Eine seneszente Zelle erfährt proteotoxischen Stress durch einen Prozess, der als “Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP)” bezeichnet wird. SASP Faktoren involvieren vermehrte Produktion von Cytokinen und Chemokinen, die die Proteinhomöostase stören. Das führt zu Stress im Endoplasmatischen Retikulum (ER), Unfolded Protein Response (UPR) sowie erhöhter Autophagie in seneszenten Zellen. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Therapie-induzierte Seneszenz (TIS), ausgelöst durch Adriamycin (ADR) oder Cyclophosphamid (CTX), zu einer erhöhten Expression von Alzheimer-assoziierten Genen führt. Das ist allerdings nur der Fall, wenn TIS mit SASP und Proteotoxizität korreliert. Außerdem zeigen wir, dass transgene Mäuse mit Alzheimer ebenso Eigenschaften von Seneszenz aufweisen. Mutationen in Genen wie Amyloid-Precursor-Protein (APP) und Presenilin 1 (PSEN1) erzeugen nicht nur Alzheimer, sondern verstärken auch Seneszenz. In APPPS1+/- transgenen Mäusen treten seneszente Zellen zusammen mit Amyloid β (Aβ) Plaques auf. Gleichfalls führt die Überexpression von APP in der Neuroblastom Zelllinie SH-SY5Y zu einer Erhöhung von Seneszenz-Markern, einschließlich ER Stress und Autophagie-assoziierten Lysosomen. Diese Beobachtungen implizieren einen Zusammenhang zwischen Seneszenz und Alzheimer. Wir präsentieren Proteotoxizität als gemeinsamen Nenner dieser beiden Pathologien. Allerdings kommen wir zu dem Ergebnis, dass APP und PSEN1 keine Regulatoren von TIS sind. APP trägt zur TIS-assoziierten Proteotoxizität bei, da ein knock-down von APP zu einer Reduzierung des ER Stress führt. Außerdem, können seneszente Zellen mittels Blockierung der APP Spaltung und somit Bildung von Aβ Plaques durch den Gamma-Sekretase Inhibitor Semagacestat, selektiv getötet werden. Das deutet auf ein senolytisches Potential hin. Allerdings hat Semagacestat keinen Einfluss auf die Expression von ER Stress Marker. Dies suggeriert, dass APP in Eμ-myc Lymphomen Aβ-unabhängig zu ER Stress beiträgt, während diese in Alzheimer eine zentrale Rolle in der Phathophysiologie spielen. / A senescent cell experiences proteotoxic stress in consequence to senescence-associated secretory phenotype (SASP). SASP factors involve increased production of cytokines and chemokines, which overload and disrupt protein homeostasis. This induces endoplasmic reticulum (ER) stress, unfolded protein response (UPR) as well as elevated autophagic-lysosomal burden in senescent cells, further promoting the formation of misfolded proteins. In this thesis we found, in Eμ-myc transgenic mice lymphomas, therapy-induced senescence (TIS) by Adriamycin or Cyclophosphamide treatment leads to an up regulation of genes involved in Alzheimer’s disease (AD). However, this is true only when TIS correlates with SASP, leading to proteotoxicity. On the other hand, we demonstrate that transgenic AD inflicted mice also present with features of senescence. Mutations of genes such as amyloid precursor protein (APP) and presenilin1 (PSEN1), not only engender AD, but also augment senescence. In APPPS1+/- transgenic mice, the senescent cells co-occur with amyloid β (Aβ) plaques. Likewise, in neuroblastoma cell line SH-SY5Y, APP overexpression results in upregulation of senescence markers, including markers for ER stress and autophagic-lysosomal burden. These observations imply that there is a crosstalk between senescence and AD. We demonstrate proteotoxicity as a common denominator between the two pathologies. However, we found that APP and PSEN1 are not regulators of TIS. APP contributes to proteotoxic stress associated with TIS as knocking down of APP leads to a reduction of ER stress. Inhibiting Aβ formation by targeting the processing of APP using Semagacestat- a gamma-secretase inhibitor, selectively targets senescent cells resulting in cell death. This indicates its senolytic potential. However, Semagacestat has no impact on the expression of ER stress markers. This suggested that in Eμ-myc lymphomas, APP contributes to ER stress in an Aβ-independent fashion, unlike in AD, where Aβ is considered central to its pathophysiology.

Das Verständnis der komplexen Interaktionen innerhalb des weltweiten Transportnetzes ist ein essentieller Schritt auf dem Weg zur Vorhersage der Krankheitsausbreitung und Entwicklung von effektiven Gegenmaßnahmen. Ungeachtet der weltweiten Vernetzung werden die politischen Entscheidungen oft von nationaler, regionaler und egozentrischen Denkweise geleitet. Die Ebola-Epidemie in 2014 demonstrierte deutlich, dass solche Herangehensweise modernen Epidemien nicht gerecht werden kann. In dieser Dissertation werden mehrere Methoden entwickelt, welche es ermöglichen während einer Epidemie die globalen Teilnehmer entsprechend ihrer Rolle einzustufen und das Risiko des Krankheitsexports zu berechnen. Die Methodik wird analytisch und numerisch ausführlich diskutiert. Darüber hinaus werden Lösungen für hypothetische und reale Epidemien auf dem Flugverkehrsnetz vorgestellt. Im zweiten Teil wird mit Hilfe eines vereinfachten spieltheoretischen Modells der Prozess der Ressourcenverteilung zur Epidemieeindämmung untersucht. Dabei erfolgt die Verteilung der Ressourcen von den Knoten und kann in egozentrischer oder altruistischer Weise erfolgen. Im Rahmen der Modells liegen die Optima für das altruistische und egozentrische System eng beieinander, solange der ausbruch räumlich konzentriert ist. In diesem Fall ist es optimal alle Ressourcen in den Ausbruchsknoten zu investieren. Bei lokal getrennten Ausbrüchen streben die Systeme verschiedene Gleichgewichte an. In allen Aspekten der Arbeit wird netzwerkbasierte Repräsentation des Systems verwendet, so dass die Orte durch Knoten innerhalb eines Transportnetzwerkes abgebildet werden. Die vorliegende Arbeit vereint mehrere Vorteileder etablierten Methoden: während der Schwerpunkt auf der Topologie des Netzwerkes liegt, berücksichtigt die vorgestellte Methodik den Ursprungsort der Epidemie. / The growing complexity of the global mobility is a key challenge for the understanding of the worldwide spread of emergent infectious diseases and the design of effective containment strategies. Despite global connectivity, containment policies are often based on national, regional and ’egocentric’ assessments of outbreak situations that are no longer effective or meaningful, as recently demonstrated by 2014 Ebola outbreak in West Africa, where months passed before a concerted, international effort followed. Despite the importance of the matter, optimal strategies in highly connected non-local settings are poorly understood. In the work at hand we propose a set of methods for more informed decision making during and prior to a pandemic. All of the studied systems are represented by networks in analogz the traffic networks, which play a dominant role during the global disease spreading. We introduce methods to calculate the risk of disease importation in a specific location and to determine the role of a node during an outbreak. Using the world aviation network, we demonstrate how the methods can be applied on real and hypothetical pandemics. We show that the airports can be divided into two distinct groups according to the role they take on in distributing the disease. Further, investigate the allocation of resources as a game theoretic dilemma. We embrace a bottom-up approach to this question, allowing the nodes of the network to distribute the resourses. We investigate egocentric and altruistic strategies and conclude that the optimal state of both systems are very similar if the outbreak is spacially confined. In this case allocation of resources ti the affected nodes is the optimal strategy. When there are multiple independent outbreaks, the optima diverge substantially. To foster the benefits of multiple approaches, the work at hand combines the information on the network topology but also regard some specifics of the outbreak at hand outbreak.

Das Aussterberisiko einer Art ist nicht zufällig, sondern wird von mehreren Faktoren bestimmt, die geografische, ökologische und morphologische Merkmale umfassen. Einige dieser Merkmale sind Teil der Kriterien zur Einschätzung der Gefährdung einer Art, wie zum Beispiel in der Roten Liste der IUCN. Diese Beurteilungen sind ein wichtiges Werkzeug für den Artenschutz, da sie eine Verteilung der Maßnahmen auf die am stärksten gefährdeten Arten ermöglichen. Dies ist besonders wichtig für Amphibien, die Wirbeltiergruppe mit dem derzeit höchsten Anteil an bedrohten Arten. Bei einem großen Teil der Arten fehlt jedoch eine Einschätzung des Aussterberisikos. Weiter mangelt es auch an einer endgültigen Verifizierung des Einflusses der genutzten Merkmale auf das Aussterberisiko, da Aussterbeereignisse auf neontologischen Zeitskalen schwer zu erkennen sind. Der Fossilbericht stellt ein enormes Archiv an bereits geschehenen Aussterbeereignissen dar und bietet die Möglichkeit den Einfluss bestimmter Merkmale auf die Gefährdung zu testen. In der vorliegenden Arbeit untersuche ich Merkmale von Amphibienarten, die zum Aussterberisiko dieser zunehmend gefährdeten Gruppe beitragen und bestätige die Bedeutung der geographischen Reichweite für das Aussterberisiko. Die in dem sich aktuell entwickelnden Gebiet Conservation Paleobiology angesiedelte Arbeit konzentriert sich auf die Verbindung von paläontologischen und neontologischen Daten, und wie diese Kombination dazu beitragen kann das Wissen über Aussterberisiko-beeinflussende Faktoren zu erweitern. Dies wird durch die Analyse verschiedener im Fossilbericht überlieferter Artmerkmale und der Kombination der Erkenntnisse mit Ergebnissen der Roten Liste und Klimadaten erreicht. In meiner Arbeit zeige ich mögliche Anwendungen des Fossilberichts auf aktuellen Themen des Artenschutzes und wie eine Kombination beider Bereiche zum tieferen Verständnis von Gefährdungsfaktoren beitragen kann. / The extinction risk of a species is not random, but rather shaped by several factors comprising geographical, environmental and morphological traits. Some of these traits have been incorporated in assessment procedures for the classification of extant species' extinction risk, such as the International Union for Conservation of Nature (IUCN) Red List. These assessments are an important tool for conservation purposes, as they direct the available resources to species that are most reliant on support. This is especially important for amphibians, which are the the most endangered terrestrial vertebrate taxon today. However, a large number of species lack an assessment for extinction risk. Also, additional verification of the general influence of incorporated traits on extinction risk is needed, as real extinction events are difficult to detect on neontological time scales. The fossil record offers the opportunity to test the influence of certain traits on extinction risk as it provides an enormous archive of extinction events that already happened. In this thesis, I examine traits in amphibian species that contribute to the extinction risk of this increasingly endangered group and provide support for the importance of geographic range size on the extinction risk of species. Placed in the developing field of Conservation Paleobiology, the study concentrates on the connection between paleontological and neontological data and how this unique combination can add to the knowledge about traits that shaped the extinction risk of amphibian species. This is achieved by investigating species traits, conserved in the amphibian fossil record, and combining these findings with results from the IUCN Red List and climate data. The present dissertation shows possible applications of the fossil record to current questions in conservation biology and shows how a combination of both fields contributes to the understanding of factors that influence the extinction risk of species.

Die Kartoffel, eines der wichtigsten Nahrungsmittel weltweit, wird unter anderem von dem Erreger Rhizoctonia solani Kühn befallen. Durch dieses Pathogen hervorgerufene Qualitäts- und Ertragsverminderungen können zu erheblichen ökonomischen Verlusten führen. Da derzeitig verfügbare Bekämpfungsmaßnahmen nur eine eingeschränkte Effektivität aufzeigen, sind alternative Bekämpfungsstrategien dringend notwendig. Der Einsatz resistenter Sorten stellt eine effektive, umweltfreundliche Alternative dar, jedoch ist derzeit nur wenig über die der Resistenz der Kartoffel gegenüber R. solani zugrundeliegenden Mechanismen bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, Merkmale aufzufinden, die mit einer erhöhten Feldresistenz der Kartoffel gegenüber R. solani korrelieren und zukünftig als Marker in der Züchtung zur Einschätzung des Resistenzgrads von Sorten genutzt werden können. Auf der Grundlage von Feldversuchen wurden zwei Kartoffelgenotypen mit einem unterschiedlichen Grad der Feldresistenz gegenüber R. solani für vergleichende molekularbiologische und biochemische Analysen ausgewählt. Die Analyse des Expressionsniveaus ausgewählter Abwehrgene zeigte, dass die Kartoffelsorte mit geringerer Anfälligkeit ein konstitutiv höheres Expressionsniveau aufweist als die Sorte mit einer höheren Anfälligkeit. Im Gegensatz zur stärker anfälligen Sorte wurde in Wurzeln und Stängeln der weniger anfälligen Sorte kein erhöhtes Expressionsniveau der Abwehrgene infolge der Infektion mit R. solani festgestellt. Zudem wies die weniger anfällige Sorte höhere Gehalte an α-Chaconin and α-Solanin sowie Nicotiflorin auf. Anhand von in vitro Untersuchungen wurde ein wachstumshemmender Effekt dieser Komponenten auf R. solani festgestellt. Weiterhin wurde ein geringerer Gehalt an R. solani-DNA in den Wurzeln der weniger anfälligen Sorte determiniert. Demnach scheint eine geringere Anfälligkeit der Kartoffel gegenüber diesem Erreger mit einer höheren, präformierten pflanzlichen Immunabwehr korreliert zu sein. / Potato, the fourth most important food crop worldwide, is also target of many pests and microbial pathogens including the fungus Rhizoctonia solani Kühn. The infection of potato with this pathogen leads to considerable economic losses. The soil-borne nature, the formation of melanised sclerotia, and the limited efficacy of fungicides impair the control of this pathogen and strengthen the necessity for alternative control measures. A very effective alternative is the use of resistant cultivars. Quantitative differences in the degree of resistance of potato to R. solani have been repeatedly observed in the field. However, until now there is no information available regarding the underlying mechanisms contributing to the resistance level. This thesis aimed at revealing mechanisms in potato which contribute to the manifestation of a certain degree of field resistance to R. solani. Based on the screening of various potato genotypes in field trials, two potato cultivars distinctly differing in the level of resistance to R. solani were selected for further molecular and biochemical analyses. The cultivar with a higher degree of resistance showed higher constitutive expression of defence-related genes. In contrast to the less resistant cultivar, no distinct increase of the defence-gene expression level was detectable upon pathogen infection in this cultivar. Moreover, contents of the glycoalkaloids α-chaconine and α-solanine and of the flavonol nicotiflorin were higher compared to the less resistant cultivar. Using in vitro culture tests, a growth-reducing effect of these compounds on R. solani was confirmed. Concluding, a higher resistance of potato cultivars to R. solani seems to be related to a higher expression level of defence-related genes and to a higher content of plant secondary metabolites. This enhanced constitutive defence level resulted in a lower pathogen colonisation of the plant, thus contributing to a reduced disease severity in the field.

Tumorzellen können vielfältige Resistenzmechanismen gegenüber Zytostatika entwickeln. Untersuchungen an drei humanen Tumorzellinien und ihren cisplatinresistenten Varianten zeigten eine Assoziation von erhöhter MRP2-Expression und dem Auftreten von Cisplatinresistenz. Darüberhinaus waren die cisplatinresistenten Zellinien gegenüber Carboplatin kreuzresistent. Um weitere Faktoren im Zusammenhang mit der Cisplatinresistenz zu untersuchen, wurde der Mutationsstatus von p53 und der zelluläre Glutathiongehalt in den Zellinien bestimmt. Der offene Leserahmen von MRP2 aus der cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS wurde für die Transfektion in die cisplatinsensitive Zellinie A2780 genutzt. Die Transfektanten zeigten eine Überexpression von MRP2 und wiesen eine Resistenz gegenüber Cisplatin und Carboplatin auf. Dies konnte in Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen unter Cisplatinbehandlung gestätigt werden. Durch computergestützte Faltungsanalysen von Abschnitten der MRP2-mRNA wurden zwei potentielle Ribozymschnittstellen ausgewählt. Die konstruierten Anti-MRP2-Hammerhead-Ribozyme RzM1 und RzM2 wurden im zellfreien System auf ihre Schnittaktivität getestet und erwiesen sich als katalytisch aktiv. Es wurden verschiedene kinetische Parameter für RzM1 und RzM2 ermittelt und mit anderen Ribozymen verglichen. Die Ribozyme zeigten eine gute Effektivität bei der Spaltung ihres Zielmoleküls, wobei RzM1 die höhere Effektivität aufwies. Beide Ribozyme wurden auf ihre Wirksamkeit durch Transfektion in die Zellinie A2780RCIS getestet. Die untersuchten Transfektanten zeigten eine geringere Expression von MRP2 auf mRNA- und Proteinebene und wiesen eine verminderte Resistenz gegenüber Cisplatin, Carboplatin, Daunorubicin und Etoposid auf. Die Ribozyme RzM1 und RzM2 waren gleichermaßen für die Expressionsregulierung von MRP2 in Tumorzellen geeignet. In Zellzyklus- und Apoptose-Untersuchungen wurde funktionell bestätigt, daß die A2780RCIS-Anti-MRP2-Ribozym-Transfektanten auf eine Cisplatinbehandlung stärker ansprechen als die cisplatinresistente Ausgangszellinie A2780RCIS. Die Anwendung der Ribozyme RzM1 und RzM2 zur Unterstützung der Chemotherapie von Tumorzellen scheint daher vielversprechend. / Tumour cells can develop a lot of resistance mechanisms against cytostatic drugs. Examinations of three human tumour cell lines and their cisplatinresistant variants showed an association of elevated MRP2 expression and the occurrance of cisplatinresistance. Moreover, the cisplatinresistant cell lines were crossresistant against carboplatin. To examine further factors in context of cisplatinresistance the mutation status of p53 and the cellular glutathione content of the cell lines were determined. The MRP2-open reading frame of the cisplatinresistant ovarian carcinoma cell line A2780RCIS was used for transfection into the cisplatinsensitive cell line A2780. The transfectants showed an overexpression of MRP2 and a resistance against cisplatin and carboplatin. This could be confirmed with analysis of the cell cycle and apoptosis induction after treatment with cisplatin. Using computer aided folding analysis of MRP2 mRNA parts two possible ribozyme cleavage sites were selected. The constructed anti-MRP2 hammerhead ribozymes RzM1 and RzM2 were tested in a cell-free system with respect to their cleavage activities and were found to be catalytic active. Various kinetic parameters of RzM1 and RzM2 were determined and compared with other ribozymes. The ribozymes showed a good effectivity for the substrate cleavage, although RzM1 had the better effectivity. Both ribozymes were tested for their effectiveness after transfection into the cell line A2780RCIS. The transfectants showed a lower MRP2 expression on mRNA and protein level and also a reduced resistance against cisplatin, carboplatin, daunorubicin, and etoposide. The ribozymes RzM1 and RzM2 were both equally suitable for the regulation of MRP2 expression in tumour cells. Analysis of cell cycle and apoptosis induction could confirm functionally the higher sensitivity of the A2780RCIS-anti-MRP2 ribozyme transfectants after treatment with cisplatin in comparison to the cisplatinresistant cell line A2780RCIS. Therefore, the application of the ribozymes RzM1 and RzM2 for the support of cancer chemotherapy seems to be promising.

Natürliches Verhalten findet in diversen sensorischen und motorischen Modalitäten statt, und hängt vom sensorischen Feedback ab, welches das Verhalten kontinuierlich anpasst. Um die zu Grunde liegenden neuronalen Korrelate natürlichen Verhaltens untersuchen zu können, ist die Nutzung moderner Aufnahmetechniken notwendig, die oft die Kopffixierung des Tieres erfordern. Diese Einschränkung wurde mit verschiedenen Methoden angegangen, unter anderem mit virtueller Realität in Kombination mit einem luftgelagerten Ball oder Laufradsystemen. Diese Systeme haben jedoch zahlreiche Nachteile. Wir haben das Air-Track-System entwickelt, eine neue Methode für eine leicht zu bauende und nur minimale Computerverarbeitung erfordernde Verhaltensumgebung. Der Air-Track ist ein leichtgewichtiges physisches Labyrinth, das auf einem Lufttisch schwebt und alle Eigenschaften der "echten" Welt hat, einschließlich mehrerer sensorischer Modalitäten, die eng an die motorischen Handlungen gekoppelt sind. Um dieses System zu testen, trainierten wir Mäuse in Go/No-Go- und two-alternative forced choice-Aufgaben. Mäuse wählten Arme und unterschieden. Ein Kamerasystem mit eigens entwickelter Kontrolle zeichnete die Position des Tieres auf und generierte Daten, die zur Berechnung von Reaktionszeiten in den visuellen und somatosensorischen Unterscheidungsaufgaben verwendet werden konnten. Um die Bewegung des Air-Track-Systems aufzuzeichnen, entwickelten wir ein "Pixy"-System zur Bewegungsverfolgung. Wir erweiterten die Entwicklung dann zu einer allgemeinen und automatisierten optischen Methode für die Echtzeit- ebenso wie die nachträgliche Verfolgung der Mausbewegungen, und zwar sowohl für kopffixierte als auch frei bewegliche Tiere. Das Air-Track-System und die Pixy-Bewegungsverfolgung sind zweckdienliche Einheitslösungen, die die Kombination von quantitativem natürlichen Verhalten mit nahezu jedem System zur Aufzeichnung und Manipulation der Hirnaktivität in einem Hirnforschungs-Labor ermöglichen. / Natural behavior occurs in multiple sensory and motor modalities and is dependent on sensory feedback that constantly adjusts behavior. To investigate the underlying neuronal correlates of natural behavior, it is useful to have access to state-of-the-art recording equipment that frequently requires head-fixation. This limitation has been addressed with various approaches such as virtual reality with air ball or treadmill systems. However, these systems have several disadvantages. Here we developed a novel tool, the Air-Track system, an easy to build, head-fixed behavioral environment that requires only minimal computational processing. The Air-Track is a lightweight, physical maze floating on an air table that has all the properties of the “real” world, including multiple sensory modalities tightly coupled to motor actions. To test this system, we trained mice in Go/No-Go and two-alternative forced choice tasks. A custom-controlled camera system monitored animal location, and generated data that could be used to calculate reaction times in the visual and somatosensory discrimination tasks. To track the motion of the Air Track system we developed a “Pixy” tracking system based on an off-the-shelf camera system (Pixy). We then expanded the development into a generalized and automated optical method for real-time and post-hoc tracking of mice motor behavior in both head-fixed and freely moving conditions. Air-Track and Pixy-Tracking systems are convenient “one-size-fits-all” solutions that facilitate the combination of quantitative natural behavior with virtually any system for monitoring or manipulating brain activity in a neuroscience laboratory.

Peptide aus intrazellulären Pathogenen sowie Tumorantigene aus mutierten oder überexprimierten Proteinen werden MHC I-restringiert auf der Oberfläche von Mammaliazellen präsentiert und dabei von cytotoxischen T-Lymphozyten erkannt. Die Peptidgenerierung erfolgt vorwiegend durch das Ubiquitin/26S Proteasomensystem, das eine zentrale Rolle bei der antitumoralen Immunantwort spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Polyepitopvakzine in Form von Plasmid-DNA entwickelt und auf ihre Effizienz untersucht. Als Modellantigen diente MUC1, ein von verschiedenen Adenokarzinomen und hämatologischen Tumoren überexprimiertes Glykoprotein. Ein aus dem MUC1-Protein bekanntes HLA-A2.1-abhängiges Epitop wurde als Polyepitop in verschiedenen Variationen synthetisiert, einer 20S proteasomalen in vitro Degradation unterzogen und seine Verdauprodukte massenspektrometrisch analysiert. Als optimale Sequenz für die Prozessierung des Polyepitops in die gewünschten Einzelepitope erwies sich deren einfache Verknüpfung ohne intervenierende Sequenzen. Zur Untersuchung des Effekts einer Ubiquitinfusion auf die Stabilität des MUC1-Polyepitops wurden anschließend verschiedene Strategien der linearen Fusion von Ubiquitin an das Polyepitop innerhalb eines Plasmids getestet. Durch transiente Transfektion der Plasmide konnte die Stabilität ihrer Translationsprodukte mittels Immunoblotanalysen quantifiziert werden. Die Ergebnisse demonstrieren, daß das Polyepitop durch die N-terminale Fusion von Wildtyp-Ubiquitin am effizientesten degradiert wird, wobei eine Polyubiquitinierung nicht stattzufinden scheint. Die Auswertung der folgenden in vitro Cytotoxizitätsassays sowie der Immunisierungsstudien wurde durch die schwache Affinität des gewählten subdominanten MUC1-Epitops zum HLA-A2.1-Komplex beeinträchtigt. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer umfassenden Analyse intra- und extrazellulärer Vorgänge bei der Entwicklung einer Plasmidvakzine unter Verwendung subdominanter Epitope. / Peptides from intracellular pathogens as well as tumor antigens from mutated or overexpressed proteins are presented in an MHC class I restricted manner on the surface of mammalian cells and are thereby recognized by cytotoxic T lymphocytes. Peptide generation is mainly carried out by the ubiquitin/26S proteasome system which plays a crucial role in the antitumor immune response. In the present study, a polyepitope vaccine was generated in the form of plasmid DNA and analyzed for its efficiency. As model antigen MUC1, a glycoprotein overexpressed in various adenocarcinomas and hematological tumors, was used. A known HLA-A2.1 restricted epitope from the MUC1 protein was synthesized as a polyepitope in different variations, subjected to a 20S proteasomal in vitro degradation, and its digestion products were analyzed by means of mass spectrometry. The optimal sequence for the processing of the polyepitope into the desired single epitopes was shown to be their simple conjunction without spacer sequences. Different strategies of linear fusion of ubiquitin to the polyepitope within a plasmid were subsequently tested to analyze the effect of ubiquitin fusion on the stability of the MUC1 polyepitope. After transient transfection of the plasmids, the stability of their translation products was quantified by means of immunoblot analyses. The results demonstrate that the polyepitope is degraded most efficiently through N-terminal fusion of wild type ubiquitin, while a polyubiquitination does not seem to occur. The evaluation of the subsequent in vitro cytotoxicity assays and immunization studies was impaired by the low affinity of the selected subdominant MUC1 epitope to the HLA-A2.1 complex. The present study emphasizes the importance of an extensive analysis of intra- and extracellular processes when generating a plasmid vaccine using subdominant epitopes.

Ein charakteristisches Merkmal des humoralen Immunsystems ist die Produktion vieler verschiedener Antikörper. Geläufige diagnostische Tests für den Nachweis von Krankheit-spezifischen Serumantikörpern nutzen Antigene zum Nachweis der Krankheit via Antikörperbindung. Derartige diagnostische Tests setzen jedoch die Kenntnis von Krankheit-spezifischen Antigenen voraus. Die vorliegende Arbeit berücksichtigt die unterschiedlichen Bindungsreaktivitäten ganzer Antikörperrepertoires verschiedener Gruppen von Individuen. Dazu werden die Serumantikörperbindungen gegenüber Zufallsbibliotheken gemessen. Die Moleküle dieser beliebigen Bibliotheken müssen keine Verwandtschaft zu den Antigenen der Krankheit haben. Mit modernen Herstellungsverfahren von Peptidarrays auf Glasträgern können mit einmal synthetisierten Peptiden hunderte von Träger-Replikas produziert werden. Die Suche nach hochaffinen Bindern zur Diagnose von Krankheiten mit unbekannten Antigenen oder mit Kreuzreaktivitäten zwischen gesunden und kranken Individuen könnte überflüssig werden. Gestützt auf die beschriebenen Voraussetzungen zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Messung von Serumantikörper-Bindungen gegenüber Peptidbibliotheken mit zufälligen Sequenzen die Unterscheidung zwischen Gruppen von gesunden und kranken Individuen für unterschiedliche Krankheiten ermöglicht. Eine unerwartet kleine Anzahl von Peptiden ist ausreichend für eine zuverlässige Vorhersage der untersuchten Gruppen. Der unvoreingenommene Ansatz ermöglicht eine ebenso gute Unterscheidung von gesund und krank, wie sie auch mit voreingenommenen Bibliotheken gezeigt worden sind. Wir vermuten, dass der vorliegende Ansatz ein wichtiger Schritt in Richtung zuverlässiger Diagnose darstellt, insbesondere für Krankheiten mit noch unbekannten Antigenen. Ausserdem bietet die hohe Spezifizität der Detektone und deren kleinen Mitgliederzahl eine Grundlage für die gleichzeitige Diagnose von verschiedenen Krankheiten auf einem einzigen Peptid-Mikroarray. / A characteristic trait of the humoral immune system is the production of lots of different antibodies. Commonly used diagnostic tests for the detection of disease-specific serum-antibodies successfully exploit these antibody reactivities against disease eliciting antigens. Such diagnostic tests do however need the knowledge of disease specific antigen as a prerequisite. The presented work looks at the binding reactivities of whole antibody repertoires of different groups of individuals. Therefore the binding of serum-antibodies are measured against arbitrary probe molecule libraries. The arbitrary molecules of such libraries do not need to be related to the antigens of the disease to be diagnosed. Modern synthesis and printing processes of peptides on glass chips arrays allow the production of hundreds or peptide-chip replicas with small amounts of uniquely synthesized peptides. The search for high-affinity binders for the diagnosis of diseases with no known antigens might become redundant. Based on the described premises the presented work demonstrates the differentiation of different diseases by means of antibody serum reactivity differences towards arbitrary peptide libraries between healthy and diseased individuals. The number of peptides necessary for reliable prediction of the investigated groups of individuals are unanticipated small. The unbiased approach of the library design works as well as it possibly could with intended libraries, like whole-proteome arrays, used in recent other works. We presume our approach to be an important step forward towards reliable diagnosis, in particular for diseases caused by yet unknown antigens. Furthermore, the high specificity of the detectons and their smallness in size might provide a basis for simultaneous diagnosis of various diseases on a single peptide microarray.

Die Huntington''sche Krankheit (Huntington''s disease, HD) ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung mit einem extensiven Verlust von Neuronen im Striatum. Die Ursache für HD ist eine genetische Mutation, bei der eine CAG-Wiederholungssequenz verlängert wird. Im resultierenden Protein, das Huntingtin (htt) genannt wurde, diese Mutation führt zur Missfaltung und Aggregation von htt. Ich habe untersucht ob die Bildung von htt-Aggregaten die Transkription von Genen dass sie von HD-assoziierten Transkriptionsfaktoren kontrolliert werden, verändert. Zur Untersuchung der Transkription wurden die zu untersuchenden Gene auf cDNA-Mikroarrays aufgebracht und mit RNA, welche aus den Zellen nach der Induktion der Expression des mutierten htt gewonnen wurde, hybridisiert. Es wurden keine systematischen Veränderungen innerhalb der durch spezifische Transkriptionsfaktoren regulierten Gengruppen gefunden. Ich habe auch mehrere mathematische Modelle erstellt, welche die htt-Aggregation und den Zelltod beschreiben. Die Ergebnisse zeigten, dass eine transiente Dynamik im System und die nicht-monotone Reaktion auf Parameteränderungen zu den nicht-intuitiven Ergebnissen bei Behandlungsansätzen, welche die htt-Aggregation beeinflussen, führen könnten. Für den Fall, dass Aggregate die toxische Form von htt sind, zeigten die numerischen Simulationen dass das Einsetzen der Aggregation, welches durch ein Überschießen der Aggregatkonzentration gekennzeichnet ist, am ehesten zum Zelltod führt. Dieses Phänomen wurde "one-shot"-Modell genannt. Es gibt, auch bei HD-Patienten mit gleicher Länge der CAG-Wiederholungssequenz, eine große Varianz des Alters bei Krankheitsausbruch (age of onset, AO). Ich habe ein stochastisches Modell für den neuronalen Zelltod im Striatum entwickelt. Das Modell zeigte, dass ein signifikanter Anteil der nicht erklärbaren Varianz des AO der intrinsischen Dynamik der Neurodegeneration zugeschrieben werden kann. / Huntington''s disease (HD) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by a progressive neuronal loss in the striatum of HD patients. HD is caused by a CAG repeat expansion which translates into a polyglutamine stretch at the N-terminus of the huntingtin protein (htt). The polyQ stretch induces misfolding, cleavage and aggregation of htt. To test the hypothesis that the sequestration of transcription factors into the htt aggregates causes transcriptional changes observed in HD models, I compiled lists of genes controlled by the transcription factors associated with HD. These genes were spotted on cDNA microarrays that were later hybridized with RNA extracted from cells expressing a mutant htt fragment. In this study, no systematic changes related to a specific transcription factors were observed. Formation and the accumulation of htt aggregates causes neurotoxicity in different HD model systems. To investigate the consequences of therapeutic strategies targeting aggregation, I derived several mathematical models describing htt aggregation and cell death. The results showed that transient dynamics and the non-monotonic response of cell survival to a change of parameter might lead to the non-intuitive outcome of a treatment that targets htt aggregation. Also, the numerical simulations show that if aggregates are toxic, the onset of aggregation, marked by the overshoot in the concentration of aggregates, is the event most likely to kill the cell. This phenomenon was termed a one-shot model. The principal cause of the variability of the age at onset (AO) is the length of the CAG repeat. Still, there is a great variance in the AO even for the same CAG repeat length. To study the variability of the AO, I developed a stochastic model for clustered neuronal death in the HD striatum. The model showed that a significant part of the unexplained variance can be attributed to the intrinsic stochastic dynamics of neurodegeneration.

Interaktionen zwischen Zellen sowie deren Aktivierung werden im Immunsystem durch verschiedene Zelloberflächenmoleküle reguliert. Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des kürzlich identifizierten Rezeptor-Ligand-Paares BTLA und HVEM. Zunächst wurden diverse BTLA-spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit deren Hilfe erstmals die Lokalisation BTLA-tragender Zellen im Gewebe gezeigt werden konnte. Bei umfassenden Expressionsanalysen fiel auf, dass BTLA auf nahezu allen Leukozytenpopulationen der lymphatischen Organe konstitutiv vorhanden ist, und mit seinem Liganden HVEM koexprimiert wird. Beide Moleküle werden auf verschiedenen Zellpopulationen differenziell exprimiert und aktivierungsabhängig reguliert. Funktionelle Analysen in vitro als auch in vivo ergaben, dass die BTLA-HVEM-Interaktion durch Suppression der T-Zellaktivierung und –proliferation wesentlich zur negativen Regulation der Immunantort beiträgt. Die negative Wirkung von BTLA zeigte sich sowohl bei der Initiation als auch bei bereits fortgeschrittener Aktivierung, unabhängig von der Beteiligung positiver kostimulatorischer Signalwege. Durch Stimulation von T Zellen mit unterschiedlicher BTLA-Oberflächenexpression (verschiedene Subpopulationen oder aus transgenen Mäusen) konnte die strikte Korrelation der negativen Funktion mit der BTLA-Menge auf den Zellen gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass BTLA essentiell für die HVEM-vermittelte Suppression ist und eine wesentliche Beteiligung weiterer HVEM-Interaktionspartner (z.B. CD160) nicht vorliegt. Die Beobachtung von veränderten Lymphozytenpopulationen in BTLA-transgenen Mäusen im Ruhezustand weist zudem auf einen zentralen Beitrag des negativen BTLA-Signals zur Aufrechterhaltung der Homöostase hin. Die ubiquitäre Expression von HVEM und BTLA in Kombination mit der gegenseitigen Modulation beider Interaktionspartner ermöglicht eine flexible Reaktion des Immunsystems auf äußere Einflüsse unter anderem über die negative Regulation durch BTLA / Activation of immune cells is regulated by various cell surface molecules during cell-cell interactions. The aim of this work was the characterization of the recently identified receptor-ligand-pair BTLA and HVEM. Initially, several BTLA-specific monoclonal antibodies were generated. With these antibodies, the localization of BTLA expressing cells in the tissues has been determined for the first time. Further detailed flow cytometric analysis revealed a strong constitutive expression of BTLA on nearly all leukocytes in lymphoid organs. Interestingly, all BTLA-expressing cells co-expressed its ligand HVEM. However, both molecules were differentially expressed on different cell populations in the steady state, but were also regulated in an activation-dependent way. Functional analyses in vitro and in vivo (in an antigen-specific adoptive transfer system) revealed a substantial contribution of the BTLA-HVEM interaction for negative regulation of immune responses by suppressing T cell activation and proliferation. Inhibitory signals of BTLA affect the initial and ongoing activation, irrespective of simultaneous positive signals from other co¬stimulatory pathways. Using wildtype and BTLA-transgenic primary T cells, a strictly linear relationship between the inhibitory function of BTLA and its cell surface levels was observed. The data clearly demonstrate that BTLA expression determined the strength of HVEM-mediated suppression, but also that BTLA is essential for this negative co-stimulation, whereas other HVEM-interaction partners were apparently not involved. Finally, the observed changes in lymphoid cell populations of the BTLA-transgenic mice even in the resting state indicate a prominent role for negative BTLA signals to maintain homeostasis. The ubiquitous expression of HVEM and BTLA together with the reciprocal modulation of both interaction partners supports flexible reaction and regulation of the immune system particularly via the inhibitory function of BTLA.