Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1604601 bytes, checksum: 38fc7a3e41183836ef961684bc79c882 (MD5) Previous issue date: 2011-06-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Escherichia coli is a microorganism of environmental origin highly adaptive and its ability to form biofilms under certain conditions may be critical for their resistance to antimicrobial treatments, which makes E. coli an important causative agent of mastitis. We studied 27 isolates of E. coli producing biofilms obtained from clinical mastitis belong to the collection of the Federal University of Viçosa. The isolates were tested for sensitivity to antibiotics used to treat mastitis, both for planktonic cells, by assessing the minimal inhibitory concentration - MIC as for the sessile, assessing the minimal biofilm eradication concentration - MBEC. In addition, all isolates were grown in minimal media containing different pH values and glucose concentrations and to assess the influence of these factors in producing biofilms. Similarly underwent the isolates at concentrations of antimicrobial sub-inhibitory to verify the possible induction of these doses on the formation of biofilms. Four isolates were chosen, large and weak biofilm producers, to be analyzed by scanning electron microscopy - SEM. The results revealed a high rate of sensitivity, confirmed by the evaluation of MIC, in which only four (14.8%) isolates had high MIC values ranging from 4 to 10 &#956;g / mL and were classified as resistant. However, for the remaining isolates (85.2%) were lower, ranging from 0.125 to 2 &#956;g/mL classified as sensitive. The evaluation of MBEC indicated that the concentration of antibiotic required to eliminate the sessile cells ranged from the 100 &#956;g/mL 500 &#956;g/mL. Gentamicin and enrofloxacin were possible inducers of biofilm formation, respectively, at 0.0312 and 0.0125 &#956;g / mL. MBEC values were significantly higher in isolated large and moderate-producing biofilms in relation to isolated weak biofilm producers (p < 0.001). There was no correlation between the values of MCEC and MIC (p > 0.05). The biofilm production was higher (p < 0.001) in minimal media with limited glucose (0.5%) and pH values further away from neutrality (pH 5.5 and pH 8, 5) in relation to the minimum means-rich glucose (2,5% and 3.5%) and pH close to neutrality (pH 6.5 and 7,5). The presence of biofilms was confirmed in isolates submitted to the SEM, through visualization of adhered cells and the presence of exopolysaccharides, characterizing the typical architecture of biofilms. The knowledge of the characteristics of biofilm production in isolates of E. coli causing mastitis is an important tool for establishing more efficient treatment strategies. / Escherichia coli é um micro-organismo de origem ambiental altamente adaptativo e sua habilidade em formar biofilmes em determinadas condições pode ser fundamental para sua resistência a tratamentos da mastite com antimicrobianos. Estudou-se 27 isolados de E. coli produtores de biofilmes obtidos de leite mastítico. Os isolados foram submetidos a testes de sensibilidade a antimicrobianos usados no tratamento da mastite, tanto para as células planctônicas, por meio da avaliação da concentração mínima inibitória CMI quanto para as sésseis, pela avaliação da concentração mínima de erradicação de biofilmes - CMEB. Todos os isolados foram cultivados em meios mínimos contendo diferentes valores de pH e concentrações de glicose visando investigar a influência desses fatores na produção de biofilmes. De mesmo modo submeteu-se os isolados às CMI para verificar a possível indução dessas concentrações na produção dos biofilmes. Foram escolhidos quatro isolados, grandes e fracos produtores de biofilmes, para serem analisados por microscopia eletrônica de varredura MEV. Os resultados obtidos revelaram uma alta taxa de sensibilidade, confirmada pela avaliação da CMI, na qual apenas quatro (14,8%) isolados obtiveram valores da CMI elevados, variando de 4 a 10 &#956;g/mL, sendo classificados como resistentes. Entretanto, para os demais isolados (85,2%) os valores foram menores, variando de 0,125 a 2 &#956;g/mL, classificados como sensíveis. A avaliação de CMEB indicou que a concentração dos antimicrobianos necessária para eliminar as células sésseis variou de 100 &#956;g/mL a 500 &#956;g/mL. Gentamicina e enrofloxacina foram indutores da produção de biofilmes, respectivamente nas concentrações de 0,0312 e 0,0125 &#956;g/mL. Os valores de CMEB foram significativamente maiores nos isolados grandes e moderados produtores de biofilmes em relação aos isolados fraco produtores biofilmes (p < 0,001). Não houve correlação entre os valores de CMEB e CMI (p > 0,05). A produção de biofilmes foi maior (p < 0,001) nos meios mínimos com pouca disponibilidade de glicose (0,5%) e valores de pH mais distantes da neutralidade (pH 5,5 e 8,5) em relação aos meios mínimos ricos em glicose (2,5% e 3,5%) e com valores de pH próximos da neutralidade (pH 6,5 e 7,5). A presença dos biofilmes foi confirmada nos isolados submetidos à MEV por meio da visualização de células aderidas e da presença de matriz extracelular, caracterizando a arquitetura dos biofilmes. O conhecimento das condições da produção de biofilmes em isolados de E. coli causadores de mastite é uma importante ferramenta para se estabelecer estratégias de controle e tratamentos mais eficientes.

Submitted by Renan Aparecido Fernandes null (renanfernandes_91@hotmail.com) on 2017-10-23T13:00:35Z No. of bitstreams: 1 Tese Doutorado.pdf: 2041233 bytes, checksum: c669ff654e2b5421422fc61488fe79eb (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-26T16:05:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandes_ra_dr_araca.pdf: 2041233 bytes, checksum: c669ff654e2b5421422fc61488fe79eb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-26T16:05:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandes_ra_dr_araca.pdf: 2041233 bytes, checksum: c669ff654e2b5421422fc61488fe79eb (MD5) Previous issue date: 2017-10-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de produção de nanopartículas de prata através do extrato da casca de romã, e produzir formulações contendo estas nanopartículas para uso em feridas. Elas foram testadas quanto à ação antimicrobiana, citotóxica e potencial cicatrizante. Para a produção das nanopartículas de prata propôs-se uma síntese utilizando-se como base duas metodologias já estabelecidas na literatura, utilizando-se para reação carboximetilcelulose, propilenoglicol, nitrato de prata, água e extrato da casca de romã como agente redutor. O extrato da casca de romã foi caracterizado em parâmetros como pH, massa seca e quantidade de taninos bioativos (ácido elágico e totais fenólicos expressos em ácido gálico). Os totais fenólicos do extrato foram também dosados após seu aquecimento nas diferentes condições de tempo e temperatura propostos para as sínteses das nanopartículas de prata (12 minutos, 1 hora e 2 horas, à 50ºC e 100ºC). As nanopartículas de prata produzidas foram, então, adicionadas a uma solução contendo compostos para produção de formulações para serem utilizadas no tratamento de feridas. Elas foram caracterizadas através de espectroscopia UV-Visível, microscopia eletrônica de varredura (MEV), potencial zeta e dosagem de íons remanescentes após as reações. A atividade antimicrobiana tanto das nanopartículas como de suas formulações contra Candida albicans SC 5314 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 foi avaliada por meio do método da microdiluição. Na avaliação dos extratos, apesar de ocorrer um aumento na concentração de totais fenólicos com o aumento da temperatura, a concentração inibitória mínima (CIM) manteve-se estável com valores de 391 µg/ml e 781 µg/ml para S. aureus e C. albicans. A formação das nanopartículas de prata foi confirmada com a formação de picos característicos na espectroscopia UV-Visível e pelas imagens de MEV, onde verificou-se que a síntese com tempo de reação de 12 minutos e aquecimento a 50ºC gerou nanopartículas mais uniformes e melhor distribuídas na formulação. As sínteses propostas promoveram a redução iônica da prata de aproximadamente 100%, independente do tempo temperatura utilizados na reação. Valores de CIM para as nanopartículas de prata foram de 67,50 µg/ml e 68,75 µg/ml respectivamente para S. aureus e C. albicans independente das variações das condições de síntese. Após a seleção da síntese das nanopartículas de prata por 12 min à 50ºC, estas partículas foram também caracterizadas por difração de raios-X e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), e as respectivas formulações por meio de espalhamento de luz dinâmica, dosagem de íons livres, potencial zeta, MEV e TEM. Para essas formulações foi também realizado um teste de estabilidade variando-se umidade e temperatura. Além da atividade antimicrobiana contra Candida albicans SC 5314 e Staphylococcus aureus ATCC 25923, a citotoxicidade em fibroblastos (L929) das nanopartículas de prata e das formulações destas partículas e do extrato da casca de romã foram também avaliadas. Para os extratos foram observados valores de 3,13, 86,39±0,96% m/m, 3,64±0,03 mg/g, 392,0±9 mg/g respectivamente para pH, massa seca, ácido elágico e totais fenólicos. Como controle, foram produzidas nanopartículas de prata sintetizadas convencionalmente (AgNP química), e observou-se potencial redutor de 99,89% e 99,51% para as sínteses utilizando-se extrato de romã (AgNP green) e um agente redutor químico convencional (AgNP química). Verificou-se a formação de partículas com tamanhos médios de 89 e 19 nm para nanopartículas green e química. A formulação contendo as nanopartículas de prata apresentaram um potencial antimicrobiano expressivamente maior do que o princípio ativo isolado, sendo 255 e 4 vezes mais efetiva contra S. aureus e C. albicans, respectivamente. Os valores de citotoxicidade foram consideravelmente menores para as nanopartículas de prata sintetizadas pelo extrato de romã quando comparadas as produzidas convencionalmente. De acordo com os valores de CIM e da citotoxicidade, a concentração das formulações foi ajustada, gerando assim três formulações: i) AgNP green, ii) AgNP química e iii) extrato de romã, nas concentrações de 337,5 µg/ml, 5,55 µg/ml e 94 µg/ml respectivamente. Para o estudo in vivo, utilizou-se como controle um medicamento comercial contendo prata indicado para tratamento de feridas (Sulfadiazina de prata). Foram selecionados noventa ratos Wistar machos com peso médio de 180 gramas. Foi induzida diabetes nos ratos, e, em seguida, realizou-se duas incisões no dorso dos animais e as lesões foram imediatamente infectadas com S. aureus (ATCC 25923) e C. albicans (SC 5314). Após 24 h, os animais foram divididos em grupos de acordo com as formulações propostas em cada tratamento, seguindo-se um protocolo de duas vezes ao dia por 2, 7 e 14 dias. Após o período de tratamento os animais foram eutanasiados e verificado o potencial reparador através do índice de fechamento de ferida, avaliação do infiltrado inflamatório, angiogenese, mieloperoxidase e hidroxiprolina. Ainda foi verificado o potencial antimicrobiano das formulações através da contagem de células viáveis de cada microrganismo infectado nas feridas. De forma geral, as formulações contendo nanopartículas de prata mostraram os melhores resultados para o fechamento das feridas, apresentando ainda uma atividade anti-inflamatória maior que a do extrato de casca de romã, o qual apresentou atividade pró inflamatória. Todos os tratamentos não foram capazes de reduzir de forma significativa o número de células de C. albicans, enquanto para S. aureus todos os tratamentos apresentaram redução significativa após quatorze dias de tratamento. Independente das nanopartículas de prata serem produzidas quimicamente ou por meio do extrato da casca de romã, ambas apresentaram considerável potencial de reparo de feridas infectadas em modelos in vivo com ratos. Os achados das presentes pesquisas reforçam e estimulam o uso potencial das nanopartículas de prata no tratamento de feridas, com destaque para a síntese green por gerar menos danos ao meio ambiente e às pessoas envolvidas tanto em sua produção como aos pacientes, e por apresentar, ainda, custo inferior quando comparada às sínteses utilizando reagentes químicos e processos convencionais. / The aim of this study was to investigate the production of silver nanoparticles through peel extract of pomegranate, and produce formulations containing these particles to be used in wound healings. Its antimicrobial action, cytotoxicity and healing potential were tested. The synthesis of silver nanoparticles were based on two methods proposed in the literature with some modifications, which were used carboxymethylcellulose, propylene glycol, silver nitrate, water and peel extract of pomegranate as reducing agent. The peel extract was characterized by pH, dry mass and bioactive tannins (elagic acid and total phenols expressed as galic acid). The total phenols were also quantified after being heated at 50ºC and 100ºC for 12 minutes, 1 hour and 2 hours. Then, silver nanoparticles were added in a solution containing products to develop a formulation to be tested in wound healing. They were characterized by UV-Vis spectroscopy, scanning electron microscopy (SEM), zeta potential and the quantification of remaining silver ions after the synthesis reaction. The antimicrobial activity of the nanoparticles and formulations were tested against Candida albicans (SC 5314) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) by microdilution method. After submitting the peel extract to different conditions of temperature and times (50ºC and 100ºC for 12 minutes, 1 hour and 2 hours), it was noted that the values of the minimum inhibitory concentration was not affected and were 391 µg/ml and 781 µg/ml for S. aureus and C. albicans. The formation of silver nanoparticles was confirmed through the formation of characteristic peaks in the UV-Vis spectroscopy and SEM images, and it was observed that the reaction at 50ºC for 12 min produced silver nanoparticles with regular forms and better dispersed in the formulation. The synthesis proposed promoted the reduction of silver ions at about 100%, regardless of the time and temperature used in the reaction, which also did not interfere in antimicrobial activity against C. albicans (68,75 µg/ml) and S. aureus (67,50 µg/ml). After selecting the reaction at 50ºC for 12 min, the silver nanoparticles produced ere also characterized by X-ray diffraction and transmission electron microscopy (TEM), and the respective formulations through dynamic light scattering, free ion dosage, zeta potential, SEM and TEM. The stability test varying humidity and temperature was also performed for those formulations. Besides antimicrobial assays, the cytotoxicity (L929 fibroblasts) of the silver nanoparticles and the formulations of these particles and of the pomegranate peel extract were evaluated. It was observed in the peel extract the values of 3,13, 86,39±0,96% m/m, 3,64±0,03 mg/g and 392,0±9 mg/g respectively for pH, dry mass, elagic acid and total phenols concentrations. Silver nanoparticles produced by conventional chemical method was prepared and used as controls, and it was noted the reduction potential of 99,89% and 99,51% for the synthesis using pomegranate peel extract (AgNP green) and chemical reducing agent (AgNP chemical). The averages sizes of green and chemical AgNP were 89 and 19 nm. The formulation containing silver nanoparticles presented an antimicrobial potential expressively higher than the active input, being 254 and 5-fold more effective against S. aureus and C. albicans. Also, the cytotoxicity was notable reduced when silver nanoparticles were produced using pomegranate peel extract. Based on the MIC values and the cytotoxicity findings, the concentration of the formulations were determined: i) AgNP green at 337.5 µg/ml, ii) AgNP chemical at 5.55 µg/ml, and iii) pomegranate peel extract at 94 µg/ml. In the in vivo study, a commercial form of silver (Sulfadizsine) to the wound healing was used as control. Ninety Wistar male rats were selected, and, after inducing diabetes, two incisions on the dorsum of the animals were made and followed infected with S. aureus (ATCC 25923) and C. albicans (SC 5314). After the infection, the animals were treated with the formulations twice a day for 2, 7 and 14 days. Then, the animals were euthanized and the repair potential was verified through wound closure index, inflammatory infiltrate evaluation, angiogenesis, myeloperoxidase and hydroxyproline. It was also determined the antimicrobial potential by counting the viable cells of each microorganism used to infect the wounds. In general, the formulations containing silver nanoparticles promoted a better closure of the wounds, and a higher anti-inflamatory activity than the peel extract formulation which otherwise presented a pro-inflamatory effect. All formulations could not significantly reduce the viable cells of C. albicans, while for S. aureus they reduced significantly the cells after 14 days of treatment. Silver nanoparticles produced by both green and conventional chemical process present notable potential in repairing infected wounds in in vivo rat model. The findings of the present research strengthen and stimulate the potential application of silver nanoparticles in wound healings, highlighting the green production of these particles which apart from being lower costly, it is ecofriendly and less detrimental to people involved in its production and use. / FAPESP: 2016/04230-9

Made available in DSpace on 2015-09-30T02:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475295-Texto+Parcial-0.pdf: 563 bytes, checksum: 4a169fcc2d293d6f288381480124104f (MD5) Previous issue date: 2015 / The species of the “C. parapsilosis complex” are common etiological agents of nosocomial candidemia, and C. parapsilosis sensu stricto is one of non-albicans Candida species with the highest incidences in clinical infections, primarily related to implanted medical devices. In this study, we identified 29 isolates comprising the “C. parapsilosis complex” to species level, all previously obtained from the hospital environment and medical tools. The isolates were also characterized for in vitro activity of aspartyl proteinase and phospholipase, as well as for their ability to form biofilms. The isolates identified as C. parapsilosis sensu stricto were also evaluated for their capability to interact with Staphylococcus aureus and Acinetobacter sp. in two-species polymicrobial biofilms. These biofilms were then analyzed for their tolerance to treatments with increasing concentrations of antimicrobials drugs and sanitizers. The results indicated that 75. 9% of the isolates were identified as C. parapsilosis sensu stricto, 24. 1% as Candida metapsilosis and none as Candida orthopsilosis. Regarding C. parapsilosis sensu stricto, all isolates were very strong producers of aspartyl proteinase, and 13. 6% of phospholipase. Regarding C. metapsilosis, 71. 4% and 14. 3% of the isolates showed very strong aspartyl proteinase and phospholipase activity, respectively. Moreover, all isolates were able to form biofilm on polystyrene surface. Among the C. parapsilosis sensu stricto isolates, 9. 1%, 45. 4% and 45. 4% were strong, moderate and weak biofilm producers, respectively. Regarding C. metapsilosis, 71. 4% were moderate and 28. 6% were weak biofilm producers. We also demonstrated that C. parapsilosis sensu stricto was capable of associating synergistically with both bacteria tested, since in polymicrobial biofilms a significantly higher number of bacterial cells adhered, compared to their own monomicrobial condition. However, bacterial cells did not interfere on the efficiency of yeast biofilm formation. When testing sanitizers, we showed that 70% ethyl alcohol and 1% sodium hypochlorite were effective to significantly decrease the number of viable cells, although they have not been able to eliminate the microbial populations of the biofilms. Our data also showed that the cells from all monomicrobial biofilms exhibited elevated tolerance to their respective antimicrobial drugs, at higher doses than their pre-determined minimal inhibitory concentration values. Nevertheless, biofilms of 6, 12 and 24 h of C. parapsilosis sensu stricto presented some decrease in cell viability to the treatment with ketoconazole, whereas 48 h biofilms were resistant to this antifungal. In polymicrobial biofilms, the bacterial cells did not affect the tolerance of yeast isolates to this antimicrobial. Conversely, S. aureus and Acinetobacter sp. cells were even more tolerant to the treatment with vancomycin and polymyxin B, respectively, when they were in polymicrobial biofilms, which was significantly different from their respective monomicrobial condition. The results from this work revealed the ability of “C. parapsilosis complex” isolates from nosocomial environment to express important virulence factors, as well as to interact synergistically with bacterial species of clinical importance. This data is clinically relevant, since such phenotypic features may represent an important risk in terms of nosocomial infection to hospitalized patients. / As espécies do “complexo Candida parapsilosis” mostram-se como frequentes agentes etiológicos de candidemias nosocomiais, sendo a C. parapsilosis sensu stricto uma das espécies não-albicans de Candida de maior incidência em infecções clínicas, estando relacionada principalmente com dispositivos médicos implantados. Neste estudo, identificamos, em nível de espécie, 29 isolados pertencentes ao “complexo Candida parapsilosis”, todos previamente obtidos a partir do ambiente hospitalar e de dispositivos médicos. Os isolados também foram caracterizados quanto à atividade in vitro de aspartil proteinase e fosfolipase, e quanto à habilidade de formar biofilmes. Os isolados identificados como C. parapsilosis sensu stricto foram avaliados quanto à capacidade de interagir com Staphylococcus aureus e Acinetobacter sp. no desenvolvimento de biofilmes polimicrobianos de duas espécies. Estes biofilmes foram então analisados quanto à sua capacidade de tolerar o tratamento com concentrações crescentes de fármacos antimicrobianos e sanitizantes. Como resultados, 75,9% dos isolados foram identificados como C. parapsilosis sensu stricto, 24,1% como Candida metapsilosis e nenhum como Candida orthopsilosis. Em relação à C. parapsilosis sensu stricto, todos os isolados mostraram-se como produtores muito fortes de aspartil proteinase e 13,6% de fosfolipase. Em relação à C. metapsilosis, 71,4% e 14,3% dos isolados apresentaram atividade muito forte de aspartil proteinase e fosfolipase, respectivamente. Além disso, todos os isolados foram capazes de formar biofilme em superfície de poliestireno. Dentre os isolados de C. parapsilosis sensu stricto, 9,1%, 45,4% e 45,4% mostraram-se como produtores fortes, moderados e fracos de biofilme, respectivamente. Em relação aos de C. metapsilosis, 71,4% foram moderados e 28,6% foram fracos formadores de biofilme. Demonstramos também que a C. parapsilosis sensu stricto foi capaz de se associar de forma sinérgica com ambas as bactérias testadas, pois nos biofilmes polimicrobianos um número significativamente maior de células bacterianas se aderiram em comparação à sua condição monomicrobiana. Entretanto, as bactérias não interferiram na eficiência de formação de biofilmes da levedura. O tratamento com sanitizantes mostrou que o álcool etílico a 70% e o hipoclorito de sódio a 1% foram eficazes em diminuir significativamente o número de células viáveis, mas não foram capazes, mesmo assim, de eliminar as populações microbianas dos biofilmes. Além disso, nossos dados mostraram que as células integrantes de todos os biofilmes monomicrobianos avaliados apresentaram elevada tolerância aos seus respectivos antimicrobianos, em doses superiores aos seus valores de concentração inibitória mínima, previamente determinados. Mesmo assim, os biofilmes de C. parapsilosis sensu stricto de 6, 12 e 24 h mostraram alguma perda de viabilidade celular ao tratamento com cetoconazol, enquanto biofilmes de 48 h se mostraram resistentes a este antifúngico. Nos biofilmes polimicrobianos, a presença das células bacterianas não influenciou a tolerância das leveduras ao antimicrobiano. Por outro lado, as células de S. aureus e Acinetobacter sp. foram ainda mais tolerantes ao tratamento com vancomicina e polimixina B, respectivamente, quando em biofilmes polimicrobianos, de forma significativa em comparação às suas respectivas condições monomicrobianas. Os resultados deste trabalho revelaram a capacidade de isolados do “complexo C. parapsilosis” do ambiente nosocomial de expressar importantes fatores de virulência, bem como de interagir sinergicamente com bactérias de importância clínica. Em conjunto, estas informações mostram-se de grande relevância clínica, em função de tais características fenotípicas representarem um importante risco em termos de infecção hospitalar a pacientes internados.

Orientador: Rubens Nisie Tango / Banca: Estevão Tomomitsu Kimpara / Banca: Karla Zanini Kantorski / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da vitrificação e do polimento na rugosidade superficial e formação in situ de biofilme dentário inicial, após simulação da escovação, em cerâmica policristalina de zircônia parcialmente estabilizada por ítrio (Cercon® Zirconia, Dentsply Ceramco). Amostras foram divididas em: (C) controle - sem tratamento; (V) vitrificadas; (PS) polidas com pontas de silicone diamantadas. Metade das amostras foi submetida à simulação de escovação (400.000 ciclos). Análises da rugosidade superficial (Ra e Rz) foram realizadas antes e após os tratamentos superficiais e escovação. Dez voluntários selecionados com adequado padrão de higiene bucal receberam dispositivos oclusais individualizados para a fixação das amostras na face vestibular. Após 8 horas em ambiente bucal, as amostras foram removidas do dispositivo e avaliadas em MEV (n=5) e MCVL (n=10). A análise em MEV foi realizada por meio da seleção aleatória de cinco campos (20 x 25 μm) para cada amostra para análise descritiva do material celular/acelular depositado e da topografia superficial. Para análise em MCVL, foram captadas imagens em lentes ópticas com aumento de 10 x/ 0.3 para visualização de toda a amostra e aumento de 63 x/ 0.3 (imagens 3D com secções ópticas de 0,8 μm) para análise de biovolume e espessura média de biofilme. O software COMSTAT quantificou as imagens obtidas em MCVL. Os dados obtidos de rugosidade (μm) foram submetidos à Análise de Variância (dois fatores) e teste de Dunnett (5%). Biovolume e espessura de biofilme foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. O grupo V apresentou maiores valores de rugosidade superficial, espessura média e biovolume de biofilme, em presença de escovação simulada. O fator escovação não foi preponderante para o aumento da rugosidade superficial. Houve correlação significativa entre... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of the glaze and polishing in the surface roughness and early dental biofilm formation, after toothbrushing simulation, in tetragonal zirconium polycrystal stabilized with yttrium ceramics (Cercon® Zirconia, Dentsply Ceramco). Ceramics samples were divided in three groups: control - not glazed (C); glazed (G); polishing with diamonds silica tip (ST). Half samples was submitted to toothbrushing simulation (400.000 cycles). Analyses of surface roughness (Ra and Rz) were carried before and after the superficial treatments and toothbrushing. Ten volunteers selected with high level of oral hygiene were selected for this study. Oral devices covering the crowns of the upper premolars and molars were fabricated for each participant and ceramic samples were fixed on the vestibular zones of the devices. After 8 hours in situ, the samples were removed from device and analyzed in SEM (n=5) and CLSM (n=10). To SEM analysis was selected means of the random election of five fields (20 x 25 μm) for each sample for descriptive analysis of the deposited cellular material/to acelular and the superficial topography. For analysis in CLSM were used for architecture visualization and lenses of 63x/0.13 for COMSTAT analysis and quantification. The resulting sets of confocal optical sections were collected by microscopy software as stacks of images 3-D images were obtained for analysis of biovolume and average thickness of biofilm. The data of surface roughness (μm) were submitted to analysis of variance (two factors) and Dunnett's test (5%). Biovolume and mean thickness biofilm were analyzed by Kruskal-Wallis and Mann-Whitney's test. The G Group presented greaters values of surface roughness, average thickness and biovolume of biofilm, in toothbrushing presence... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Banca: Ary Fernandes Junior / Banca: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Resumo: Bactérias do gênero Salmonella estão entre as principais causas de enfermidades transmitidas por alimentos (ETA), sendo que os de origem animal são os maiores responsáveis pela veiculação desse micro-organismo, principalmente frangos que são portadores assintomáticos de alguns sorotipos patogênicos para o homem. A Instrução Normativa n° 70 (2003), do Programa de Redução de Patógenos do Ministério da Agricultura e Abastecimento confere um controle minucioso sobre o processo de abate, garantindo a higiene correta dos alimentos e sua segurança em todos os estágios da produção. Porém, a presença de micro-organismos formadores de biofilmes nas indústrias de alimentos, como a Salmonella, é motivo de preocupação pelas falhas que podem ocorrer no processo de higienização. As propriedades físico-químicas de uma superfície podem exercer influência sobre a adesão dos micro-organismos, os quais aderem mais facilmente às superfícies hidrofóbicas (PVCs) do que às hidrofílicas (vidro ou metais como aço inox). Assim como outras bactérias patogênicas, as salmonelas possuem fímbrias e produzem celulose, que vão influenciar na sua adesão às superfícies e estão entre os principais componentes da matriz em biofilmes. Os genes agf (agregative fímbrias) estão envolvidos na biossíntese de fímbrias, enquanto o segundo componente, a celulose, é produzida pelos genes bcsA, bcsB, bcsZ e bcsC (síntese de celulose bacteriana). A produção de fímbrias, co-regulada pelo regulador tipo LuxR, o agfD, vai regular indiretamente a produção de celulose atuando no gene adrA. A expressão dos dois componentes leva à formação dessa matriz. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo a pesquisa da presença desses genes nas cepas de Salmonella sp., isoladas de frango e o comportamento dessas cepas quanto à produção... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacteria of the genus Salmonella are among the leading causes of foodborne disease (FBD), being, those from animals, the most responsibles for placement this microorganism, especially poultry that are asymptomatic carriers of some serotypes pathogenic to humans. Normative Instruction No. 70 (2003), of the Pathogen Reduction Program of the Ministry of Agriculture and Supply gives rigorous control over the slaughter process, ensuring proper food hygiene and safety in all stages of production. However, the presence of microorganisms forming biofilms in the food, such as Salmonella, is a cause of concern due to the failures that may occur in the process of cleaning. The physicochemical properties of a surface can influence the adhesion of microorganisms, which adhere more readily to hydrophobic surfaces (PVCs) than to hydrophilic (glass or metals such as stainless steel). Like other pathogenic bacteria, Salmonella possess fimbriae and produces cellulose, which will affect their adherence to surfaces and are among the main components of the matrix in biofilms. Genes agf (agregative fimbriae) are involved in the biosynthesis of fimbriae, while the second component, cellulose, is produced by genes bcsA, bcsB, bcsZ and bcsC (bacterial cellulose synthesis). The production of fimbriae, co-regulated by LuxR type regulator, the agfD, will regulate the production of cellulose indirectly acting on the gene adrA. The expression of these two components leads to the formation of this matrix. Therefore, this study aimed to research the presence of these genes in strains of Salmonella isolated from poultry and the behavior of these strains for the production of biofilm at different temperatures (16º, 20º, 28º and 35ºC) and materials (glass, PVC and stainless steel) as well as the analysis of the characteristic morphology expressed at 28°C, optimum temperature for the production of biofilm / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Helen Alves Penha / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Resumo: O cancro cítrico tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), que afeta diferentes espécies de citros economicamente importantes. É uma doença ainda sem método curativo, e pela sua relevância e dano econômico, faz-se necessário o entendimento em termos moleculares da interação Xac-citros para o desenvolvimento de estratégias que controlem a doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da deleção da ORF XAC0024 presente no genoma da Xac isolado 306, que codifica uma proteína hipotética conservada e que apresenta vários domínios putativos, entre eles o domínio peptidase M23. A hipótese é que esta proteína pode estar envolvida com a patogenicidade e/ou virulência da bactéria. Para obter o mutante ΔXAC0024 foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida, seguida de recombinação homóloga com o vetor suicida pOK1. O mutante ΔXAC0024 foi analisado em relação às características de patogenicidade, crescimento in vivo e in vitro, capacidade de autoagregação, produção de biofilme e produção de goma xantana. O teste de patogenicidade e a curva de crescimento in vivo foram realizados em limão cravo utilizando o método de infiltração por seringa para a inoculação da bactéria. Os sintomas do desenvolvimento da doença foram registrados por fotografia digital até o 25º dia após a inoculação (dai) e a curva de crescimento in vivo também foi determinada até o 25º dai. A curva de crescimento in vitro e a agregação célula-a-célula foram analisa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects different species of economically important citrus. There is no a curative method for this disease, and do to its relevance and economic damage, it is necessary to understand at molecular level the Xac-citrus interaction in order to develop strategies to control the disease. The objective of this study was to investigate the effects of the deletion of the ORF XAC0024 present in the genome of Xac strain 306, which encodes a conserved hypothetical protein and has several putative domains, including peptidase M23 domain. It is hypothesized that this protein may be involved in the pathogenicity and / or virulence of the bacterium. For the ΔXAC0024 mutant was used for site-directed mutagenesis technique, followed by homologous recombination with the suicide vector pOK1. The ΔXAC0024 mutant was analyzed in relation to pathogenicity characteristics, growth in vivo and in vitro, self-aggregation capacity, biofilm production and production of xanthan gum. The pathogenicity test and in vivo growth curves were performed on Rangpur lime using syringe-infiltration method for the inoculation of bacteria. Symptoms of the disease development were recorded by digital photography to the 25° day after inoculation (dai) and in vivo growth curve was also determined to give the 25°. The growth curve in vitro and cell-to-cell aggregation were analyzed in liquid culture medium NB. Biofilm p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Fernanda Lourenção Brighenti / Banca: Aline Voltan / Banca: Fabíola Galbiati / Banca: Elisa Aparecida Giro / Banca: Marlise Inêz Klein Furlan / Resumo: A proximidade entre micro-organismos presentes no biofilme dentário determina a existência de interações entre eles, que podem beneficiar ou antagonizar as espécies envolvidas. Os objetivos deste estudo foram: 1) apresentar uma revisão de literatura sobre interações entre espécies bacterianas cariogênicas no biofilme oral; 2) validar o uso do reator 'drip-flow' (DFR) para desenvolver biofilmes dentários e testar agentes antimicrobianos; 3) avaliar o crescimento e a suscetibilidade à clorexidina de biofilmes compostos por Streptococccus mutans ATCC 25175 e Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, usando o DFR; 4) avaliar o crescimento e a suscetibilidade à clorexidina de biofilmes compostos por Streptococccus mutans e Actinomyces naeslundii ATCC 12104, usando o DFR. Biofilmes cresceram sobre lâminas de vidro cobertas com hidroxiapatita e caldo BHI suplementado com sacarose 0.2% ou 0.5%, dependendo das espécies e um fluxo de 10 mL/h foi usado. O DFR foi incubado por 24 h a 37 °C / 5% CO2. Biofilmes foram tratados com clorexidina 0.2% (CHX) ou NaCl 0.9% por 2 min. Crescimento e efeito dos tratamentos foram determinados por contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Biofilmes foram marcados com o kit de Viabilidade Live/Dead e analisados por microscopia confocal de varredura a laser para diferenciar células com membranas íntegras das lesadas pela ação da CHX. A validação do DFR foi analisada por teste t (α=0.05). Avaliação da interação foi analisada por ANOVA dois fatores e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The proximity between microorganisms present in dental biofilm determines the existence of interaction between them, which can benefit or antagonize the involved species. The aims of this study were: 1) to present a review about interactions among cariogenic bacterial species within oral biofilm; 2) to show the applicability of the drip flow reactor (DFR) for developing oral biofilms and testing antimicrobial agents; 3) to evaluate the growth and chlorhexidine susceptibility of biofilms comprised by Streptococcus mutans ATCC 25175 and Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, using DFR; 3) to assess the growth and chlorhexidine susceptibility of biofilms comprised by Streptococcus mutans ATCC 25175 and Actinomyces naeslundii ATCC 12104, using DFR. Biofilms grew on hydroxyapatite coated glass slides, with BHI broth at 10 mL/h flow rate supplemented with 0.2 or 0.5% sucrose depending on the species used. DFR was incubated for 24 h at 37 °C / 5% CO2. Biofilms were treated with 0.2% chlorhexidine (CHX) or 0.9% NaCl for 2 min. Growth and effect of treatments were determined by colony forming units (CFU) counts. Biofilms were stained using the Live/Dead Viability kit and analyzed by confocal laser scanning microscopy (CLSM) to differentiate bacterial cells without damage and damaged by the action of CHX. DFR validation was analyzed by unpaired t test (α=0.05). Interaction evaluation was analyzed by two-way ANOVA and Tukey test (α=0.05). Literature review showed the role of microbial int... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Banca: Rodrigo Taanelli Hernandes / Banca: José Paes de Almeida Nogueira / Resumo: A contaminação cruzada é um dos principais fatores que contribuem para os surtos de doenças de origem alimentar. Estima-se que até 60% dos casos de doenças transmitidas por alimentos estejam relacionados às práticas inadequadas, como a contaminação cruzada envolvendo superfícies de corte, onde a carne de frango crua é manipulada concomitantemente a outros alimentos. Dentre os micro-organismos responsáveis por causar doenças de origem alimentar, destaca-se Salmonella spp., sendo o sorovar S. Enteritidis o mais envolvido nos casos de infecções humanas além de ser reconhecida pela sua capacidade de aderir, colonizar e formar biofilme em superfícies de contato com alimentos. O biofilme permite que as bactérias se desenvolvam e cresçam aderidas a superfícies conferindo resistência aos processos de higienização, podendo causar contaminação durante o preparo dos alimentos. Assim, 10 cepas de S. Enteritidis foram utilizadas para testes de contaminação cruzada entre três superfícies de corte (plástico, madeira e vidro) e pepinos antes e depois da higienização. Além disso, essas cepas foram avaliadas quanto a sua capacidade de formar biofilme em materiais hidrofóbicos (madeira e plástico) e hidrofílicos (vidro). Quando as superfícies testadas não foram higienizadas houve a recuperação das células bacterianas de todas as superfícies e, depois, em todos os pepinos em contato com essas superfícies. Em relação às superfícies de corte higienizadas, o vidro foi o material que apresentou a menor recuperação do patógeno e a menor ocorrência de contaminação cruzada para pepinos. Entre as 10 cepas testadas, três (30%) não foram capazes de produzir biofilme em nenhumas das superfícies analisadas, mesmo possuindo os genes csgD e adrA. A maior porcentagem de produção de biofilme ocorreu na madeira e no plástico (60% e 40%, respectivamente) seguido do vidro (10%), mostrando que a bactéria adere melhor em ... / Abstract: The cross-contamination is one of the main factors which contribute to foodborne outbreak. It is estimated that about 60% of foodborne diseases are related to the inappropriate practices, such as cross-contamination involving cutting surface, where the raw chicken is manipulated concurrently to other food. Among the microorganisms responsible by causing foodborne diseases, we can highlight the Salmonella spp., being the serovar Salmonella Enteritidis the one most involved in cases of infection in humans besides being recognized by its capacity to adhere, colonize and biofilm formation on surfaces of contact with food. The biofilm allows the bacteria to develop and grow adhered to surfaces offering resistance to the hygienic process, being able to cause contamination during the food prepare. Thus, 10 strains of S. Enteritidis were used to test the cross-contamination among three cutting surfaces (plastic, wood and glass) and cucumbers before and after hygiene. Besides, these strains were evaluated to their capacity to form biofilm in hydrophobic materials (wood and plastic) and hydrophilic (glass). When the tested surfaces were not sanitized there was the recovering of Salmonella on all the surfaces and in the cucumbers which had contact with these surfaces. Related to the cutting surfaces under sanitized process, the glass was the material with less recovering of the pathogen and the lower occurrence of cross contamination with the cucumbers. Among the 10 strains, three (30%) were not able to produce biofilm in any surface, even in a presence of csgD and adrA genes. The largest percentage of biofilm production occurred on the wood and plastic (60% and 40%, respectively) followed by glass (10%), showing the bacteria adhere better in hydrophobic material. It is possible to conclude that the cutting surfaces represent a critical point in cross-contamination, mainly when they weren't sanitized. S. Enteritidis was able to form biofilm in ... / Mestre

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Coorientador: Alessandro Lia Mondelli / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Banca: Antônio Carlos Pignatari / Resumo: Na última década houve uma clara mudança na etiologia da sepse. Dados recentes do National Healthcare Safety Network (NHSN) mostram que os cocos Gram-positivos têm ultrapassado os bacilos Gram-negativos como os principais agentes etiológicos e os Estafilococos coagulase negativa (ECN) se tornaram os agentes mais frequentes. Entretanto a maioria dos laboratórios clínicos não identifica esses microrganismos a nível de espécies devido à necessidade de realização de uma série de provas bioquímicas. A aplicação de técnic as de biologia molecular, entre elas a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a identificação de bactérias se mostrou uma técnica promissora devido a sua rapidez, acurácia e sensibilidade. Assim, este trabalho objetivou avaliar a eficiência, acurácia e sensibilidade da técnica de PCR multiplex para a detecção do gênero e de espécies de Staphylococcus spp. mais encontradas em hemoculturas, do operon ica de produção de biofilme e da presença do gene mecA de resistência à oxacilina diretamente dos frascos de hemocultivo. Foram analisadas 371 amostras de hemoculturas, positivas para o gênero Staphylococcus obtidas de pacientes atendidos no HC da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB). As amostras foram isoladas e identificadas por testes bioquímicos convencionais e simultaneamente o DNA bacteriano foi extraído diretamente das hemoculturas e destes realizou-se o PCR multiplex. Das 371 amostras estudadas 85 (23,0%) foram de S. aureus e 286 (77,0%) ECN. Dos ECN 152 (53,1%) foram identificados como S. epidermidis, 36 (12,6%) S. haemolyticus, 36 (12,6%) S. hominis, 23 (8,0%) S. capitis, 18 (6,3%) S. warneri, 7 S. caprae, 5 S. simulans, dois S. lugdunensis, dois S. cohnii, um S. saprophyticus, um S. schleiferi, um S. xylosus e concomitantemente um S. haemolyticus e S. hominis, e um S. haemolyticus e S. epidermidis. Das 85 amostras de S. aureus, 43 (50,6%) se mostraram resistentes à oxacilina pelo ... / Abstract: A clear shift in the etiology of sepse has occurred in the last decade. Recent data from the National Healthcare Safety Network (NHSN) show that Gram-positive cocci have exceeded Gram-negative bacilli as the major etiological agents. In this respect, coagulase-negative staphylococci (CoNS) have become the most frequent. However, most clinical laboratories do not identify these microorganisms to species level due to the need for a series of biochemical tests. The application of molecular biology techniques, including the polymerase chain reaction (PCR), for bacterial identification proved to be promising due to their speed, accuracy and sensitivity. The aim of this study was to evaluate the efficiency, accuracy and sensitivity of multiplex PCR for the detection of Staphylococcus spp. frequently found in blood cultures, investigation of the ica operon involved in biofilm formation and the mecA gene encoding oxacillin resistance, and direct detection of major CoNS species in blood culture flasks. A total of 371 blood culture samples positive for Staphylococcus spp. obtained from patients seen at the Hospital of the Botucatu School of Medicine (FMB) were analyzed. The strains were isolated and identified by conventional biochemical tests. Simultaneously, bacterial DNA was extracted directly from the blood cultures for multiplex PCR. S. aureus was isolated from 85 (23%) of the 371 samples studied and CoNS from 286 (77%). Among the latter, 152 (53.1%) isolates were identified as S. epidermidis, 36 (12.6%) as S. haemolyticus, 36 (12.6%) as S. hominis, 23 (8%) as S. capitis, 18 (6.3%) as S. warneri, 7 as S. caprae, 5 as S. simulans, two as S. lugdunensis, two as S. cohnii, one as S. saprophyticus, one as S. schleiferi, and one as S. xylosus. S. haemolyticus and S. hominis were concomitantly identified in one sample and S. haemolyticus and S. epidermidis in another. Forty-three (50.6%) of the 85 S. aureus strains were resistant to oxacillin in ... / Mestre

Orientador: Elerson Gaetti Jardim Junior / Banca: Ana Cláudia Okamoto / Banca: Adriana de Sales Cunha Correia / Resumo: Introdução: A relação entre a microbiota bucal e infecções graves em pacientes mantidos internados em unidades de terapia intensiva (UTI) vem sendo estabelecida, principalmente para os portadores de próteses totais ou parciais, visto que o biofilme bucal pode se converter em reservatório de microrganismos que não fazem parte dessa microbiota. Objetivo: Esse estudo objetivou avaliar a presença dos principais patógenos periodontais e oportunistas na boca de pacientes mantidos em unidades de terapia intensiva. Material e Método: Foram obtidos dados referentes às condições de saúde de 156 pacientes mantidos por mais de 72 horas em ambiente de UTI. Realizou-se exames clínicos intrabucais e coleta de amostras de saliva e mucosas bucais, de secreções respiratórias, sangue e urina. A presença dos principais microrganismos bucais e oportunistas associados às infecções hospitalares foi avaliada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). A análise estatística foi realizada pelos testes de Mann-Whitney e Test T, enquanto a correlação entre as variáveis foi obtida pelo Teste de Spearman, todos ao nível de significância de 5%. Resultados: Houve correlação negativa entre a presença de leucócitos e alguns patógenos oportunistas bucais e exógenos. Os microrganismos estudados foram mais prevalentes no gênero masculino e os anaeróbios obrigatórios e microrganismos capnofílicos oriundos do ambiente bucal se mostraram mais relevantes nas infecções sistêmicas do que os patógenos oportunistas exógenos, como as enterobactérias e os pseudomonados. Conclusão: Concluiu-se que a fragilidade da saúde bucal de pacientes internados em UTI, por vezes com imunossupressão, associada a colonização e/ou infecção de microrganismos oportunistas, pode ser um fator agravante na deterioração e piora do quadro sistêmico do paciente / Abstract: Introduction: The relationship between the oral microbiota and serious infections in patients kept in intensive care units (ICU) has been established, mainly for patients with dentures or partials, since oral biofilm can become reservoir of micro-organisms that are not part of this microbiota. Objective: This study aimed to evaluate the presence of the main periodontal pathogens and infections in the mouth of patients kept in intensive care units. Material and method: Data were obtained on the health conditions of 156 patients held for more than 72 hours in the ICU environment. Intraoral clinical examination was carried out and collection of samples of saliva and oral mucosa, respiratory secretions, blood and urine. The presence of the main oral and opportunistic micro-organisms associated with hospital-acquired infections were evaluated by means of the polymerase chain reaction (PCR). Statistical analysis was performed by Mann-Whitney tests and Test T, while the correlation between the variables was obtained by Spearman test, all at a significance level of 5%. Results: There was a negative correlation between the presence of leukocytes and some oral opportunistic pathogens and exogenous. The microorganisms studied were more prevalent in male gender and obligate anaerobes and capnofilicos microorganisms from oral cavity were more relevant in systemic infections than the exogenous opportunistic pathogens, such as Enterobacteriaceae and Pseudomonas. Conclusion: It was concluded that the fragility of the oral health of patients admitted to ICU, sometimes with immune suppression associated with the colonization and/or infection from opportunistic micro-organisms can be an aggravating factor in the deterioration and worsening of the patient's systemic framework / Mestre