Las poliaminas regulan procesos de crecimiento y diferenciación celular, y su desregulación está relacionada con diferentes patologías incluyendo el cáncer. Las antizimas (AZs) de ornitina descarboxilasa (ODC) inhiben tanto su biosíntesis, como su captación, regulando los niveles intracelulares de poliaminas. En esta tesis se ha caracterizado una nueva proteína inhibidora de antizimas (AZIN2) que posee alta homología con ODC y el inhibidor de antizimas previamente conocido (AZIN1). Esta nueva proteína está desprovista de actividad enzimática, pero es capaz de revertir la acción que las tres antizimas conocidas ejercen sobre la actividad ODC y la captación de poliaminas. A diferencia de sus proteínas homólogas, AZIN2 se localiza subcelularmente en el ERGIC, y se expresa específicamente en cerebro y testículo, pero de forma muy abundante en espermátidas y espermatozoides, al igual que AZ3, indicando que estas dos proteínas juegan un importante papel regulando los niveles de poliaminas durante la espermiogénesis. / Polyamines regulate cell growth and differentiation, and the alteration of their homeostasis is related to different diseases, including cancer. Ornithine decarboxylase (ODC) antizymes (AZs) regulate polyamine levels by inhibiting both their biosynthesis and the cellular uptake. In this work, a new ODC paralogue has been characterized as a novel antizyme inhibitor protein that has been named AZIN2. This protein lacks decarboxylating activity, but it is able to reverse the action of any of the three antizymes on ODC activity and polyamine uptake. Unlike its homologue proteins ODC and AZIN1, AZIN2 is located in the ERGIC, and it is specifically expressed in brain and testes. The abundant expression in spermatids and spermatozoa, concomitantly with AZ3, suggests that both proteins may play an important role in regulating polyamine levels during spermiogenesis

L’enginyeria metabòlica és una estratègia molt útil per produir molècules d’alt valor afegit mitjançant microorganismes. Molècules d’interès per la seva funció biològica, d’estructura complexa i amb dificultats en la seva obtenció i síntesi s’han obtingut de forma molt satisfactòria mitjançant aquesta metodologia. En el laboratori de Bioquímica de l’IQS s‘estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada pel gen mg517 i responsable de la síntesi de glicoglicerolípids (Andrés et al., 2010). S’ha vist que aquesta proteïna sobreexpressada en E.coli és funcional i acumula diferents glicoglicerolípids en la membrana plasmàtica. Aquests glicoglicerolípids mostren diferents punts d’interès. D’una banda, són tensioactius d’alt valor afegit que permeten la construcció de niosomes per l’alliberament controlat de fàrmacs i, d’altra banda, s’han relacionat com agents terapèutics amb inhibició de tumors cancerígens. Degut al creixent interès d’aquests productes,en el present treball s‘ha escollit E. coli com a microorganisme a modificar per enginyeria metabòlica per la producció de glicoglicerolípids, ja que per una banda, no presenta aquests lípids però sí sintetitza els seus precursors UDP-glucosa i diacilglicerol (DAG). S’han dissenyat diferents soques d’E.coli on se sobreexpressen la glicosiltransferasa MG517 i, a més, la uridiltransferasa GalU procedent d’E.coli JM109, que sintetitza el precursor UDP-glucosa a partir de glucosa 1-fosfat, i l’aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesi del precursor DAG. En les soques on les proteïnes GalU i PlsC s’han sobreexpressat, les seves activitats han augmentat 220 i 80 vegades, respectivament. La glicosiltransferasa MG517 és activa en totes les soques però, sorprenentment, la seva activitat després de les cinc hores d‘inducció és10 vegades inferior quan es dóna la coexpressió de MG517 i PlsC. S’observa que la sobreproducció de UDP-glucosa no incrementa la quantitat total de glicoglicerolípids mentre que el DAG sí, de manera que la soca AbC amb els gens mg517 i plsC és la que sintetitza més glicoglicerolípids, arribant a nivells de 1059 nM per biomassa. Dels tres glicoglicerolípids formats, el diglucosilacilglicerol és sempre el més abundant i el seu percentatge varia entre 57 i 82% en funció de la coexpressió dels enzims. La producció d’aquests nous lípids en la membrana d’E. coli implica que el percentatge del fosfolípid fosfatidiletanolamina disminueixi un 20%, mentre els fosfolípids anionis es mantenen constants. Es conclou que la soca modificada d’E. coli AbC és una bona plataforma per la producció de nous glicolípids amb diferent estructura. / La ingeniería metabólica es una estrategia muy útil para producir moléculas de valor añadido mediante microorganismos. Moléculas de interés por su función biológica, de estructura compleja y con dificultades en su obtención y síntesis se han obtenido de forma muy satisfactoria con el uso de esta metodología. En el laboratorio de Bioquímica del IQS se estudia la glicosiltransferasa de Micoplasma genitalium codificada por el gen mg517 y responsable de la síntesis de glicoglicerolípidos (Andrés et al. 2011). Se ha observado que esta proteína sobreexpresada en E.coli es funcional y acumula estos lípidos en la membrana plasmática. Los glicoglicerolípidos muestran diferentes puntos de interés. Por una parte, son tensioactivos que permiten la construcción de niosomas para la liberación controlada de fármacos y, por otra parte, se han seleccionado como agentes terapéuticos con inhibición de tumores cancerígenos. Debido al creciente interés de estos productos, en el presente trabajo, se ha escogido E.coli como microorganismo a modificar por ingeniería metabólica para la producción de glicoglicerolípidos, ya que no presenta estos lípidos pero sí sintetiza sus precursores UDP-glucosa y diacilglicerol (DAG). Se han diseñado diferentes cepas de E.coli donde se sobreexpressa la glicosiltransferasa MG517 y, además, la uridiltransferasa GalU de E.coli JM109, que sintetiza el precursor UDP-glucosa, y la aciltransferasa PlsC involucrada en la biosíntesis del precursor DAG. En las cepas donde las proteínas GalU y PlsC se han sobreexpressado, sus actividades han aumentado 220 y 80 veces, respectivamente. La glicosiltransferasa MG517 es activa en todas las cepas pero, sorprendentemente, su actividad después de inducir es 10 veces inferior cuando se da la coexpresión de MG517 y PlsC. Se observa que la sobreproducción de UDP-glucosa no incrementa la cantidad total de glicoglicerolípidos mientras que el DAG sí, de forma que la cepa AbC con los genes mg517 y plsC es la que sintetiza más glicoglicerolípidos, llegando a niveles de 1059 nM por biomasa. De los tres glicoglicerolípidos formados, el diglucosildiacilglicerol es siempre el más abundante y su porcentaje varía entre 57 y 82% en función de la coexpressión de las enzimas. La producción de los nuevos lípidos en la membrana de E.coli implica que el porcentaje del fosfolípido fosfatidiletanolamina disminuya un 20%, mientras los fosfolípidos aniónicos se mantienen contantes. Se concluye que la cepa modificada de E.coli AbC es una buena plataforma para la producción de nuevos glicolípidos con distinta estructura. / Metabolic engineering is a useful strategy to achieve target molecules using microorganisms. Molecules of high biological value, with complex estructure and difficulties to be obtained and synthesised, as for example, glycoconjugates, have been successfully obtained by this methodology (Ruffing i Chen, 2010). Our group studies the Mycoplasma genitalium glycosyltransferase encoded by mg517 gene and responsible of glycoglycerolipid synthesis. (Andrés et al., 2010). This protein overexpressed in E. coli is functional and accumulates the glycolipids in its plasma membrane. These glycoglycerolipids have different points of interest. On one hand, they are biosurfactants and evencan form niosomes for drug delivery systems. On the other hand, they have been related to inhibition of cancer tumors. Due to growing interest of these products, and in order to improve production of glycoglycerolipids, different metabolic engineered E. coli strains have been designed in this work. This microorganism has been chosen since on the one hand, it does not produce these lipids but its metabolism produces the glicoglicerolipids precursors, UDP-glucose and diacylglycerol (DAG). In these strains, the glycosyltransferase is coexpressed with genes related to biosynthesis of both precursors. Therefore coexpression of the glycosyltransferase MG517, the uridyl transferase GalU from E. coli JM109, which synthesizes the precursor Glc-UDP from glucose-1-phosphate, and the acyl transferase PlsC involved in the biosynthesis of the precursor DAG have been studied. Once modified strains were constructed, their phenotype have been analysed. On one hand, the three enzymatic activities have been determined in vitro from the cell extracts. When GalU and PlsC were overexpressed, their activities increased 220 and 80-fold, respectively, compared to the controls. The glycosyltransferase MG517 was active in these modified strains but, surprisingly, its activity decreases 10-fold when MG517 and PlsC were coexpressed. It is observed that overproduction of UDP-glucose does not increase total glycolipids amount while DAG have a positive impact on this production, being strain with mg517 and plsC genes which produces more glycolipids achieving 1059 nM per biomass. . Furthermore, the modified strains showed different glycoglycerolipids profiles. In all strains the disaccharide glycoglycerolipid is the most abundant but its percentage varies from 57% to 82% depending on enzyme coexpression. Production of these new lipids in E. coli membrane implies less synthesis of phosphatidylethanolamine phospholipid, which is characteristic of this microorganism. Our results show the modified E. coli strain with mg517 and plsC genes is a good platform microorganism for the production of new glicolipids with different structure.

La proporción de sexos está distribuida de forma equilibrada en la mayor parte de las especies, y generalmente está determinada por el sexo heterogamético. En mamíferos, los ovocitos producidos por las hembras mantienen siempre la misma carga cromosómica sexual (cromosoma “X”), y son los machos, con una dotación cromosómica distinta en sus gametos (cromosomas “X” e “Y”) los que determinan el sexo. Durante la espermatogénesis se produce igual cantidad de gametos portadores del cromosoma “X” e “Y”, por lo que la probabilidad de tener una cría macho o una cría hembra por cada evento de fecundación en especies monotocas o politocas sería del 50%. Sin embargo, los datos obtenidos por los registros en muchas especies nos muestran que no siempre la proporción de los sexos es equilibrada al 50%. En la literatura se han descrito muchos factores que podrían tener influencia directa o indirecta en el desequilibrio de la proporción de sexos. A pesar de ello, hasta la fecha se desconocen con precisión los mecanismos por los cuales se produce este fenómeno. Objetivo: La presente tesis propone analizar distintos factores y posibles mecanismos que pueden estar relacionados con la proporción de sexos. Metodología: En nuestro estudio, utilizamos un modelo ratón transgénico que posee una secuencia marcadora integrada en el cromosoma “X”, y hemos analizado en primer lugar la posible distorsión primaria y secundaria del sexo debida a la presencia del transgén. Así como la calidad embrionaria medida en número de células del blastocisto. Analizamos el efecto de la dieta durante los periodos de pre-implantación y post-implantación, tomando en consideración la lateralidad (origen ovárico o uterino). Se estudiaron las relaciones que existen entre la ovariectomía y la compensación hormonal ovárica, la proporción del sexo y la posición adoptada en el útero por cada uno de los sexos. Se analizó si existía una relación entre la velocidad de desarrollo pre-implantacional (segunda división mitótica embrionaria y posterior desarrollo a blastocisto) y la calidad y el sexo de los embriones producidos in vivo. Resultados y Discusión: En el capítulo I. Se observó que esta modificación genética, no alteraba las proporciones primaria ni secundaria de sexos, ni el número celular de embriones pre-implantacionales, y debido a ello, consideramos el factor transgénico como no determinante en la proporción de los sexos. En el capítulo II se encontraron diferencias de proporción del sexo cuando se registraron los datos del lado de procedencia (derecho o izquierdo), principalmente en estadios cercanos al momento de la fecundación, y en ratonas de menor constitución física. Estas diferencias se correlacionan con la perdida embrionaria y dejan de ser significativas cuando se observaban estas proporciones de manera global. En el capítulo III, no se encontraron diferencias en las proporciones de machos y hembras entre las hemi-ovariectomías derecha e izquierda. Sin embargo los resultados muestran una preferencia de las hembras a implantar en secciones uterinas cercanas al cérvix, siendo estas hembras de un peso inferior al resto de hembras implantadas en otras secciones del útero. Por último, en el capítulo IV, nuestros resultados no indican una diferencia de la proporción del sexo en los embriones recuperados en el paso de 2 a 3 células, ni tampoco en la velocidad de desarrollo a blastocisto. Solamente se observó una mayor proporción de hembras en los embriones que más lentamente se dividían a 3 células y posteriormente tardaban más en llegar al estadio de blastocisto. También se observó una relación entre la calidad embrionaria definida por la expresión de marcadores de pluripotencia y la velocidad de división pre-implantacional. / Sex ratio is equally distributed in most species, and it is generally determined by the heterogametic sex. In mammals, oocytes produced by females always keep the same chromosomal sex (chromosome “X”); however, the males, with a different chromosome in their gametes (chromosomes “X” and “Y”)determine the sex. During spermatogenesis, equal number of gametes carrying the chromosome “X” and “Y” is produced. According to Mendelian’s genetic, the chance of breeding a male or a female pup per fertilization event in polytocous and monotocous species would be 50%. However, the data obtained in many species show that not always the sex ratio is balanced at 50%. In the literature, many factors that could have a direct or indirect influence on the imbalance of the sex ratio have been described. However, the precise mechanism by which this phenomenon occurs is still unknown. Objetive: This thesis aims to analyze various factors and possible mechanisms that may be related to the sex ratio. Methods: In our study, we used a transgenic mouse model that presents a marker sequence integrated in the “X” chromosome, and we first analyzed the possible primary and secondary sex distortion due to the presence of the transgene, as well as embryo quality measured by the number of cells of the blastocyst. We analyzed the effect of diet during pre-implantation and post-implantation periods, considering laterality (ovarian or uterine origin). The relationship between ovariectomy and ovarian hormonal balance, sex proportion and position in the uterus for each of the sexes were studied. We analyzed whether there was a relationship between the rate of preimplantation development (second mitotic division and subsequent embryo development to blastocyst) and the quality and sex of embryos produced in vivo. Results and discussion: In chapter I, It was noted that this genetic modification did not alter the sex ratio primary or secondary, or cell number of pre-implantation embryos, and because of this, we considered the transgenic factor as non-determinant in the sex ratio. In Chapter II, differences in sex ratio were found when the data of the source side (right or left) were recorded, mainly in stages near to the time of fertilization, and in mice with minor physical condition. These differences were correlated with embryonic loss and were not significantly different when these ratios were observed globally. In Chapter III, no differences in the proportions of males and females between the right and left hemi-ovariectomy were found. However, the results showed that females had a tendency to implant in sections close to uterine cervix, presenting a lower weight than those females implanted elsewhere in the uterus. Finally, in Chapter IV, our results do not show a difference in the sex ratio in embryos recovered in the 2 to 3-cells stage, nor on the rate of development to blastocyst. It was only observed a higher proportion of females in embryos that arrived to the 3-cell stage the slowest and subsequently took longer to reach the blastocyst stage. A relationship between the embryo quality defined by the expression of markers of pluripotency and by the preimplantation speed division was also observed.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina la presencia de alcaloides y flavonoides, así como caracterizar sus correspondientes estructuras; la extracción se lleva a cabo por el método de maceración en metanol, a partir de las hojas en polvo. El aislamiento es monitoreado mediante cromatografía en capa delgada de silicagel 60, paro lo cual el extracto metanólico se fracciona en una columna cromatografica de exclusión en Sephadex LH-20. La purificación de los alcaloides y flavonoides se realiza por cromatografía líquida de alta performance (HPLC). / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el efecto protector y antioxidante de la maca en el aparato reproductor de ratas macho diabéticas. Para ello analiza la capacidad antioxidante in vitro del extracto acuoso de la maca negra, determina el efecto hipoglicemiante del extracto acuoso de maca negra, valora los efectos antioxidantes del consumo oral del extrato acuoso de maca en el testículo y el epidídimo de ratas inducidas a diabetes, y examina el efecto protector del consumo del extracto acuoso de maca negra en la histoarquitectura del testículo y a nivel de fragmentación de ADN en espermatozoides de epidídimo de ratas diabéticas. / Tesis

Evalúa la respuesta inmune en cerdos, tras la administración de la vacuna recombinante desarrollada con el antígeno Tsol18 expresado en el virus de Newcastle (VNC). Para lo cual se usa 15 cerdos, divididos en 3 grupos de vacunación con 5 individuos cada uno: el grupo I por vía ocular, el grupo II por vía nasal y el grupo III (control), solo recibe suero fisiológico. Los tres grupos son vacunados en la semana 0, 1, 5 y 6. Los cerdos son sangrados cada semana por 8 semanas, para la obtención del suero. Los anticuerpos contra el Virus de Newcastle, son obtenidos mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI). El ELISA indirecto estandarizado con el antígeno Tsol18, permite monitorear la presencia de anticuerpos circulantes contra la proteína Tso18 en cerdos inmunizados por vía oral y nasal. Todas las muestras resultan positivas a HI para VNC. Se concluye que no existe diferencia estadística entre la vía de inoculación y los títulos de anticuerpos producidos en los grupos de estudio. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Indica que el Perú cuenta con una gran biodiversidad de recursos naturales, en el ámbito marítimo existe una importante cantidad de productos hidrobiológicos, cada año muchos de ellos son utilizados por la industria alimentaria para formular productos de consumo humano. Uno de estos recursos es el pepino de mar, (Patallus mollis). En la actualidad, los polisacáridos comerciales son obtenidos del reino vegetal, sin embargo en investigaciones recientes la fauna marina representaría una nueva fuente, que puede ser utilizado para la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica. Además, para la formación de películas comestibles. Por otro lado, el obtener polisacáridos con propiedades bioactivas a partir de esta especie le dará un valor agregado Los compuestos bioactivos son capaces de contrarrestar el daño celular y la formación de radicales libres y pueden ser consumidos como formulados alimenticios o productos nutraceúticos que son beneficiosos para la salud, es decir que posean actividad antioxidante. Se ha reportado que algunos polisacáridos provenientes de especies de pepino de mar tienen un buen perfil antioxidante. Se ha descrito que estos polisacáridos no solo poseen una sola actividad, sino también otras actividades que le dan una mayor importancia comparado con otros organismos que se encuentran en el mar. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el efecto antiinflamatorio y diurético del extracto etanólico, de la corteza de Tabebuia impetiginosa (Mart. Ex DC) Standley “Guayacán”, en un modelo in vivo de ratas. Se utilizan 72 ratas, divididos aleatoriamente en 12 grupos. Se prepara el extracto a diferentes a dosis de 50, 250 y 500 mg/Kg; ibuprofeno 20 mg/Kg; dexametazona 20 mg/Kg; furosemida de 20 mg/kg; hidroclorotiazida 20mg/kg. Se administran los extractos por vía oral. Se provoca inflamación a media hora, de administrar soluciones extractos. Inyectando 0,2 mL solución acuosa de λ-Carragenina al 1% en patas derecha de ratas. Siguiendo el modelo Arroyo et al, 2012. Grupo I: suero fisiológico al 0,9% (2mL/kg), grupo II: hidroclorotiazida (20mg/kg), grupo III: furosemida (20 mg/kg), los grupos IV, V, y VI: extracto etanólico de Tabebuia impetiginosa a dosis de 50, 250, 500 mg/kg, respectivamente. Las ratas son colocadas en jaulas metabólicas individuales para recolectar la orina (24h) y cuantificar electrolitos excretados (Na+, K+ y Cl-). / Tesis

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Evalúa la actividad antioxidante del té verde nacional in vitro e in vivo como prototipo de extracto rico en catequinas para el análisis de diez potenciales cultivos con actividad antioxidante que crecen en clima tropical húmedo del Perú. Las muestras procedieron de los departamentos de Cusco y Huánuco. El extracto acuoso de té verde se preparó por infusión al 0.5%. La capacidad antioxidante in vitro se determinó mediante las técnicas de ABTS, FRAP, fenoles totales (FT) y flavonoides (CF). Para la capacidad antioxidante in vivo, se usó un modelo de inducción de estrés oxidativo con Cu+2 en pez cebra (Danio rerio). Se midieron lipoperoxidación (TBARS), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT). Los extractos acuosos de las 10 plantas fueron preparados al 1%. La capacidad antioxidante in vitro fue analizada además de las técnicas usadas para el té verde, la quelación del ión ferroso (QIF) y la descomposición de H2O2. Además, se obtuvo un espectrograma de los 11 extractos usando como referencia a la catequina. Los resultados del té verde demostraron capacidad antioxidante, TEAC con un valor de 13,4 + 0,8 mg/g, FRAP 1310+50 µmol/g, contenido de FT 964, +54,7 µmol EAG/g y CF de 160,7+38,0 µmol ECQ/g. La capacidad antioxidante in vivo mostró efectos positivos sobre el estrés oxidativo, disminuyó significativamente (p<0,05) las TBARS frente a la inducción con cobre, 60,3+13,9 µmol/g tejido frente a 100,8+11,9 µmol/g tejido. También se observó recuperación significativa (p<0,05) en la actividad de la SOD y de la CAT. Respecto a los extractos acuosos de las diez plantas, la mayor capacidad antioxidante fue exhibida por las hojas de mango, en ambos, TEAC y FRAP, también en contenido de FT (p<0,05), seguido del cacao proveniente de Tingo María. Sin embargo, el CF en equivalente a catequina fue mayor significativamente (p<0,05) en las hojas de cacao. La QIF fue mayor significativamente (p<0,05) en el extracto de ishanga seguido de las hojas de cacao de Tingo María, pero en la descomposición de H2O2 fueron las hojas de cacao las que mostraron una mayor potencialidad. En conclusión, el té verde nacional tiene capacidad antioxidante in vitro e in vivo y sirve de prototipo como fuente de catequinas. Sobre los 10 extractos analizados, es la hoja de cacao la que mejor expresa su contenido de catequinas con capacidad antioxidante, pero es la hoja de mango la que tiene el mayor contenido de FT y la mayor actividad antioxidante in vitro. / Instituto Nacional de Innovación Agraria (Perú). Programa Nacional de Innovación Agraria / Tesis