trend was observed to a reduction in staphylococci occurrence toward more advanced stages of the disease. This low prevalence was not related to any variables analyzed. Susceptibility profile to antibiotics demonstrates a raised resistance to penicillin and a low one to methicillin. To erythromycin, tetracycline and clindamycin was observed a significant resistance / O objetivo deste estudo foi determinar a preval?ncia e a susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. em quadros de sa?de e doen?a periodontal, relacionando-as com fatores do hospedeiro, do meio ambiente local e pr?prios das doen?as. Para tanto, foram selecionados 30 indiv?duos adultos, entre 19 e 55 anos, que apresentassem s?tios periodontais saud?veis, com gengivite cr?nica e/ou periodontite cr?nica, sem tratamento periodontal, e que n?o tivessem usado antibi?tico ou antimicrobiano nos ?ltimos tr?s meses. De cada paciente foram coletadas 18 amostras de biofilme subgengival, sendo 6 por elemento dent?rio sorteado com as condi??es supracitadas. Com o aux?lio de pontas de papel absorventes est?reis, tais amostras foram coletadas do sulco gengival ou bolsa periodontal, semeadas em Agar Manitol Salgado e incubadas a 370C por 48 horas. A identifica??o de Staphylococcus spp. se deu atrav?s da colora??o de Gram, prova da catalase, susceptibilidade ? bacitracina e prova da coagulase livre Ap?s a identifica??o, as amostras foram submetidas ao teste de susceptibilidade a doze antimicrobianos, atrav?s da t?cnica de Kirby-Bauer. Para o estabelecimento da rela??o entre a presen?a de estafilococos coagulase-negativos, os n?veis de infec??o dos mesmos e os fatores do hospedeiro, do meio ambiente local e pr?prios das doen?as, foram usados os testes do Quiquadrado, Mann-Whitney e Kruskal-Wallis para um n?vel de confian?a de 95%. Quanto ? preval?ncia de estafilococos coagulase-negativos, 86,7% dos indiv?duos albergavam este microrganismo em 11,7% dos s?tios periodontais, sendo distribu?dos em 12,1% entre os saud?veis, 11,7% com gengivite cr?nica, 13,5% com periodontite cr?nica leve, 6,75% com periodontite cr?nica moderada e nenhum s?tio com periodontite cr?nica severa (p=0,672). N?o houve associa??o significativa na freq??ncia de isolamento ou nos n?veis de infec??o de ECN com fatores do hospedeiro, do meio ambiente local e pr?prios das doen?as. Dentre as 74 cepas isoladas de ECN, a maior resist?ncia observada neste estudo foi ? penicilina (55,4%), eritromicina (32,4%), tetraciclina (12,16%) e clindamicina (9,4%). Cinco v?rgula tr?s por cento das cepas foram resistentes ? oxacilina e ? meticilina. Nenhuma cepa apresentou resist?ncia aos antibi?ticos ciprofloxacina, rifampicina e vancomicina. Conclui-se, portanto, que os estafilococos est?o presentes em baixos n?meros em s?tios periodontais saud?veis e doentes numa propor??o equivalente. Por?m, uma tend?ncia foi observada em rela??o ao decr?scimo de sua ocorr?ncia em quadros mais avan?ados da doen?a periodontal. Essa baixa preval?ncia de SCN n?o esteve associada a nenhum a das vari?veis testadas nesse estudo. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos demonstrou um a elevada resist?ncia ? penicilina, por?m uma baixa resist?ncia ? meticilina. Para a eritromicina, tetraciclina e clindamicina foi encontrada uma resist?ncia significativa

A difteria é uma doença imunoprevinível que permanece endêmica em diversas regiões do mundo. Além dos casos de difteria clássica, doenças invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infecções relacionadas à cateter, tem acometido indivíduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formação de biofilme e sobrevivência em macrófagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos são os trabalhos que investigaram a influência de condições ambientais na virulência do patógeno. Uma vez que agentes oxidantes são capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formação do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do peróxido de hidrogênio (H2O2), paraquate e telurito de potássio (K2TeO3) em propriedades biológicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram níveis de resistência ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porém em intensidades variadas e independentes da capacidade de produção da toxina diftérica. Algumas amostras, toxinogênicas ou não, isoladas do trato respiratório superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistência aumentada após uma prévia exposição ao referido agente oxidante. C. diphtheriae não exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfície de substratos abióticos de natureza hidrofílica (vidro) e hidrofóbica (poliestireno) na presença de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presença dos agentes oxidantes influenciou na formação de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produção de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produçao de biofilme inibida na presença dos três agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presença de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produção de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produção de toxina diftérica, os ensaios moleculares indicaram a presença de sequências gênicas cromossômicas homólogas, codificadores da proteína DIP 0906 (TeR) e da proteína DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistência ao telurito e na proteção contra o estresse oxidativo, respectivamente. Não foi observada correlação da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes características bacterianas: origem, sítio de isolamento, produção de toxina diftérica, metabolização de sacarose e produção de biofilme. Em conclusão, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produçao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clássica assim como de doenças invasivas causadas por cepas atoxinogênicas. / Diphtheria is a disease it could be preventable by immunization although remains endemic in many regions of the world. Besides the classical cases of diphtheria, invasive diseases such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia and catheter-related infections, has affected adults partially immunized. The multifactorial nature of virulence factors that promote biofilm formation and survival in macrophages have been shown to Corynebacterium diphtheriae. However, few are the studies that investigated the influence of environmental conditions on the virulence of the pathogen. Since oxidants are capable of generating free radicals lead to oxidative stress and, consequently, may result in adaptive response and influence in biofilm formation and bacterial virulence, this study aimed to evaluate the effects of hydrogen peroxide (H2O2), paraquat and potassium tellurite (K2TeO3) in biological properties of strains of C. diphtheriae of different origins. The results show that the strains of C. diphtheriae showed levels of resistance K2TeO3, H2O2 and paraquat, but in varying intensities and independent production capacity of diphtheria toxin. Some samples, toxigenic or non-toxigenic, isolated respiratory tract demonstrated adaptive response to H2O2 passing thus expressing increased resistance after exposure prior to said oxidizing agent. C. diphtheriae seemed not display adaptive responses to K2TeO3 and paraquat. C. diphtheriae was able to produce biofilm on the surface of substrates abiotic hydrophilic in nature (glass) and hydrophobic (polystyrene) in the presence of oxidizing agents - K2TeO3, H2O2 and paraquat. The presence of oxidizing agents influence the biofilm formation of some samples.The paraquat inhibited the production of biofilm from all samples. The sample TR241 had inhibited the production of biofilm in the presence of oxidizing agents three analyzed. Moreover, the presence of H2O2 and K2TeO3 stimulated biofilm production of some samples. For all samples C. diphtheriae tested, independent of the origins and biotypes production capacity of diphtheria toxin, molecular assays indicated the presence of chromosomal gene sequences homologous to genes involved in tellurite resistance and protection against oxidative stress present in other bacterial species, genes encoding protein DIP 0906 (Ter) and protein DIP 1421 (oxyR). No correlation was observed susceptibility and adaptive response to oxidants with different biological activities bacterial: origin, isolation site, production of diphtheria toxin, sucrose metabolism and biofilm production. In conclusion, oxidative stress was able to influence virulence factors of C. diphtheriae, as the capacity of production of biofilm, which may be contributing to the pathogenesis of diphtheria classical as well as invasive disease caused by strains non-toxigenic.

Staphylococcus coagulase-negativo (SCN) estão frequentemente envolvidos em infecções nosocomiais associadas com o uso de cateteres e outros procedimentos médicos invasivos. A habilidade de aderir às superfícies abióticas e de produzir biofilme tem sido reconhecida entre os principais fatores de virulência dos SCN, especialmente de S. epidermidis, a principal espécie responsável por infecções relacionadas à assistência a saúde - IRASs. Dentre as demais espécies de SCN capazes de produzir biofilme, S. haemolyticus tem sido relacionado com quadros de infecções em recém-nascidos (RNs). O presente estudo teve como objetivo principal investigar aspectos microbiológicos e epidemiológicos dos processos infecciosos invasivos relacionados com SCN em neonatos internados em unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN) de um hospital universitário do município do Rio de Janeiro (2008-2010). A técnica de PCR multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies de 40 amostras de SCN isoladas de hemoculturas de RNs fazendo uso de cateteres intravenosos e submetidos à terapia antimicrobiana empírica com vancomicina e/ou gentamicina. A fenotipagem foi realizada por três métodos distintos: Simplificado em microplaca, Vitek 2 e API-Staph. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação de CIM (Oxacilina) e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) além da PCR para os genes icaAB, atlE e aap. O perfil genômico dos micro-organismos foi determinado pela técnica de PFGE. Os resultados demonstraram o isolamento de S. haemolyticus (77%), S. epidermidis (15%), S. captis (5%) e S. warneri (3%). A análise comparativa dos resultados obtidos pelo m-PCR com métodos fenotípicos demonstrou uma concordância de 97,5% com o esquema simplificado e de ~40% Vitek 2 e o API Staph. A maioria (82,5%) das amostras apresentou perfis variados de multiresistência aos 16 antimicrobianos testados e resistência a oxacilina, apesar de 25% destas não apresentarem o gene mecA. Apesar da maioria das amostras de SCN ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença dos genes mecA, icaAB, aap, atlE, enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme de SCN. Diferente do observado para as demais espécies, algumas amostras de S. haemolyticus foram incapazes de aderir ao vidro e ao poliestireno e/ou apresentaram os genes aap (38,7%), atlE (42%) além de icaAB (71%). Na UTIN foi detectada a presença de seis diferentes tipos clonais da espécie prevalente, indicando a disseminação de S. haemolyticusnesta unidade hospitalar e a endemicidade em nossa comunidade. / Coagulase-negative staphylococci (CNS) are often involved in nosocomial infections associated with catheters and other invasive medical procedures. The ability to adhere to abiotic surfaces and produce biofilms has been recognized among the major virulence factors of the SCN, especially Staphylococcus epidermidis, the main species responsible for infections related to health care - IRASs.Among the other species capable of producing biofilm, Staphylococcus haemolyticus has been associated with cases of infections in neonates.Here in, we investigated the microbiological and epidemiological aspects of invasive infections related to CNS in the neonatal intensive care unit (NICU) of a university hospital located at Rio de Janeiro metropolitan area (2008-2010).PCR multiplex-mPCR was used in the determination of the species of 40 CNS strains isolated from blood cultures of neonates making use of intravenous catheters and subjected to empirical antimicrobial therapy with vancomycin and / or gentamicin.Phenotyping was performed by three different methods: Simplified scheme in microplates, Vitek 2 and API-Staph. Antimicrobial resistance profiles were verified by the disk diffusion test, oxacillin MIC determinationand PCR for mecA gene. Evaluation of biofilm production was performed by PCR for genes icaAB, atlE and aap and the tests on Congo Red Agar plates and abiotic surfaces (polystyrene and glass).Clonality was determined by PFGE technique. Data revealed the isolation of S. haemolyticus (77%), S. epidermidis (15%), S. captis (5%) and S. warneri (3%).The comparative analysis of the results obtained by mPCR and phenotypic methods showed 97.5% concordance with the simplified scheme and ~40% with the Vitek 2 and API Staph systems. Different multidrug resistance profiles to 16 antimicrobials, including resistance to oxacillin was observed for 82.5% of the CNS isolates, although the mecA gene was not detected in 25% of these strains.Although most of the CNS isolates showed the ability to produce slime and/or biofilm, a complete correlation with the presence of mecA, icaAB, aap, atlE genes was not observed, emphasizing the multifactorial nature of biofilm production of SCN.Different from other CNS species, some strains of S. haemolyticus were unable to adhere to glass and polystyrene surfaces and/or to exhibit aap (38.7%), atlE (42%), icaAB (71%) genes. PFGE analysis revealed the presence of six different clonal types of the prevalent species, indicating the dissemination in this hospital and endemicity in our community of S. haemolyticus.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae. / Plasmids are extrachromosomal DNA that have the ability to duplicate independently of the host cells. Plasmids are responsible for the expression of a variety of characteristics of the cells, such as virulence factors. The present study utilized a receptor strain of E. Coli K12-R23 and strains of Klebsiella pneumoniae and E. coli which were R plasmids donor strains and transconjugant ones. The objective of this study was to analyze the attributed phenotypes of transconjugant strains in both bacteria caused by transference of R plasmids from the donor strains to the receptor ones. In order to analyze these phenotypes, the following variables were selected: sensitivity to antimicrobials and ROS, adherence to HEp-2 cells, and slime and biofilm structures. The marker of the presence of plasmids was gentamycin resistance in the donor strains. The observed results indicated that there was plasmid transfer; given that Klebsiella pneumoniae and E. coli strains presented the marker (e.g. they became resistant to gentamycin). Moreover, transconjugant strains have showed distinct profiles from the receptor strain concerning sensitivity to antimicrobials, ROS, adherence patterns to HEp-2 cells and slime structure. On the other hand, the biofilm structure of these strains did not present modifications. Yet, it was observed that several characteristics of the donor strains were not found in the transconjugant strains of E. coli and K. pneumoniae.

Os resultados permitiram a redação de quatro artigos. Aspectos microbiológicos e clínicos de corinebacterioses em pacientes com câncer observados durante cinco anos foram descritos no Artigo 1. No Artigo 2 foram apresentados casos de bacteremia causados por corinebactérias invasivas não toxigênicas em dois períodos com intervalo de sete anos. As infecções em pacientes com câncer por C. diphtheriae, causando casos clínicos atípicos foram descritas no Artigo 3, além do estudo dos principais fatores de virulência de uma cepa de C. diphtheriae isolada de infecção associada ao cateter de nefrostomia foi descrita no Artigo 4. Resumidamente no Artigo 1, além dos aspectos clínico-epidemiológicos foram avaliados os perfis de resistência aos antimicrobianos e o potencial de virulência dos micro-organismos. Em cinco anos, 932 amostras de corinebactérias, com perfis de resistência aos antimicrobianos testados, foram isoladas de pacientes com câncer. As espécies predominantes foram Corynebacterium amycolatum (44,7%), Corynebacterium minutissimum (18,3%) e Corynebacterium pseudodiphtheriticum (8,5%). O uso de catéteres de longa permanência e a neutropenia, foram às condições importantes para infecção por corinebactérias. As doenças de base mais comuns foram os tumores sólidos. Pacientes hospitalizados apresentaram risco seis vezes maior de morrer, quando relacionadas às taxas de mortalidade com 30 dias (RC= 5,5; IC 95%= 1,15-26,30; p= 0,033). As bacteremias (Artigo 2) causadas por corinebactérias foram observadas em dois períodos: 2003-2004 (n=38) e de 2012-2013 (n=24). As espécies multirresistentes C. amycolatum e Corynebacterium jeikeium foram os principais responsáveis pelos quadros de bacteremia. Havia 34 pacientes com tumores sólidos e 28 pacientes com doenças linfoproliferativas, sendo que 21 deles apresentavam neutropenia e 54 utilizavam cateter venoso central. Em 41 pacientes havia infecção relacionada ou associada aos dispositivos intravasculares. Os pacientes com bacteremia responderam ao tratamento com vancomicina após a remoção do cateter. O comportamento agressivo da neoplasia, o tempo de internação hospitalar e o uso de CVC aumentaram o risco de bacteremias por Corynebacterium spp. No Artigo 3, 17 casos de infecções atípicas causadas por Corynebacterium diphtheriae foram diagnosticadas de 1996 a 2013. A incidência de C. diphtheriae correspondeu a 15,8 casos/100.000 admissões, 465 vezes maior que a incidência de difteria na população brasileira. Sintomas toxêmicos foram observados em nove pacientes, embora quadros de difteria clássica e endocardite não fossem observados. O perfil eletroforético em campo pulsado (PFGE) demonstrou um perfil de distribuição endêmica, apesar de haver dois casos de pacientes com o mesmo perfil eletroforético sugerindo transmissão relacionada aos cuidados à saúde. A adesão em superfícies bióticas e abióticas e produção de biofilme em cateter de poliuretano (Artigo 4) foi demonstrada em C. diphtheriae não toxigênico no sítio de inserção do cateter de nefrostomia. Os dados desses artigos permitiram concluir que (i) diferentes espécies de corinebactérias multirresistentes foram capazes de causar infecções em pacientes com câncer, incluindo bacteremias; (ii) C. diphtheriae foi capaz de causar infecções graves em indivíduos imunocomprometidos, incluindo infecções relacionadas ao uso de dispositivos invasivos em populações de risco, tais como pacientes com câncer. / A retrospective study at the InstitutoNacional doCâncer-INCA (National Cancer Institute) in Rio de Janeiro, Brazil examined infections of Corynebacterium sp. in cancer patients. The results were presented in four papers. Article 1 describes microbiological and clinical aspects of corynebacteriosis in cancer patients observed over five years. Article 2 presents cases of bacteremia caused by invasive non-toxigenic corynebacteria observed in 2003-2004 and seven years later in 2012-2013. Article 3 presents atypical clinical cases of cancer patients infected by Corynebacterium diphtheriae, while Article 4 is a study of the major bacterial virulence factors of an isolated strain of C. diphtheriae in infections associated with nephrostomy catheters.In addition to clinical and epidemiological aspects, Article 1 evaluates the antimicrobial resistance profiles and potential virulence factor of microorganisms. Over a period of five years, 932 samples of corynebacteria with antimicrobial resistance profiles were isolated from patients with cancer. The predominant species were Corynebacterium amycolatum (44.7%), Corynebacterium minutissimum (18.3%) and Corynebacterium pseudodiphtheriticum (8.5%).Long-term catheter use and neutropenia were the major conditions for infection by corynebacteria. Solid tumors were the most common underlying illness. The 30-day mortality rate for patients with corynebacteria infections was six times greater in hospitalized patients than for non-hospitalized patients (OR = 5.5, 95% CI = 1.15 to 26.30, p = 0.033).In Article 2, bacteremia caused by corynebacteria were observed in two time frames: 2003 to 2004 (n=38) and 2012 to 2103 (n=24). The multidrug-resistant species C. amycolatum and Corynebacterium jeikeium were responsible for invasive diseases.There were 34 patients with solid tumors and 28 patients with lymphoproliferative diseases, of which 21 had neutropenia and 54 used central venous catheter. Forty-one patients experienced infection related to or associated with intravascular device. Patients with bacteremia responded to treatment with vancomycin after removal of the catheter. The aggressive behavior of the neoplasia, the hospital stay and the use of central venous catheter increased risk of bacteremias by Corynebacterium sp. In Article 3, 17 cases of atypical infections caused by Corynebacterium diphtheriae were diagnosed from 1996 to 2013. The incidence of C. diphtheriae corresponded to 15.8 cases per 100,000 admissions which is 465 times greater than the incidence of diphtheria in the Brazilian population. Toxemic symptoms were observed in nine patients, although clinical signs of classical diphtheria and endocarditis were not observed.The Pulsed-field gel electrophoretic (PFGE) demonstrated a profile of endemic distribution, although there were two cases with identical profiles suggesting health care-related infections.Article 4demonstrates that non-toxigenic C. diphtheriae attaches to biotic and abiotic surfaces with the production of biofilm in polyurethane catheters at the nephrostomy insertion site. The data presented in these papers permit a conclusion the (i) different species of multidrug-resistant corynebacteria are capable of causing infections in cancer patients, including bacteremias; (ii) C. diphtheriae is capable of causing serious infections in immunocompromised individuals, including infections related to the use of disposable devices among at-risk populations such as those with cancer.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito. / Coagulase-negative staphylococci ( SCN ) are found in the skin and mucous membranes of humans and other animals , since some species are a constituent part of the normal flora of these same sites, which may constitute a reservoir for SCN. Staphylococcus epidermidis species, is recognized as a major opportunistic infections and serious nosocomial and community staff, as well as associated with infections in patients undergoing implants with medical devices, and Staphylooccus haemolyticus is the second species most frequent species of human blood cultures, one of species that has a high antimicrobial resistance. The present study aimed to investigate the presence of SCN on fomites (stethoscopes, thermometers and sphygmomanometers) in the hospital environment, identify the species S. haemolyticus and S. epidermidis and correlate their antimicrobial resistance profiles with the ability to produce biofilm. The technique of multiplex mPCR was used in the determination of the species and phenotyping was performed by conventional phenotypic tests. The antimicrobial resistance profiles were checked by the disk diffusion test, MIC determination (oxacillin and vancomycin), determination of MBC and the presence of the mecA gene. The capacity of the biofilm was investigated by testing the Congo Red agar and adhesion assays abiotic surfaces (glass and polystyrene) in the presence and absence of oxacillin and vancomycin in addition to the PCR icaAD gene. The results demonstrated that the conventional biochemical tests, it was found more species S. epidermidis (43,5%). After confirmation by PCR , 29 samples (82%) were identified as S. epidermidis, and 6 samples (18%) were identified as S. haemolyticus. All samples were multiresistant, oxacillin-resistant and vancomycin-sensitive, and only 5 samples S. epidermidis (17,2%) were tolerant to oxacillin. The presence of the mecA gene was detected in 71,4% of samples. Although most of the samples have shown the ability to produce slime and/or biofilm not fully correlate with the presence of the gene was observed icaAD emphasizing the multifactorial nature of biofilm production. Samples adhered better to the sphygmomanometer, and that too, in this fomites, found the highest percentage of samples positive for slime production. For adhesion to glass and adherence to polystyrene was found no correlation with fomites. S. epidermidis samples of all hospital sites studied, and S. haemolyticus were isolated not only found in Infirmary Medical Clinic. Regarding fomites, S. epidermidis was found in all studied fomites, and S. haemolyticus, have been found only on sphygmomanometer and other fomites. The fomites are serving as sources of transmission and spread of microorganisms, and further study concerning necessary.

Em contraste com a vasta descrição na literatura científica dos biofilmes bacterianos, poucos trabalhos focam o estudo da formação e as estratégias de inibição da constituição do biofilme fúngico. Este trabalho objetiva a caracterização do potencial antifúngico e antibiofilme do sal imidazólico 1-metil-3-octilimidazol cloreto (C16MImCl), e das frações (F70 e F90) purificadas de saponinas mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), frente a células de biofilme de seis isolados clínicos de Candida tropicalis. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do C16MImCl foi de 0,014μg/mL frente às células planctônicas, ao passo que as Frações de Saponinas da Erva Mate (FSEM) não apresentaram atividade antifúngica. Utilizando o cateter traqueal (CT) como corpo de prova, foi utilizado para avaliar a capacidade de inibição e remoção do biofilme. Avaliou-se também a Concentração Mínima de Erradicação do Biofilme (CMEB) para remoção do biofilme pré-formado pelo método da microplaca. Para a atividade antibiofilme foi observado que o C16MImCl, apresentou melhor resultado quando comparado ao fluconazol. As FSEM também apresentaram atividade antibiofilme quando comparados ao fluconazol, entretanto menores do que o tensoativo sintético Pela análise dos resultados de CMEB, o C16MImCl foi o composto com maior capacidade de erradicar o biofilme pré-formado, na concentração de 0,9 μg/mL (92% a 100% de remoção do biofilme). Os demais compostos testados (fluconazol, FEM e a água) não apresentaram atividade removedora, observando-se valores menores que 80% de remoção. Tanto as concentrações nas quais C16MImCl inibiu as células planctônicas (0,014 μg/mL) como as de biofilme (0,028 -0,225 μg/mL) foram mais baixas que as obtidas pelo fluconazol. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destes tensoativos, principalmente o C16MImCl, que demonstrou baixa toxicidade e provável mecanismo de ação sobre a síntese do ergosterol. Assim, é possível afirmarmos que estes tensoativos representam uma potencial alternativa para o controle químico de fungos leveduriformes, especialmente as ocasionadas por células de biofilme por C. tropicalis. / In contrast to the extensive description in the literature of bacterial biofilms, few works focus on the study of the formation and strategies for inhibiting the formation of fungal biofilms. This work aims to characterize the antifungal potential and antibiofilm the imidazole salt 1 - methyl - 3 - octilimidazol chloride (C16MImCl), and fractions (F70 and F90) purified saponins mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), against to biofilm cells of six clinical isolates of Candida tropicalis. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C16MImCl was 0.014 mg / mL to planktonic cells, whereas the Saponin Fractions of Yerba Mate (SFYM) showed no antifungal activity. Using the tracheal catheter (CT) as a specimen was used to evaluate the ability of the biofilm inhibition and removal. We also assessed the Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) to remove the preformed biofilms by the microplate method. For antibiofilm activity was observed that C16MImCl, showed better results when compared to fluconazole. The SFYM also had antibiofilm activity when compared to fluconazole, however smaller than the synthetic surfactant. By analyzing the results MBEC, the compound C16MImCl was capacity to eradicate pre- formed biofilm in a concentration of 0.9 mg / mL (92% to 100% biofilm removal) The other tested compounds (fluconazole, SFYM and water) showed no activity remover, observing less than 80 % removal values. Both concentrations at which they inhibit planktonic cells C16MImCl (0.014 μg/mL) and the biofilm (0.028 -0.225 μg/ml) were lower than those obtained by fluconazole. The results obtained demonstrate the potential of these surfactants, especially C16MImCl, which demonstrated low toxicity and probable mechanism of action on the synthesis of ergosterol. Thus, it is possible to assert that these surfactants are a potential alternative to chemical control of yeasts, especially those caused by biofilm cells of C. tropicalis.