Diss., Technische Wissenschaften ETH Zürich, Nr. 14779, 2002.

Zugl.: Bremen, Univ., Diss., 2009

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Das Endoplasmatische Reticulum (ER) bildet ein ausgedehntes Netzwerk aus Membran-tubuli und abgeflachten Zisternen in der eukaryontischen Zelle. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung eines Extraktes der Eier von Xenopus laevis ein in vitro System zur Bildung der polygonalen Membrannetzwerke des ER entwickelt. In diesem System wurde zum ersten Mal eine Mikrotubuliunabhängige Bildung der Membrannetzwerke des ER demonstriert und damit die Existenz Mikrotubuli-unabhängiger Mechanismen für ihre Bildung. Die Membrantubuli entstehen durch die Fusion kleiner Membranvesikel miteinander. Diese Fusion allein, die unabhängig von Cytosol ist, ist jedoch nicht ausreichend, da durch die Fusion in Abwesenheit von Cytosol lediglich große, kugelförmige Membranvesikel entstehen. Vielmehr ist eine unbekannte cytosolische Aktivität notwendig, damit die Fusion zur Bildung von Membrantubuli und Netzwerken führt. Mit dem in vitro System wurde die Voraussetzung für die Identifizierung dieser Mikrotubuli-unabhängigen, cytosolischen Aktivität geschaffen. Das Verhalten des ER in vitro ähnelt dem des ER in Zellen. Werden Zellen mit Calcium-Ionophoren behandelt, so deassembliert das ER, während in vitro die Bildung des ER durch hohe Konzentrationen von Ca2+ verhindert wird. In der Mitose deassembliert das ER in Abhängigkeit vom Zelltyp zu einem unterschiedlichen Ausmaß. Analog wird das ER in vitro zu einem unterschiedlichem Ausmaß gebildet, abhängig von der Art, in der die zugegebenen mitotischen Cytosole hergestellt wurden. Die Kernhülle hat Ähnlichkeit mit den abgeflachten Zisternen des ER und des Golgi-Apparates. In dieser Arbeit wurde die Bildung des Zellkerns in einem zellfreien System etabliert, das den für die ER-Bildung eingesetzten Extrakt verwendet. Einzelne Phasen bei der Bildung der Kernhülle wurden in einem vereinfachten Kernbildungssystem untersucht. Dabei wurde ein neuer Schritt in diesem Prozeß entdeckt: Das Abflachen von Chromatin-gebundenen Membranvesikeln auf der Oberfläche des Chromatins. Die hierfür verantwortliche Aktivität befindet sich in der cytosolischen Fraktion. Ohne Cytosol binden die Kernmembranvesikel an das Chromatin und fusionieren miteinander, die resultierenden großen Membranvesikel bleiben jedoch kugelförmig, flachen nicht ab und können keine Kernhülle bilden. Die Identifizierung der cytosolischen Faktoren, die an dem Abflachen der Membranen bei der Bildung der Kernhülle und der Bildung der Membrantubuli des ER beteiligt sind, sollte Hinweise auf die zugrunde liegenden Mechanismen geben und zeigen, ob verwandte Mechanismen an der Bildung ähnlicher Membranstrukturen in der eukaryontischen Zelle beteiligt sind.

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Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2006 u.d.T.: Lipphardt, Veronika: Biowissenschaftler mit jüdischem Hintergrund und die "Biologie der Juden"

–1 programmed ribosomal frameshifting (–1PRF) is a fundamental recoding process that makes alternative reading frames accessible during translation. Especially RNA viruses rely on this mechanism to regulate gene expression for example while main- taining the correct stoichiometry of replicative enzymes and structural proteins. –1PRF is at the heart of viral replication and it has been shown that perturbations of –1PRF efficiency can have dramatic effects on viral fitness. In the present work, two viral –1PRF elements were studied: severe acute respi- ratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ORF1 a/b and human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) gag-pol. In a mutational study of the SARS-CoV-2 –1PRF element it was confirmed that it functions in its pseudoknot conformation. Additionally, through mutagenesis as well as targeting by antisense oligonucleotides, it was shown that the structure of the RNA directly correlates to –1PRF efficiency. Next, protein interactors of both –1PRF elements were captured revealing over 100 interactors for SARS-CoV-2 and almost 50 for HIV-1. Through this, a set of 18 core interactors of the unrelated –1PRF elements of SARS-CoV-2 and HIV-1 was identified. Among those, the two proteins HNRNPH1 and ZNF346 were shown to reduce –1PRF efficiency significantly for both sites. Among the interactors of SARS-CoV or HIV-1 alone, the strongest effect was mediated by ZAP-S for SARS-CoV-2 and SRBD1 for HIV-1. Finally, it was shown that overexpression of ZAP-S reduced the replication of SARS- CoV-2 by 95% in collaboration with the group of Prof. Dr. Čičin-Šain. In addition, using pseudotyped HIV-1 particles, overexpression of SRBD1 reduced RTase levels and by extension viral titers by 90%. / Das –1 programmierte ribosomale Frameshifting (–1PRF) ist ein grundlegender Umkodierungsprozess, der alternative Leseraster während der Translation zugänglich macht. Insbesondere RNA-Viren sind auf diesen Mechanismus angewiesen, um beispielsweise die Genexpression zu regulieren und gleichzeitig die korrekte Stöchiometrie der replizierenden Enzyme und Strukturproteine aufrechtzuerhalten. Das –1PRF ist das Herzstück der viralen Replikation, und es hat sich gezeigt, dass Störungen der –1PRF-Effizienz dramatische Auswirkungen auf die virale Fitness haben können. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei virale –1PRF-Elemente untersucht: das Coronavirus 2 des schweren akuten Respirationssyndroms (SARS-CoV-2) ORF1 a/b und das humane Immunschwächevirus 1 (HIV-1) gag-pol. In einer Mutationsstudie des SARS-CoV-2 –1PRF-Elements wurde bestätigt, dass es in seiner Pseudoknotenkonformation funktioniert. Darüber hinaus wurde durch Mutagenese sowie durch Targeting mit Antisense-Oligonukleotiden gezeigt, dass die Struktur der RNA direkt mit der –1PRF-Effizienz korreliert. Als Nächstes wurden die Protein-Interaktoren beider –1PRF-Elemente erfasst, wobei über 100 Interaktoren für SARS-CoV-2 und fast 50 für HIV-1 gefunden wurden. Auf diese Weise wurde eine Gruppe von 18 Kerninteraktoren der nicht miteinander verbundenen –1PRF-Elemente von SARS-CoV-2 und HIV-1 identifiziert. Unter diesen konnten die beiden Proteine HNRNPH1 und ZNF346 die –1PRF-Effizienz an beiden Stellen deutlich verringern. Unter den Interaktoren von SARS-CoV oder HIV-1 allein wurde die stärkste Wirkung durch ZAP-S für SARS-CoV-2 und SRBD1 für HIV-1vermittelt. Schließlich wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Dr. Čičin-Šain gezeigt, dass die Überexpression von ZAP-S die Replikation von SARS-CoV-2 um 95% reduziert. Darüber hinaus reduzierte die Überexpression von SRBD1 unter Verwendung von pseudotypisierten HIV-1-Partikeln die RTase-Werte und damit auch die Virustiter um 90%.

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