Las vías de degradación intracelular de proteínas, son numerosas y diferentes según la proteína, célula y situación metabólica. El proteasoma se considera una de las principales vías implicadas en estos procesos y esta Tesis Doctoral se ha centrado en averiguar algunos aspectos, todavía poco claros, en relación con esta vía proteolítica. Investigamos la posible existencia de poblaciones de proteasomas, en diversas localizaciones celulares que difieran en su composición en subunidades. Encontrando que tanto en hígado de rata como en células cultivadas de mamífero los proteasomas se localizan sobre todo en el citosol, pero también en el núcleo y asociados a la cara externa de la membrana del retículo endoplásmico. Además, las subunidades del proteasoma 20S y de sus complejos reguladores no se encuentran libres en las células en cantidades apreciables. Aunque los diferentes proteasomas se encuentran en todas esas localizaciones, la proporción de proteasomas 26S asociada al retículo endoplásmico es mayor que la de los proteasomas 20S y que los inmunoproteasomas y los proteasomas PA28 se encuentran en cantidades pequeñas en el núcleo.Determinamos en cultivos celulares, fibroblastos humanos, en diferentes condiciones de crecimiento, la contribución de los proteasomas y de otras vías proteolíticas a la degradación general de proteínas intracelulares. Encontrando que los inhibidores MG132 y ALLN, que han sido utilizados ampliamente como inhibidores específicos de los proteasomas, son también inhibidores muy eficaces de las vías proteolíticas lisosomales. Las principales vías proteolíticas en la degradación intracelular de proteínas de vida media corta y larga son los proteasomas y los lisosomas, que son responsables de un 80% o más de toda la degradación. Las distintas vías proteolíticas están reguladas de forma distinta ya que se activan o inhiben de manera diferente en las diferentes condiciones de crecimiento. Así por ejemplo, la macroautofagia se activa en ausencia de suero y/o de aminoácidos y su importancia disminuye en el ayuno prolongado, mientras que otras vías lisosomales diferentes a la macroautofagia se activan en células confluentes y su importancia aumenta en el ayuno prolongado. En cuanto a los proteasomas, son más activos en ausencia de suero probablemente debido a un incremento en la cantidad de proteínas ubicuitiladas y son menos activos en confluencia debido a la sustitución del complejo regulador 19S y de las subunidades intercambiables del proteasoma 20S por el complejo regulador PA28 y las subunidades del inmunoproteasoma, respectivamente. Analizamos el papel de los proteasomas en la degradación de una proteína específica de membrana plasmática, el receptor de LDL, y estudiamos si una de las mutaciones más frecuente en población española, la C358Y, que produce Hipercolesterolemia Familiar (HF), afecta a las vías degradativas de este receptor. Encontrando que la forma madura del receptor humano de LDL se degrada mayoritariamente por proteasomas, pero también por lisosomas y que la mutación C358Y del receptor humano de LDL retrasa su maduración provocando que parte de la forma precursora sea degradada por lisosomas y disminuye la estabilidad del receptor humano maduro de forma que su degradación transcurre a través de una vía casi exclusivamente lisosomal. Nuestros resultados suponen, por tanto, una cooperación de las dos principales vías degradativas en la degradación de una proteína específica. Además, una mutación puntual (C358Y) puede determinar que la vía de degradación del receptor cambie ya que en el caso del receptor mutante (C358Y) la vía degradativa pasa a ser mayoritariamente lisosomal. Es decir, los dos sistemas proteolíticos mayoritarios cooperan en la degradación de una misma proteína y su importancia relativa puede variar por mutaciones puntuales en la secuencia de la misma. / The results demonstrate that different regulatory complexes and subpopulations of proteasomes have different distributions within mammalian cells. They were mainly found in the cytosol but were also present in the nucleus and associated with the endoplasmic reticulum. The 19S regulatory complexes were found to be relatively enriched in endoplasmic reticulum fractions from rat liver and the PA28 regulatory complexes were found to be localized predominantly in the cytoplasm. The contributions of the main proteolytic pathways to the degradation of long-lived and short-lived proteins in human fibroblasts grown under different conditions were also investigated. The effects of various commonly used pharmacological inhibitors of protein degradation were first analysed in detail. By choosing specific inhibitors of lysosomes and proteasomes, it was observed that both pathways accounted together for 80% or more of the degradation of cell proteins. With lysosomal inhibitors, it was found that serum withdrawal or amino-acid deprivation strongly stimulated macroautophagy but not other lysosomal pathways, whereas confluent conditions had no effect on macroautophagy and slightly activated other lysosomal pathways. With proteasomal inhibitors, it was found that, in exponentially growing cells in the absence of serum, activity of the ubiquitin-proteasome pathway increases, whereas under confluent conditions the contribution of proteasomes to degradation decreases, especially in cells deprived of amino acids. Interestingly, in confluent cells, the levels of two components of the 19 S regulatory complex and those of an interchangeable beta-subunit decreased. This was associated with a marked increase in the levels of components of PA28-immunoproteasomes. A mutation (C358Y) in the low-density lipoprotein receptor (LDLR), which is the most prevalent in a sample of familial hypercholesterolemia patients from Valencia (Spain) was finally investigated. Post-translational processing of the mutant LDLR precursor to the mature form was apparently retarded and part of this precursor was degraded by a lysosomal pathway. Also, the mature form of the mutant LDLR undergoes rapid degradation when compared to the wild type LDLR. The mature forms of wild-type LDLR and mutant C358Y are mainly degraded by proteasomes and lysosomes, respectively. Thus, a single mutation in the LDLR changes the degradative pathway of this protein.

Este trabajo presenta el estudio ecológico de los microcrustáceos planctónicos o semiplanctónicos de las aguas continentales siendo tres los objetivos principales. (1). Relacionar la distribución de estos organismos con las características físico-químicas de sus hábitats e intentar establecer una tipología de los mismos basada en las asociaciones de microcrustáceos. Se estudiaron los litorales de 45 lagunas de Castilla-La Mancha, encontrándose un total de 82 especies (32 copépodos, 45 cladóceros y 5 anostráceos). Obtuvimos 5 asociaciones de especies características de diferentes ambientes determinadas por la salinidad y la temporalidad: (I) Lagunas cársticas sin flujo de agua: Acroperus neglectus, Alona guttata; (II) Lagunas cársticas con flujo de agua Alonella. excisa, Ceriodaphnia. pulchella; (III) Lagunas temporales de aguas dulces: Mixodiaptomus ortizi, Hemidiaptomus roubaui; (IV) Lagunas temporales subsalinas e hiposalinas de baja salinidad: Megacyclops viridis, Metacyclops minutus y (V) Lagunas temporales salinas: Arctodiaptomus salinus, Arctodiaptomus wierzejskii. (2). Conocer la distribución vertical y los ciclos estacionales de estos organismos en la laguna meromíctica de La Cruz, con un fenómeno anual de precipitación de carbonato cálcico (fenómeno blanco) durante tres años. Encontramos un total de 5 especies planctónicas (3 cladóceros y 2 copépodos). La mayoría de organismos están en el metalimnion durante los períodos de estratificación y durante el periodo de mezcla están más dispersos por la columna de agua, excepto Cyclops abyssorum que presenta un máximo en profundidad. En cuanto a las variaciones estacionales la densidad de población de los crustáceos planctónicos es mayor desde principios de primavera hasta finales de verano y el patrón de diversidad observado presenta mínimos en invierno y máximos en verano. Todas las especies presentan distribuciones excluyentes y sus máximos de población nunca coinciden. Analizamos el efecto del fenómeno blanco, encontrando Diaphanosoma brachyura como la única población significativamente afectada. Estudiamos las poblaciones litorales en 5 puntos. La variación estacional está afectada por la mezcla vertical y el fenómeno blanco. La zona litoral está invadida por las especies planctónicas, especialmente por Tropocyclops prasinus Y además estudiamos la sedimentación de los organismos mediante trampas. Los restos mejor conservados fueron los de los quidóridos. El transporte de los restos de los organismos litorales hacia el centro ocurre vía picnoclinas (interfase óxico-anóxica). La sedimentación de los restos orgánicos está marcada por el fenómeno blanco y la mezcla invernal. (3). Determinar las migraciones verticales diarias y los cambios que esto supone en la estructura vertical de las poblaciones en dos lagunas cársticas estratificadas y meromícticas (La Cruz y El Tobar). En La Cruz el estudio de migración vertical se centró en el efecto del fenómeno blanco sobre las poblaciones planctónicas. Los cladóceros realizan una migración normal y cuando se da el fenómeno blanco se sitúan a menor profundidad y presentan una relación directa entre la amplitud de migración y la transparencia del agua. Mientras que los copépodos, muestran tanto migración normal como inversa y dentro de una misma especie encontramos diferencias según los estadios de desarrollo. Estudiamos la migración vertical en El Tobar en diferentes épocas. En septiembre y abril observamos migración normal para las 3 especies de cladóceros (Daphnia longispina, Ceriodaphnia dubia y Bosmina longirostris) y en noviembre migración inversa. Mientras que en los copépodos (Arctodiaptomus salinus y Tropocyclops prasinus) solo A. salinus presentaba migración inversa en septiembre y ningún patrón en el resto de las fechas, encontrándose siempre en capas profundas. Hicimos un estudio específico de D. longispina y no encontramos diferencias morfométricas en las poblaciones pero sí marcadas diferencias en la distribución de tamaños. Las variaciones observadas en el tamaño medio, en el tamaño de la primera reproducción y en los diferentes patrones de migración son interpretados como respuestas a diferentes depredadores. / This study focuses on the ecological study of planktonic microcrustaceans of lakes. The three main aims are: (1) To relate the distribution of these organisms with the physical and chemical characteristics of their environments and try to establish an habitat typology based on microcrustacean assemblages. The littoral areas of 45 water bodies in Castilla-La Mancha were studied. A total of 82 species were found: 32 copepods, 45 cladocerans and 5 anostraceans. The zooplanktonic assemblages found, whether between the different species were mainly dominated by two factors, salinity and permanence of water. (2) To know the vertical distribution and seasonal cycles of these organisms in a water meromictic lake (La Cruz) with an annual whiting due to calcium carbonate precipitation during three years. A total of 5 planktonic species were found (three cladocerans and two copepods). The marked stratification of this lake results in a strong spatial heterogeneity along the vertical profile. Most of the organisms are located in the metalimnion during the stratified periods. The effect of the whiting was also analysed, but the only population being significantly affected was Diaphanosoma brachyura. Littoral populations were studied at five different points. Seasonal variations are related to lacustrine processes (vertical mixing and whiting). In addition, settling was studied by means of sedimentation traps. Among the collected rests, those of chydorids were the best preserved. (3) To describe diel vertical migrations and the associated changes with respect to the vertical structure of zooplanktonic populations in stratified meromictic karstic lakes (La Cruz and El Tobar). In La Cruz, the study of the vertical migration focuses on the effect of whiting over the planktonic species. The cladoceran species showed a typical pattern but when whiting occurs the populations has a shallower mean residence depth and their migration distance is shorter. The copepods show either normal or reverse migration. In El Tobar was studied at different periods. September and April normal migration patterns were observed for the three cladoceran species and in November showed reverse patterns. In, reverse migration for the copepod Arctodiaptomus salinus in September and no migration pattern was found for Tropocyclops prasinus.

La investigación se centra en cinco aspectos relacionados con la biología y ecología de la especie. Tras una introducción sobre el área que se efectúa en el Capítulo 1º, se compara en el Capítulo 2º la composición y estructura de los paseriformes palustres nidificantes más representativos en cuatro zonas del P.N. del Prat de Cabanes-Torreblanca durante tres períodos de cría (1990, 1994, 1997) mediante transecto lineal. Y además, se describe comparativamente para el año 1994 la composición y estructura de algunas comunidades de paseriformes palustres nidificantes en cinco zonas húmedas del Mediterráneo mediante el índice kilométrico de abundancia: Delta de l'Ebre, Prat de Cabanes-Torreblanca, Fondó d'Elx, L'Albufera (València) i S'Albufera (Mallorca). En el Prat, la densidad media durante la cría para el periodo 90-97 ha sido de 1.9 ind/ha (En A. scirpaceus, 0.17; A. arundinaceus, 0.39; L. luscinioides, 0.39; C. juncidis, 2.8). En la comparación entre comunidades de passeriformes se muestra que el Prat es la más singular y estable de todas ellas debido a la alta densidad de A. melanopogon y a la baja de A. scirpaceus.El Capítulo 3 explora aspectos referentes a la tendencia poblacional de la especie en el P.N. del Prat: variación estacional e interanual, abundancia de jóvenes, adultos, machos y hembras, la fenología de la reproducción, la dispersión de adultos y la abundancia durante la invernada. Se incluye un análisis preliminar de las influencias que podrían ejercer sobre éstas variables factores climáticos (lluvia y temperatura). Y todo ello a partir de resultados obtenidos en transectos y anillamiento científico llevado a término en dos estaciones de esfuerzo constante. Los resultados muestran que hay un declive, entre el antes y después de una fuerte sequía (94-95), tanto en el periodo reproductor (de 4 a 2 ind/ha) como en la invernada (de 3 a 1 ind/ha). Fenológicamente la especie está presente en el área durante todo el año. Incrementa el contingente en marzo, alcanza un pico máximo a principios de verano, desciende acusadamente a finales de verano, vuelve a mostrar otro pico en otoño para disminuir de nuevo en invierno. Hay importantes diferencias entre zonas del parque en cuanto reproducción.El Capítulo 4 aporta nuevos datos sobre las estrategias migratorias que presentan las diferentes poblaciones de Carricerín real europeas más occidentales (Lago Neusiedler, Camarga, Prat, S'Albufera), revisando su distribución geográfica y la fenología de sus movimientos en base a recuperaciones. La población austrohúngara es migradora total, distribuyéndose durante la invernada por lagunas del norte y centro de la península Itálica, Hungría, litoral de los países balcánicos y Suiza. La población francesa es migradora parcial. La parte de la población que se desplaza fuera de Francia lo hace hacia el litoral mediterráneo español a partir de octubre, con un pico importante en noviembre. El retorno se produce básicamente en febrero. La población del Prat es migradora parcial y realiza movimientos en dos direcciones (40% N, 60% S). Los jóvenes se dispersan entre mayo-julio y los adultos entre julio-septiembre. Aparecen en los humedales entre julio y noviembre, desaparecen en diciembre y enero y abandonan las áreas de invernada entre febrero y marzo no existiendo diferencias en la distribución mensual de capturas entre edades. Las poblaciones baleares de la especie no realizan movimientos fuera de las islas ya que no existe ninguna recuperación.El Capítulo 5 analiza biométricamente la población del Prat por sexos y edades, la compara con las poblaciones del Delta de l'Ebre y Fondó d'Elx y estudia diferencias en contorno alar y pluma a pluma con la población de la Camarga francesa a fin de explorar la identificación de invernantes. La población del Prat presenta dimorfismo sexual siempre a favor de los machos en ala máxima, P3, tarso y peso. Las medidas de ala y peso -no el tarso- aumentan con la edad en ambos sexos. El ala aumenta de tamaño en la primera y segunda mudas y se estabiliza en la tercera y cuarta. Los machos aumentan más que las hembras tras la primera muda, invirtiéndose las proporciones en la segunda. En peso, la tendencia es a aumentar entre el periodo juvenil y la primera muda, a estabilizarse entre la primera y tercera y a disminuir de la tercera a la cuarta, no detectándose diferencias entre sexos. Los nativos del Prat y Fondó d'Elx difieren en tarso y ala máxima, variables relacionadas con el tamaño del esqueleto. Modelos de Regresión Logística basados en variables de plumas individuales permiten identificar el 87.5% de los invernantes franceses y el 96.6% de los nativos del Prat. Los individuos franceses que presentan una misma longitud en P2 o P9 tienden a tener una P3 o P8, respectivamente, más corta.El Capítulo 6 estudia las tasas de supervivencia de la especie en el Prat a partir de los datos de autocontroles, analizando las diferencias entre sexos y clases de edad y las relaciones entre supervivencia y variables ambientales. Las estimas de supervivencia muestran una variación a la baja en adultos entre el 90-93 (Phi= 0.7) y el 94-02 (Phi= 0.5). La correspondiente a jóvenes ha oscilado alrededor del 30%. La supervivencia no difiere entre sexos. Las variables climáticas no parecen ser las responsables del cambio en la supervivencia. Sí que es muy probable que la supervivencia sea la causante del declive poblacional que ha sufrido la especie en el P.N. / This research has focused on five aspects of the biology and ecology of Moustached Warblers (Acrocephalus melanopogon) in the Cabanes-Torreblanca Natural Park. First, with respect to populaton abuaaandance, average density of this species during breeding season was 1.9 birds/ha. Average densities for other species of the community were: Reed Warbler (A. scirpaceus) 0.17 birds/ha, Great Reed Warbler (A. arundinaceus) 0.39 birds/ha, Savi's Warbler (Locustella luscinioides) 0.39 birds/ha and Fan-tailed Warbler (Cisticola juncidis) 0.28 birds/ha. A comparison of the composition and structure of passerine communities of several mediterranean wetlands (Delta del Ebro, Prat de Cabanes-Torrebloanca, Albufera de Valencia, Fondó d'Elx y S'Albufera de Mallorca) has shown that the community of Prat is the most singular and stable, owing to the high density of A. melanopogon associated with low densities of the migrant A. scirpaceus. The monitoring of the population trend of A. melanopogon shows a decline of density between the period before and after the drought of the years 1994-95. Breeding density decreased form 4 birds/ha to 2 birds/ha while winter density decreased from 3 to 1 birds/ha. The species is present in the study area duirng the whole year. Its density increases in march and reaches a maximum early in summer, but decreases until a minimum by the end of this season. Density increases again in autumn and decreases in mid winter. The analysis of ringing recoveries has shown important differences between the four european populations with enough data available (lake Neusiedler, Camargue, Prat, S'Albufera). The population of Prat makes movementes in two opposite directions (NE and SW). Youngs of this population diseperse from may to july while adults disperse between july and september. Native birds of the Prat are recaptured in other wetlands mainly between july and november, but may remain there even until february and march. There are no differences between young and adults in the temporal distribution of captures in these wetlands. The biometrical analysis identified differences between males and females in most paremeters studied. Moreover, wing length and weight increase with age. It has been possible to develop a logistic regression model, based in the lenght of primaries 2, 3, 8 and 9, that allows the classification of most wintering individuals as being native of the Prat or coming from the french population. This model has been used to study the winter phenology of both populations. Finally, the capture-recapture data have been used to estimate apparent survival (). This parameter has decreased along the study years, form values of about 0.7 in the period 1990-93 to values of 0.5 in 1994-2002. Survival of youngs has oscillated around 0.3. The climatic variables analyzed seem to be not related to survival fluctuations, but it is probable that this decrease of survival be one of the causes of the population decrease.

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Made available in DSpace on 2015-03-05T16:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 30 / Bolsa para curso e programa de Pós Graduação / As planárias terrestres formam um grupo relativamente numeroso em espécies (cerca de 800 espécies) com distribuição mundial, principalmente pan-tropical. Muitas espécies de planárias terrestres são especialistas de hábitat e, em geral, apresentam capacidade de locomoção reduzida, havendo assim, muitas espécies endêmicas. Sua utilização em estudos de diversidade, visando determinar áreas prioritárias para conservação, é indicada por serem predadores de topo de cadeia alimentar no seu microhábitat. No Brasil, um grande número de espécies de planárias terrestres foi registrado em áreas originalmente cobertas por floresta ombrófila densa localizadas nos estados de Santa Catarina, São Paulo e Rio de Janeiro. Estudos recentes da composição e da estrutura de comunidades de Terricola, realizados no Rio Grande do Sul, têm se concentrado na região do Planalto das Araucárias, no nordeste do estado, em áreas de floresta ombrófila, registrando um elevado número de espécies de planárias terrestres em diferentes localidades / Land flatworms constitute a relatively species rich zoological group, being distributed world wide, but mainly pan-tropical. They show very strict habitat requirements and a reduced locomotion capacity, so that there are many endemic species. Their use as indicator-taxa in conservation and biodiversity studies is recomended because land planarians are top-predatores within their soil ecosystem. In Brazil, the diversity of land planarians is better known in areas that were originally covered by the southeastern dense ombrophilous forest, located in the states of São Paulo, Rio de Janeiro e Santa Catarina. Recent studies on the composition and structure of land planarian communities, mainly done in the region of the Planalto das Araucárias, located at the northeast of Rio Grande do Sul state, in areas of mixed and dense ombrophilous forest, have registered high species richness in various localities, many of the species being new taxa and/or endemic for each type of forest. The caducifolious forest is one of th

Made available in DSpace on 2015-03-05T16:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A influência de fatores ecológicos na ocorrência de planárias terrestres é pouco conhecida. Estudos da estrutura de comunidades de planárias demonstram que estes organismos realizam seleção de habitat, apresentando baixa diversidade em habitats perturbados. O presente estudo objetiva testar se a ocorrência de planárias terrestres é influenciada por características do microhabitat, tais como características estruturais do ambiente, características edáficas e disponibilidade de presas. O estudo foi desenvolvido em duas áreas de Floresta Ombrófila Mista, na Floresta Nacional de São Francisco de Paula (FLONA-SFP), no Sul do Brasil. Em cada área, foi demarcada uma extensão de meio hectare, subdividido em quadrantes de 10m2. Em 100 parcelas distribuídas aleatoriamente, foram registradas a ocorrência e abundância de tricladidos, além de variáveis ecológicas. Foram analisadas seis características estruturais do ambiente (número de rochas, número e tamanho dos troncos e galhos caídos, altura do folhiço, densidade de a / In general, the influence of ecological factors on the occurrence of land planarians is poorly known. Studies on flatworm community structure verified that these organisms show habitat selection, exhibiting low diversity in disturbed habitats. The aim of this study is to test if the occurrence of land planarians are influenced by microhabitat traits, such as habitat structural traits, soil features and prey availability. The study was developed in two Araucaria Forest areas in the São Francisco de Paula National Forest (FLONA-SFP), southern Brazil. In each area, a grid of 0.5 hectares, subdivided in 10m2 plots, was established. In 100 randomly selected plots, the occurrence and abundance of each land planarian species were recorded. For each plot, we also recorded information on six habitat structural traits (number of stones, number and size of fallen trunks, shrub density, litter height, canopy openness), 21 soils features (physical and chemical variables), and 15 prey availability traits (total abundance o

Made available in DSpace on 2015-03-05T16:19:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 26 / Nenhuma / Os ecossistemas aquáticos sofrem grandes pressões das populações humanas. Agricultura, industrialização e crescimento descontrolado estão entre as principais causas da destruição dos recursos hídricos nos dias de hoje, sendo necessário o seu monitoramento para futuros projetos de recuperação e restauração. O principal objetivo desta dissertação foi avaliar a qualidade das águas de nove arroios da bacia hidrográfica do Rio dos Sinos (Rio Grande do Sul, Brasil), com três pontos de coleta por arroio, utilizando a comunidade de macroinvertebrados bentônicos como indicadores biológicos, através de índices bióticos. Os arroios foram previamente estudados pelo Projeto Monalisa que, em 2006, avaliou diferentes tipos de impactos ambientais. Os macroinvertebrados foram coletados através de varreduras no sedimento e na coluna d’água utilizando um “puçá aquático”, tentando atingir um mínimo de 100 indivíduos. Nos locais de coleta de macroinvertebrados foram registradas variáveis físicas e químicas da água. A qualidade g / Aquatic ecosystems suffer great pressures from human populations. Agriculture, industrialization and uncontrolled growth are among the today´s main causes of destruction of the water resources, being the monitoring needed for future projects of rehabilitation and restoration. The main objective of this dissertation was to evaluate the water quality of nine streams of the Sinos River basin (Rio Grande do Sul State, Brazil), with three sampling sites per stream, using the community of benthic macroinvertebrates as biological indicators, using biotic indices. The streams were previously studied by Monalisa Project which, in 2006, examined different types of environmental impacts. The macroinvertebrates were collected by sweeps in the sediment and the water column using a "frame dip-net," trying to achieve a minimum of 100 individuals. In the macroinvertebrates collection sites were recorded physical and chemical variables on water. The overall quality of the basin’s waters ranged from “Excellent” to “Poor”, redu

El presente trabajo se centra en el estudio comparativo de distintos aspectos de la respuesta frente a la exposición tóxica de cadmio de diferentes poblaciones de Artemia pertenecientes a las especies Artemia parthenogenetica, Artemia salina, Artemia franciscana y Artemia persimilis. La primera parte de este estudio, pone de manifiesto la variabilidad fenotípica de la respuesta letal a la exposición a cadmio que presentan los nauplios. En este sentido, la utilización de Modelos Lineales Generalizados ha sido de gran utilidad ya que ha permitido poner de manifiesto, a través de los parámetros que definen cada curva de mortalidad, diferencias en sensibilidad al tóxico y en la uniformidad de respuesta entre las distintas poblaciones de Artemia estudiadas. Además ha permitido conocer la influencia de factores genéticos (especie, nivel de ploidía), ambientales (población) así como el modo de reproducción (bisexual y partenogenética) en la sensibilidad al cadmio, destacando entre las demás poblaciones la alta tolerancia de las poblaciones pertenecientes a A. persimilis (A) y A. parthenogenetica (de la laguna de Pétrola) (P). La segunda parte, aborda el estudio comparado del proceso de acumulación de cadmio en individuos adultos de las diferentes poblaciones. Estos procesos han sido cuantificados aplicando un modelo toxicocinético con cinética de primer orden basado en un sistema de dos compartimentos, con el que se han conseguido ajustes relativamente buenos, teniendo en cuenta la complejidad de los procesos implicados. Hemos encontrado un comportamiento cadmio-regulador en Artemia, una eliminación relativamente rápida del metal, y un patrón de acumulación de cadmio bastante conservado en el género, siendo A. persimilis la única población que presenta un modelo diferente a las demás, caracterizado por una menor constante de acumulación y factor de bioconcentración (BCF). Por último en la tercera parte se analizó la presencia de metalotioneína (MT) en individuos adultos de Artemia y su incremento ante la exposición a cadmio, estudiando la influencia de la población y el sexo. Los mayores niveles de MT basal se encontraron en hembras de A. persimilis, que junto con las hembras de A. franciscana procedentes de San Francisco (SF) alcanzaron los mayores niveles de MT tras la exposición al metal. Las hembras de la población de A. salina procedentes de la laguna de La Mata (LMT(B)) fueron las que presentaron una mayor relación molar MT/Cd. La influencia del sexo fue muy coherente en todas las poblaciones estudiadas, siendo las hembras las que mayores contenido de cadmio y niveles de MT alcanzaron tras el tratamiento con metal. Estos resultado considerados en su conjunto demuestran una alta variabilidad fenotípica inter. e intraespecífica y de ahí la importancia de conservar la biodiversidad dentro del género que se ha visto disminuida en los últimos años por la inoculación artificial de especies alóctonas en lagunas que poseen poblaciones naturales y por el cambio climático que ha modificado la dinámica poblacional en salinas de interés comercial. / The aims of this work are to compare the response of the different species and populations in terms of cadmium sensitivity of nauplii, cadmium accumulation and elimination in adults and the basal content of metallothionein (MT) and the induction after cadmium exposure. The statistical procedure (Generalized Linear Models) used to assess the differences in cadmium tolerance of nauplii among populations has shown to be especially useful for this purpose. The results reveal besides a genetic basis for the different susceptibility to cadmium, that there are other factors such as reproductive mode, ploidy and habitat particularities that may account for the response of each of the populations. A first order bicompartimental toxicocinetic model was used in order to assess cadmium accumulation. We have found Artemia to be a cadmium-regulator organism. The consistency in the kinetic accumulation model indicates a well-conserved cadmium accumulation mechanism among studied species and populations. Artemia persimilis was the only one to show a statistically different model, which presents a lower cadmium accumulation rate and bioconcentration factor. Finally, the metallothionein content in adult individuals of Artemia showed a significant effect of cadmium exposure, sex and population origin. For all the studied populations females presented higher molar MT/Cd ratio. The conservation of all existing species and populations of Artemia will help maintain variability in the genus, which includes a broad spectrum of cadmium tolerance responses.

El cáncer de mama es el tumor más frecuente en la mujer occidental y su incidencia ha aumentado desde hace unos 50 años. Se ha descrito, que tanto el sistema fibrinolítico como el sistema de las metaloproteasas (MMPs) juegan un importante papel en la enfermedad neoplásica, participando, fundamentalmente, en la degradación de la matriz extracelular (MEC), proceso que es requerido para que tenga lugar la invasión, la migración y la metástasis tumoral.El sistema fibrinolítico tiene como base la activación del plasminógeno a plasmina, enzima que participa en múltiples procesos biológicos y patológicos. Esta transformación es llevada a cabo, entre otros, por la acción proteolítica del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA). Su principal inhibidor es el inhibidor del activador del plasminógeno de tipo 1 (PAI-1), pero también puede ser inhibido por el inhibidor tipo 3 (PAI-3).El sistema de las MMPs está formado por un conjunto de encimas zinc dependientes, que colectivamente son capaces de degradar la mayoría de los componentes de la MEC. En el presente estudio, se analizó la MMP-3 y su principal inhibidor el TIMP-1.En este trabajo se han cuantificado los niveles antigénicos y funcionales de estos componentes en tejido de cáncer de mama. Además, se ha puesto a punto la técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real, para cuantificar los niveles de mRNA de uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 y TIMP-1. Por otro lado, se determinó la localización antigénica de uPA, PAI-1 y PAI-3 en tejido de cáncer de mama, mediante la técnica de inmunohistoquimia y la localización del mRNA de uPA y PAI-1 mediante la técnica de hibridación in situ.Los resultados obtenidos indican que la técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real es altamente sensible, reproducible y específica para la cuantificación del mRNA uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 y TIMP-1.Por otro lado, se obtuvo que los niveles antigénicos y de mRNA de uPA, PAI-1 y TIMP-1 los niveles funcionales de uPA, aumentaron significativamente con la gravedad del tumor y, también, estaban significativamente aumentados en tejido de pacientes con afectación ganglionar con respecto a pacientes sin afectación. Sin embargo, ni los niveles de PAI-3 ni los de la MMP-3, variaron significativamente entre estos grupos.Cuando se analizó el papel de estos componentes en la recaída se observó que los niveles antigénicos de PAI-1 y MMP-3, estaban significativamente aumentados en pacientes con recaída. Sin embargo, los niveles antigénicos de PAI-3, estaban significativamente aumentados en pacientes libre de enfermedad.En cuanto a la localización antigénica, se observó que la proteína de uPA se expresa con mayor intensidad en las células del estroma que en las cancerosas. La proteína de PAI-1 se localiza fundamentalmente en las células cancerosas y en las endoteliales, siendo su señal de menor intensidad en las células del estroma. Mientras que el PAI-3, se encuentra exclusivamente, en las células del estroma que rodean a las tumorales. Por otro lado, la síntesis de mRNA de uPA y PAI-1 se localizó, fundamentalmente, en las células del estroma que rodean a las cancerosas. Lo que sugiere que el uPA y PAI-1 son sintetizados, principalmente, por las células del estroma y, posteriormente, son captadas por las células cancerosas.En la presente tesis, se ha descrito, por primera vez, que el PAI-3 es expresado en tejido de cáncer de mama. Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren que el uPA, PAI-1, MMP-3 y TIMP-1 favorecerían los procesos de invasión y metástasis en el cáncer de mama. Sin embargo, el PAI-3 podría inhibir estos procesos. / The plasminogen activation system and matrix metalloproteinases (MMPs) play a key role in the degradation of basement membrane and extracellular matrix in tissue remodeling, cancer cell invasion and metastasis.It is generally believed that uPA initiates a proteinase cascade at the cell surface that contributes to tumor invasion, metastasis and angiogenesis. uPA is inhibited by plasminogen activator inhibitor type-1 (PAI-1) and it can also be inhibited by PAI type-3 (PAI-3). On the other hand, MMPs are involved in several pathological processes, including tumor invasion, in which degradation of the extracellular matrix is a key event. MMP-3 is a stromelysin implicated in invasion and metastasis processes. MMP-3 activity is regulated by tissue inhibitors of metalloproteinases type-1 (TIMP-1). The quantitative real-time RT-PCR technique allowed us to obtain a highly sensitive, specific, and reproducible mRNAs quantification of uPA, PAI-1, PAI-3, MMP-3 and TIMP-1. PAI-1, uPA and TIMP-1 mRNA and antigen levels and PAI-1 and uPA functional levels increased with tumor severity, and in node-positive patients than those who were node-negative. However, no significant variations were observed for PAI-3 and MMP-3 for all the groups studied.PAI-3 antigen levels were significantly higher in early relapse-free patients than in patients who suffered a relapse. However, PAI-1 and MMP-3 antigen levels were significantly higher in patients who suffered an early relapse than in those who did not .uPA immunoreactivity was localized mainly in stromal and endothelial cells and with lower intensity in cancer cells. PAI-1 immunostaining was stronger in cancer cells and in endothelial cells, than in stromal cells surrounding cancer cells. PAI-3 antigen was localized in the stromal cells surrounding nested cancer cells, but it was not observed in cancer cells or in endothelial cells.uPA and PAI-1 mRNA was localized mainly in stromal cells, indicating that uPA and PAI-1 are mainly synthesized by stromal cells, secreted and captured by cancer cells.We have found, for the first time, that PAI-3 is expressed in breast cancer tissue. Our data indicated that uPA, PAI-1, MMP-3 and TIMP-1 are implicated in invasion and metastasis in breast cancer. However, PAI-3 seems to inhibit these processes.

La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la asimilación fotosintética de carbono a través del ciclo de Calvin y es, por tanto, la principal vía de entrada del CO2 de la atmósfera en la biosfera. La estructura del enzima en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa, de codificación cloroplástica) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa, de codificación nuclear). La Rubisco desempeña una importante función no catalítica como reserva de nitrógeno, azufre y carbono, al degradarse de forma rápida y selectiva en condiciones de senescencia natural o inducida por estrés. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Con estos antecedentes, en la presente tesis se ha profundizado en el conocimiento de los mecanismos que regulan la actividad y la disponibilidad proteolítica de la Rubisco a través del estado de oxidación de residuos de cisteína del propio enzima. Dentro de este tema, se estudiaron los siguientes aspectos concretos:1. Patrón diferencial de proteolisis de Rubisco reducida y oxidada.La utilización de proteasas de baja especificidad de secuencia como sondas estructurales reveló que la accesibilidad del sitio de corte tras la Lys 18 de la subunidad grande de la Rubisco de diferentes especies no depende del estado redox del enzima. Por otro lado, la oxidación de las cisteínas conservadas de Rubisco induce un cambio conformacional progresivo que favorece la exposición del lazo Ser61-Thr68 de la subunidad grande a la acción de proteasas exógenas. El corte proteolítico en este lazo, situado en la interfase entre las dos subunidades grandes que componen cada uno de los dímeros del holoenzima, promueve el desensamblaje y la digestión completa (no restringida) del enzima.La proteolisis de la Rubisco por subtilisina puede modelizarse mediante un sistema de tres ecuaciones diferenciales acopladas, que incluye cuatro constantes cinéticas de primer orden: k1, para el procesamiento tras la Lys 18, k2, para el corte en el lazo Ser61-Thr68 de una subunidad grande intacta, k2´, para el corte en el mismo lazo de una subunidad grande previamente procesada tras la Lys 18 y k3, para el desensamblaje y la consecuente proteolisis no restringida. El modelo describe correctamente la cinética de proteolisis y puede utilizarse como herramienta para detectar cambios conformacionales y comportamientos anómalos en enzimas mutantes.2. Obtención de mutantes de Rubisco por sustitución de residuos conservados de cisteína.Los procedimientos de transformación cloroplástica y nuclear de C. reinhardtii han permitido la obtención de mutantes fotosintéticamente activos de cisteínas conservadas de la subunidad grande (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S y C449S/C459S) y de la subunidad pequeña (C41S, C83S) de la Rubisco. La futura caracterización de estos mutantes puede ayudar a desvelar el papel concreto que cada uno de estos residuos pueda desempeñar en el control redox del enzima.3. Estudio del papel del par Cys 449-459 en la modulación redox de la Rubisco.De entre los mutantes obtenidos, se escogieron los correspondientes a los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco para una caracterización más detallada. El residuo de cisteína 459, con un alto grado de conservación entre las secuencias de plantas superiores, algas verdes y cianobacterias, se encuentra en C. reinhardtii a una distancia de la cisteína 449 compatible con la formación de un puente disulfuro. La sustitución de los residuos de cisteína 449 y 459 no provoca cambios apreciables en el centro activo del enzima en estado reducido aunque supone una ligera desestabilización de la estructura nativa, percibible sólo a temperaturas muy superiores a la fisiológica. Los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco son necesarios para inactivar completamente el enzima a potenciales redox elevados y favorecen de forma redundante la exposición del lazo Ser61-Thr68 a la acción de proteasas exógenas in vitro en condiciones oxidantes.Las cisteínas 449 y 459 tienen un papel aparentemente redundante de forma que su relevancia funcional sólo se pone de manifiesto in vivo al sustituir ambos residuos. Así, el doble mutante, a diferencia de los mutantes simples, presenta un mayor contenido de Rubisco, proteínas totales y pigmentos fotosintéticos por célula durante la fase estacionaria de crecimiento. El estrés salino se ha descrito como un desencadenante de estrés oxidativo en el interior del cloroplasto, y se escogió como modelo para el estudio del papel redox de las cisteínas 449 y 459 in vivo, en condiciones que inducen la degradación de Rubisco. La sustitución simultánea de los residuos de cisteína 449 y 459 intensifica la degradación de Rubisco y los procesos de inactivación, polimerización en agregados de alto peso molecular y asociación de la proteína con las membranas, relacionados con el catabolismo del enzima. Se presenta una discusión sobre los posibles mecanismos por los cuales las cisteínas 449 y 459 pueden estar implicadas en estos procesos in vivo, en base a los datos bibliográficos de los que se dispone hasta el momento. / In the present work, it has been intended to further characterize the mechanisms that regulate the activity and the proteolytic availability of Rubisco through the redox state of its cysteine residues. The following aspects were studied:1. Differential proteolytic pattern upon Rubisco oxidation.The oxidation of conserved cysteine residues induces a progressive conformational change that favours the exposure of the Ser61-Thr68 loop of the large subunit to exogenous proteases. A proteolytic cut in this loop promotes disassembly and the complete digestion of the enzyme. A mathemathical model with three coupled differential equations is proposed. This model fits properly the observed kinetics of proteolytic fragmentation and can be used as a tool to detect conformational changes in mutant enzymes. 2. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii. In order to test the contribution of each of the conserved cysteines to redox regulation, photosynthetically active Rubisco mutants corresponding to large subunit (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S, C449S/C459S) and small subunit (C41S, C83S) conserved cysteines residues were obtained.3. Study of the role of the Cys449-459 pair in Rubisco redox modulation through analyis of the phenotype of the C449S, C459S and C449S/C459S mutants.Cysteine residues 449 and 459 of the large subunit are involved in full inactivation of the enzyme at strong oxidizing conditions, and favour the exposure of loop Ser61-Thr68 to in vitro proteolytic attack. Cysteines 449 and 459 have a redundant role in vivo, in such a way that their physiological role becomes evident only after substitution of both residues. The double mutant accumulates a higher biomass per cell and shows a more intense response to saline stress in processes (degradation, aggregation, association to membranes and inactivation) related to the catabolism of the enzyme.