The current treatment strategies for diseases are assessed on the basis of diagnosed phenotypic changes due to an accumulation of asymptomatic events in physiological processes. Since a diagnosis can only be established at advanced stages of the disease, mainly due to insufficient early detection possibilities of physiological disorders, doctors are forced to treat diseases rather than prevent them. Therefore, it is desirable to link future therapeutic interventions to the early detection of physiological changes. So-called sensor-effector systems are designed to recognise disease-specific biomarkers and coordinate the production and delivery of therapeutic factors in an autonomous and automated manner. Such approaches and their development are being researched and promoted by the discipline of synthetic biology, among others. Against this background, this paper focuses on the in vitro design of cytokine-neutralizing sensor-effector cells designed for the potential treatment of recurrent autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis. The precise control of inducible gene expression was successfully generated in human cells. At first, a NF-κB-dependent promoter was developed, based on HIV-1 derived DNA-binding motives. The activation of this triggerable promoter was investigated using several inducers including the physiologically important NF-κB inducers tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 beta (IL-1β). The activation strength of the NF-κB-triggered promoter was doubled by integrating a non-coding RNA. The latter combined expressed RNA structures, which mimic DNA by double stranded RNAs and have been demonstrated to bind to p50 or p65 by previous publications. The sensitivity was investigated for TNFα and IL-1β. The detection limit and the EC50 values were in in the lower picomolar range. Besides the sensitivity, the reversibility and dynamic of the inducible system were characterized. Hereby a close correlation between pulse times and expression profile was shown. The optimized NF-κB-dependent promoter was then coupled to established TNFα- and IL-1-blocking biologicals to develop sensor-effector systems with anti-inflammatory activity, and thus potential use against autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. The biologicals were differentiated between ligand-blocking and receptor-blocking biologicals and different variants were selected: Adalimumab, etanercept and anakinra. The non-coding RNA improved again the activation strength of NF-κB-dependent expressed biologicals, indicating its universal benefit. Furthermore, it was shown that the TNFα-induced expression of NF-κB-regulated TNFα-blocking biologics led to an extracellular negative feedback loop. Interestingly, the integration of the non-coding RNA and this negative feedback loop has increased the dynamics and reversibility of the NF-κB-regulated gene expression. The controllability of drug release can also be extended by the use of inhibitors of classical NF-κB signalling such as TPCA-1. The efficacy of the expressed biologicals was detected through neutralization of the cytokines using different experiments. For future in vivo trials, first alginate encapsulations of the cells were performed. Furthermore, the activation of NF-κB-dependent promoter was demonstrated using co-cultures with human plasma samples or using synovial liquids. With this generated sensor-effector system we have developed self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system for anit-inflammatory biologics. / Die derzeitig üblichen Behandlungsstrategien von Krankheiten werden auf Basis diagnostizierter phänotypischer Veränderungen erhoben, die auf eine Ansammlung asymptomatischer Ereignisse in physiologischen Vorgängen zurückzuführen sind. Da die Feststellung einer Diagnose bislang erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien, vor allem aufgrund unzureichender Früherkennungsmöglichkeiten von physiologischen Störungen, erfolgen kann, sehen sich Ärzte gezwungen, Krankheiten vornehmlich zu behandeln anstatt ihnen vorzubeugen. Daher ist es erstrebenswert, wenn zukünftige therapeutische Interventionen bereits an die Früherkennung von physiologischen Veränderungen gekoppelt werden könnten. Sogenannte Sensor-Effektor Systeme sollen krankheitsspezifische Biomarker erkennen und die Produktion und Bereitstellung von therapeutischen Faktoren in einer selbstständigen und automatisierten Art und Weise koordinieren. Solche Ansätze und deren Entwicklung werden unter anderem durch die Disziplin der synthetischen Biologie erforscht und vorangetrieben. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich vor diesem Hintergrund auf das in vitro Design von Zytokin-neutralisierenden Sensor-Effektor Zellen, die für die potentielle Behandlung wiederkehrender Autoimmunerkrankungen, insbesondere der rheumatoiden Arthritis, konstruiert wurden. Die gezielte Ansteuerung zur induzierbaren Genexpression konnte in humanen Zellen erfolgreich generiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein NF-κB abhängiger Promoter zur induzierbaren Genexpression auf der Grundlage von HIV-1 abgleitenden DNA-Bindemotiven entwickelt. Die Aktivierbarkeit dieses Promoters wurde durch verschiedene Induktoren, insbesondere auch durch die physiologisch wichtigen NF-κB Aktivatoren Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interleukin 1 beta (IL-1β) überprüft. Die Aktivierungsstärke des NF-κB abhängigen Promoters wurde durch die Integration einer nicht-kodierenden RNA verdoppelt. Diese RNA kombiniert Strukturelemente, die im RNA-Doppelstrang DNA-Strukturen imitieren, und für die in Vorarbeiten die Bindung an p50 oder p65 nachgewiesen werden konnten. Für TNFα und IL-1β lagen das Detektionslimit und die EC50 Werte der NF-κB getriggerten Genexpression im unteren pikomolaren Bereich. Neben der Sensitivität wurde das induzierbare System bezüglich seiner Reversibilität und Dynamik charakterisiert. Dabei konnte eine enge Korrelation zwischen Pulszeiten und Expressionsmustern aufgezeigt werden. Ferner wurde der NF-κB abhängige Promoter an etablierte TNFα- und IL-1-blockierende Biologicals gekoppelt, um Sensor-Effektor Systeme mit anti-entzündlicher Aktivität zu erhalten, die potentiell zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, eingesetzt werden könnten. Bei den Biologicals wurde zwischen Ligand-blockierenden und Rezeptor-blockierenden Biologicals differenziert und unterschiedliche Varianten ausgewählt: Adalimumab, Etanercept und Anakinra. Erneut verbesserte die zusätzliche Integration der nicht-kodierenden RNA die Aktivierungsstärke der NF-κB abhängig exprimierten Biologicals, das die universelle Nutzbarkeit des hier entwickelten optimierten NF-κB-Promoters unterstreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die TNFα-induzierte Expression von NF-κB-regulierten TNFα-blockierenden Biologika zu einem extrazellulären negativen Feedback Loop führte. Interessanterweise hat die Integration der nicht-kodierender RNA und dieser negative Feedback Loop die Dynamik und Reversibilität der NF-κB-regulierten Genexpression erhöht. Die Kontrollierbarkeit der Wirkstoffabgabe kann zudem durch den Einsatz von Inhibitoren der klassischen NF-κB-Signalisierung wie z.B. TPCA-1 erweitert werden. Die Wirksamkeit der exprimierten Biologicals wurde durch Neutralisation der Zytokine in verschiedenen Experimenten nachgewiesen. Für zukünftige in vivo Versuche konnten erste Alginat-Verkapselungen der Zellen durchgeführt werden. Die Aktivierbarkeit des NF-κB abhängigen Promoters wurde ferner durch Ko-Kultivierung mit humanen Plasmaproben und Synovialflüssigkeiten nachgewiesen. Mit diesem generierten Sensor-Effektor-System haben wir selbstregulierende Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anit-inflammatorischen Biologikals entwickelt.

Glycoprotein receptor VI (GPVI) is the major collagen receptor in platelets. Ligand binding induces GPVI clustering, which initiates a tyrosine kinase-based signalling cascade via an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). GPVI has been shown to play roles in both the initiation and growth of thrombi, although GPVI deletion is not associated with significant bleeding. Therefore, targeting the GPVI pathway is a potential route to overcome the bleeding risk associated with current therapies. G6b-B is a glycoprotein receptor with restricted expression to platelets membrane surface that inhibits platelet activation by ITAM receptors. Crosslinking with G6b-B antibodies prevents platelet activation. We hypothesize that it will be possible to overcome the bleeding risk of current antithrombotics, which target other platelet activation pathways, by inhibiting GPVI-mediated pathway molecules or activating G6b-B using novel biologics, such as Affimers. To inhibit the GPVI pathway we generated novel anti-human GPVI monoclonal antibodies (mAbs) and their F(ab) fragments (developed prior to the start of this project by Emfret Analytics Würzburg, Germany). The aim was to determine their mode of action and to which epitopes or regions of the protein they bind. Four new anti-GPVI mAbs and their F (ab) fragments were characterised. Among the mAbs, E7 was the only antibody to fully block GPVI activity. A9 caused a minor inhibition suggestive of either direct competition for the CRP binding site, binding close enough to cause steric hindrance to its binding. GPVI-mediated platelet activation was inhibited by all four F(ab) fragments suggesting these have potential as a novel α-GPVI therapy. Structural characterization of these anti-GPVI mAbs (E12, E7, E2, D3 and A9) with GPVI was assessed with three complementary approaches, namely bio-layer interferometry (BLI), crystallography, and epitope mapping. BLI showed that none of the mAbs are monomer or dimer specific. Crystallographic studies were not successful and will need further future optimisation. GPVI chimeras were generated to identify that the mAbs were binding to the GPVI D1 domain, which is the ligand binding domain. Additional studies will be needed for a full structural characterization of these mAbs bound to GPVI which protein-based therapeutics are required to demonstrate during their development phase. Our other aim was to develop new biologics (Affimers) to target and activate the ITIM- receptor G6b-B, which constitutively inhibits platelet activation by ITAM-like receptors. The potential antithrombotic effect of G6b-B and whether G6b-B stimulation could lead to less reactive platelets, reducing the risk, or severity of thrombosis has not been extensively studied until now. Here we targeted for the first time an inhibitory pathway to downregulate GPVI by targeting G6b-B. Three Affimers were identified to bind G6b- B. Preliminary functional studies showed that these Affimers did not induce G6b-B to inhibit platelet activation through the GPVI activation pathway in classical in vitro platelet function assays (namely aggregometry). However, preliminary in vitro flow studies with Affimer 24 showed some potential to influence thrombus size on CRP coated surfaces. In conclusion, in this thesis we provide an insight of the first functional and structural characterization of new mAbs targeting human GPVI, with some showing potential as good candidates for antiplatelet therapy. Additionally, we show the first attempt to target an inhibitory pathway as anti-platelet therapy by developing Affimers against G6b-B. Further research is needed to explore whether G6b-B stimulation could lead to less reactive platelets reducing the risk, or severity of thrombotic disease without causing substantial bleeding. / Glykoproteinrezeptor VI (GPVI) ist der wichtigste Kollagenrezeptor in Blutplättchen. Die Ligandenbindung induziert die GPVI-Clusterbildung, die eine Tyrosinkinase-basierte Signalkaskade über ein Immunrezeptor-Tyrosin-basiertes Aktivierungsmotiv (ITAM) initiiert. Es wurde gezeigt, dass GPVI sowohl bei der Initiierung als auch beim Wachstum von Thromben eine Rolle spielt, obwohl eine GPVI-Deletion nicht mit signifikanten Blutungen verbunden ist. Daher ist die Ausrichtung auf den GPVI-Weg ein potenzieller Weg, um das Blutungsrisiko zu überwinden, das mit aktuellen Therapien verbunden ist. G6b-B ist ein Glykoproteinrezeptor mit eingeschränkter Expression auf der Membranoberfläche von Blutplättchen, der die Aktivierung von Blutplättchen durch ITAM-Rezeptoren hemmt. Die Quervernetzung mit G6b-B-Antikörpern verhindert die Thrombozytenaktivierung. Wir gehen davon aus, dass es möglich sein wird, das Blutungsrisiko aktueller Antithrombotika zu überwinden, die auf andere Thrombozytenaktivierungswege abzielen, indem GPVI-vermittelte Signalwegmoleküle gehemmt oder G6b-B mit neuartigen Biologika wie Affimers aktiviert werden. Um den GPVI-Weg zu hemmen, haben wir neuartige monoklonale Anti-Human-GPVI-Antikörper (mAbs) und ihre F(ab)-Fragmente generiert (entwickelt vor Beginn dieses Projekts von Emfret Analytics Würzburg, Deutschland). Ziel war es, ihre Wirkungsweise zu bestimmen und an welche Epitope oder Regionen des Proteins sie binden. Vier neue Anti-GPVI-mAbs und ihre F(ab)-Fragmente wurden charakterisiert. Unter den mAbs war E7 der einzige Antikörper, der die GPVI-Aktivität vollständig blockierte. A9 verursachte eine geringfügige Hemmung, was entweder auf eine direkte Konkurrenz um die CRP-Bindungsstelle hindeutet, und bindet nahe genug, um eine sterische Hinderung seiner Bindung zu verursachen. Die GPVI-vermittelte Blutplättchenaktivierung wurde durch alle vier F(ab)-Fragmente gehemmt, was darauf hindeutet, dass diese ein Potenzial als neuartige α-GPVI-Therapie haben. Die strukturelle Charakterisierung dieser Anti-GPVI-mAbs (E12, E7, E2, D3 und A9) mit GPVI wurde mit drei komplementären Ansätzen bewertet, nämlich Bio-Layer-Interferometrie (BLI), Kristallographie und Epitop-Mapping. BLI zeigte, dass keiner der mAbs monomer- oder dimerspezifisch ist. Kristallographische Studien waren nicht erfolgreich und müssen in Zukunft weiter optimiert werden. GPVI-Chimären wurden erzeugt, um zu identifizieren, dass die mAbs an die GPVI-D1-Domäne binden, die die Ligandenbindungsdomäne ist. Zusätzliche Studien werden für eine vollständige strukturelle Charakterisierung dieser an GPVI gebundenen mAbs benötigt, die proteinbasierte Therapeutika während ihrer Entwicklungsphase nachweisen müssen. Unser weiteres Ziel war die Entwicklung neuer Biologika (Affimere) zur gezielten Aktivierung des ITIM-Rezeptors G6b-B, der die Thrombozytenaktivierung durch ITAM-ähnliche Rezeptoren konstitutiv hemmt. Die potenzielle antithrombotische Wirkung von G6b-B und ob die G6b-B-Stimulation zu weniger reaktiven Blutplättchen führen könnte, was das Risiko oder die Schwere einer Thrombose verringert, wurde bisher nicht umfassend untersucht. Hier zielten wir zum ersten Mal auf einen inhibitorischen Weg, um GPVI herunterzuregulieren, indem wir auf G6b-B abzielten. Es wurden drei Affimere identifiziert, die G6b-B binden. Vorläufige funktionelle Studien zeigten, dass diese Affimere G6b-B nicht dazu veranlassten, die Blutplättchenaktivierung durch den GPVI-Aktivierungsweg in klassischen in vitro-Blutplättchenfunktionsassays (nämlich Aggregometrie) zu hemmen. Vorläufige In-vitro-Durchflussstudien mit Affimer 24 zeigten jedoch ein gewisses Potenzial zur Beeinflussung der Thrombusgröße auf CRP-beschichteten Oberflächen. Zusammenfassend geben wir in dieser Dissertation einen Einblick in die erste funktionelle und strukturelle Charakterisierung neuer mAbs, die auf humanes GPVI abzielen, wobei einige das Potenzial als gute Kandidaten für die Thrombozytenaggregationshemmung zeigen. Darüber hinaus zeigen wir den ersten Versuch, einen inhibitorischen Signalweg als Thrombozytenaggregationshemmer anzugreifen, indem wir Affimere gegen G6b-B entwickeln. Weitere Forschung ist erforderlich, um zu untersuchen, ob die G6b-B-Stimulation zu weniger reaktiven Blutplättchen führen könnte, wodurch das Risiko oder die Schwere einer thrombotischen Erkrankung verringert wird, ohne dass es zu erheblichen Blutungen kommt.

Die Rheumatoide Arthritis ist eine häufig auftretende, chronisch entzündliche Systemerkrankung und wird bei bis zu einem Drittel der Patienten mit einer T-LGL-Leukämie diagnostiziert. Wie häufig klonale T-LGL-Zellen bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis auftreten, ist ungeklärt. Ziel dieser Studie war es, die Oberflächenantigene der T-Lymphozyten in einem Patientenkollektiv mit Rheumatoider Arthritis zu bestimmen. Der Fokus lag dabei auf der Prävalenz von klonalen T-LGL-Zellexpansionen und möglichen Risikofaktoren. Hierfür wurden zwischen November 2013 und August 2015 527 Patienten mit Rheumatoider Arthritis mittels Durchflusszytometrie untersucht. Zur Bestätigung der Klonalität erfolgte bei Patienten mit auffälligem Immunphänotyp eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Analyse. Bei 19 Patienten konnte eine klonale T-LGL-Zellexpansion festgestellt werden, was einer Prävalenz von 3,6% entspricht. Das Auftreten von klonalen T-LGL-Zellen war mit einer TNFα-Inhibitoren-Therapie (p=0,01) und deren Dauer assoziiert (p=0,01). Ob die klonalen T-LGL-Zellen Ausdruck der Autoimmunerkrankung oder Vorläuferzellen einer T-LGL-Leukämie sind, bleibt offen. Die Patienten werden mit einer klonalen T-LGL-Zellexpansion unklarer Signifikanz beschrieben. / Rheumatoid arthritis is a common, chronic inflammatory systemic disease and is diagnosed in up to a third of patients with T-LGL leukemia. The frequency of clonal T-LGL-cells in patients with rheumatoid arthritis is unknown. The aim of this study was to determine surface antigens of T-lymphocytes in a collective of patients with rheumatoid arthritis. The focus was on the prevalence of clonal T-LGL cell expansion and possible risk factors. Therefore, 527 patients with rheumatoid arthritis were examined using flow cytometry between November 2013 and August 2015. To confirm clonality, a PCR (polymerase chain reaction) analysis was carried out in patients with an aberrant immune phenotype. A clonal T-LGL-cell expansion was found in 19 of those patients, which corresponds to a prevalence of 3,6%. The occurrence of clonal T-LGL-cells was associated with TNFα inhibitor therapy (p=0,01) and its duration (p=0,01). Whether the clonal T-LGL-cells are an expression of the autoimmune disease or precursor cells of T-LGL leukemia remains unclear. Therefore, those patients are described with a clonal T-LGL-cell expansion of uncertain significance.