Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Cássia Maria Barroso Orlandi / Banca: Ian Martin / Resumo: Células-tronco embrionárias (CTEs) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna, obtidas de blastocistos pré-implantados. Devido à sua pluripotência podem se diferenciar nos derivados das três camadas germinativas, endoderma, ectoderma e mesoderma, tanto in vitro como in vivo. O objetivo deste trabalho foi isolar e cultivar células da MCI de blastocistos equinos frescos e refrigerados, e caracterizar o cultivo destas células por meio da expressão dos marcadores Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Para tal foram utilizadas 10 éguas, das quais foram obtidos 40 embriões, divididos em dois grupos, sendo o Grupo 1 de embriões frescos, totalizando 26 embriões, e o Grupo 2 de embriões refrigerados, totalizando 14 embriões. No grupo 1 de embriões frescos, 73,1% das MCIs aderiram à monocamada dois dias após o cultivo, 65,4% mantiveram-se aderidas 4 dias após o cultivo, 19,2% foram submetidas à primeira passagem e nenhuma foi submetida à segunda passagem. Já no Grupo 2 de embriões refrigerados, 85,7% das MCIs aderiram á monocamada 2 dias após o cultivo, 85,7% das células permaneceram aderidas à monocamada 4 dias após o cultivo, 21,4% foram submetidas à primeira passagem, e 7,1% à segunda passagem. As colônias de CTEs equinas obtidas de embriões frescos foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Já as colônias de CTEs obtidas de embriões refrigerados foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4. As células da MCI quando isoladas dos blastocistos equinos frescos e refrigerados, foram capazes de formar colônias semelhantes à colônias de CTEs. Quando cultivadas sobre monocamada de fibroblastos equinos e inativadas com Mitomicina C, apresentaram crescimento celular e foram capazes de formar colônias de CTEs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Embryonic stem cells are pluripotent cells, derived from inner cell mass, obtained from pre-implanted blastocysts. Because of their pluripotency, they can differentiate into derivatives of three germ layers, endoderm, ectoderm and mesoderm, both in vitro as in vivo. The aim of this study was to isolate and culture inner cell mass (ICM) cells from fresh and cooled equine blastocysts and characterize stem cells culture obtained from fresh and cooled equine embryos, by the expression of pluripotency markers as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. For this, 10 mares were used, from which were obtained 40 embryos, divided into two different groups, Group 1 from fresh embryos, with a total of 26 embryos, and Group 2 from cooled embryos, with a total of 14 embryos. In Group 1 of fresh equine embryos, 73,1% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 65,4% maintained adhered four days after culture, 19,2% were submitted to first passage and none were submitted to second passage. Whereas in the Group 2 of cooled embryos, 85,7% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 85,7% maintained adhred to the monolayer 4 days after culture, 21,4% were submitted to first passage and 7,1% to second passage. The equine embryonic like-stem cells obtained from fresh embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. While the embryonic like-stem cells obtained from cooled embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4. The ICM cells when isolated from fresh and cooled equine blastocysts were capable to form embryonic stem cells-like colonies. When they were cultured under an equine fibroblasts monolayer and inactivated with Mitomycin C, showed cellular development and were able to form colonies. Equine embryonic... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Marcelo Rezende Luz / Banca: Maricy Apparício Ferreira / Resumo: Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / Abstract: The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / Doutor

Uma das maiores dificuldades das terapias de reprodução assistida é a seleção de células germinativas de boa qualidade para posterior fertilização e implantação. Atualmente, a seleção de oócitos se dá basicamente por avaliação morfológica, que não reflete satisfatoriamente a competência oocitária. Assim, a busca por bioindicadores da qualidade oocitária é necessária. O cumulus oophorus forma um conjunto de células somáticas que circundam o oócito no folículo antral,mantendo uma relação íntima com a célula germinativa, com comunicação direta via junções tipo GAP. As células do cumulus oophorus são descartadas após técnicas de fertilização in vitro, o que as torna um material de fácil acesso, livre de conflitos éticos. Uma série de metodologias de análise das células do cumulus foram propostas para identificação de anormalidades no oócito. Porém, nenhuma delas é rotineiramente utilizada na clínica. Os processos celulares das células do cumulus refletem as condições do microambiente folicular, e podem, assim, trazer evidências das condições oocitárias. Nosso grupo analisou as células do cumulus primeiramente por meio de abordagens de bioinformática, que revelaram processos celulares relacionados ao desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto. Com base nestes resultados, análises de parâmetros bioquímicos e expressão gênica das células do cumulus foram realizadas e permitiram a identificação de possíveis biomarcadores da qualidade do oócito que levam em consideração as características clínicas das pacientes. Estas análises indicaram que expressão do gene PTGS2 e a atividade da enzima Glutationa-S-Transferase como indicadores da formação de blastocistos em pacientes com diferentes variáveis clínicas (backgrounds) analisados. Se confirmados, estes parâmetros poderão ser utilizados como biomarcadores no ambiente clínico, elevando as taxas de sucesso em técnicas de reprodução assistida. / One of the great challenges in assisted reproduction techniques is the selection of appropriate germ cells for fertilization and implantation. Nowadays, oocyte selection occurs basically through morphological evaluation, which does not reflect satisfactorily the oocyte competence. Therefore, the search for bioindicators of oocyte quality is necessary. The cumulus oophorus forms a set of somatic cells that surround the oocyte in the antral follicle, participating in the processes of oocyte maturation and folliculogenesis. These cells maintain an intimate relationship with the germ cell, with direct communication via GAP junctions. Cumulus oophorus cells are discarded in in vitro fertilization techniques, which makes them an easy-access material that can be collected in a free-of-ethicalissues way. A series of cumulus cell analysis methodologies were proposed to identify abnormalities in the oocyte. However, none of them is routinely used in clinical environment. The cellular processes of cumulus cells reflect the conditions of the follicular microenvironment, and may thus bring evidences of oocyte conditions. Our group analyzed cumulus cells in search of predictors of oocyte quality primarily through bioinformatics approaches, which revealed cellular processes related to the development of embryos up to the blastocyst stage. Based on these results, analyzes of biochemical parameters and gene expression of cumulus cells were performed and allowed the identification of possible biomarkers of oocyte quality that takes into consideration patients clinical variables. These analysis indicated PTGS2 expression and Glutathione-S-Transferase activity as indicators of blastocyst formation in all patient profiles (backgrounds) analyzed. If confirmed, these parameters may be used as biomarkers in clinical environment, improving assisted reproduction success rates.

O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e α6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e α6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e α6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de α66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e α6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e α6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and α6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and α6-integrin was detected by PCR. CD9 and α6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and α6-integrin product was similar to human and equine α6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and α6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and α6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T13:30:03Z No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 1957296 bytes, checksum: 29394666e22c25c01e78f33c22873af2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:37:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 1957296 bytes, checksum: 29394666e22c25c01e78f33c22873af2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:37:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 1957296 bytes, checksum: 29394666e22c25c01e78f33c22873af2 (MD5) Previous issue date: 2009-03-09 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Embriões produzidos in vivo e in vitro apresentam diferenças morfológicas e de desenvolvimento as quais podem ser influenciadas pelo de cultivo. Além disso, existem poucos estudos mostrando o efeito do ambiente in vitro sobre os embriões provenientes de diferentes raças bovinas como, por exemplo, Gir (Bos indicus) e Holandesa (Bos taurus). Alguns genes importantes para a formação, sobrevivência e posterior desenvolvimento de embriões bovinos podem ter seu padrão de expressão influenciado por diversos fatores relacionados ao sistema de produção e a raça. O objetivo deste estudo foi avaliar a abundância relativa de transcritos relacionados ao transporte de água e solutos (Aquaporinas), formação da blastocele (Na/KATPases), apoptose (BAX) e resposta a estresse celular (Peroxiredoxina 1) em blastocistos bovinos das raças Gir e Holandesa produzidos in vivo e in vitro para identificar efeitos de sistema de produção e/ou raça. Para cada grupo (Gir-in vivo; Gir-in vitro; Holandês-in vivo; Holandês-in vitro), blastocistos (n=15) divididos em três conjuntos foram utilizados para a extração do RNA, amplificação, e transcrição reversa. Os cDNAs obtidos foram submetidos à PCR em Tempo-Real, utilizando o gene H2a como controle endógeno, e analisados pelo software REST©. Na avaliação de efeito do sistema de produção para a raça Gir, a expressão relativa do gene PRDX1 apresentou-se sub-regulada (p<0,01) assim como nos genes Na/KATPase-β2 e BAX (p<0,05), enquanto os genes AQP3, AQP11 e Na/K-ATPase-α1 não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) nas amostras de embriões produzidos in vitro comparados com embriões in vivo. Na raça Holandesa, a expressão relativa do gene BAX apresentou-se sobre-regulada (p<0,01), enquanto o gene Na/K-ATPase-β2 apresentou uma tendência a sub-regulação (p=0,06) e os genes AQP3, AQP11, Na/K-ATPase-α1, PRDX1 não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) nas amostras de embriões produzidos in vitro comparados com embriões in vivo. Quando a produção in vivo foi avaliada entre as raças, os embriões da raça Holandesa apresentaram os genes AQP3, Na/K-ATPase-α1, PRDX1, e BAX sub-regulados (p<0,05), enquanto os genes Na/K-ATPase-β2 e AQP11 não demonstraram diferenças significativas na expressão (p>0,05) quando comparados com embriões da raça Gir. Para a produção in vitro, apenas o gene BAX apresentou-se sobre-regulado (p<0,05) nos embriões da raça Holandesa quando comparados com embriões da raça Gir. Com base nestes resultados podese concluir que, para os genes avaliados, existem diferenças na expressão gênica inerentes às raças observadas nos embriões produzidos in vivo e que o sistema de produção in vitro pode influenciar a expressão gênica, atenuando estas variações. A avaliação de outros transcritos é necessária para uma melhor compreensão dos efeitos relacionados aos processos de produção de embriões bovinos em diferentes raças. / Embryos produced in vivo and in vitro show morphological and developmental differences, which can be influenced by culture environment. Nevertheless, there are few studies showing the effect of in vitro environment on embryos from different bovine breeds, such as Gyr (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus). Some important genes associated to formation, survival and subsequent development of bovine embryos can be affected by various factors related to the production system and breed. The aim of this study was to evaluate the relative abundance of transcripts associated to water transport (Aquaporins), blastocoel formation (Na/K-ATPases), apoptosis (BAX) and response to cellular stress (Peroxiredoxin 1) in bovine blastocysts from Gyr and Holstein breed produced in vivo and in vitro to identify breed and/or production system effects. For each group (Gyr-in vivo; Gyr-in vitro; Holstein-in vivo; Holstein-in vitro), blastocysts (n=15) distributed in 3 pools were used for RNA extraction, followed by RNA amplification and reverse transcription. The cDNAs obtained were submitted to Real-Time PCR, using the H2a gene as endogenous control, and analyzed with REST software©. For the production system in the Gyr embryos, the relative expression of PRDX1 gene was down-regulated (p<0.01) as well as Na/K-ATPase-β2 and BAX genes (p<0.05), and the AQP3, AQP11 and Na/K-ATPase-α1 genes were not significantly different (p>0.05) when in vitro embryos were compared with in vivo produced ones. In Holstein embryos, BAX was up-regulated in in vitro embryos (p<0.01), while AQP3, AQP11, Na/K-ATPaseα1, Na/K-ATPase-β2 and PRDX1 genes were not significantly different (p>0.05) from in vivo produced embryos. When the breed effect was evaluated, Holstein in vivo produced blastocysts presented AQP3, Na/K-ATPase-α1, PRDX1, and BAX genes down-regulated (p<0.05) while Na/K-ATPase-β2 and AQP11 genes were not significantly different (p>0.05) from Gyr embryos. For the in vitro produced embryos, only Bax was up-regulated (p<0.05) in Holstein embryos compared with Gyr embryos. Based on those results, for the evaluated genes, it is possible to conclude that are inherent breed differences in gene expression observed in in vivo produced embryos and that the in vitro production system influences in the relative expression in both breeds, attenuating the inherent breed differences. Other genes should be evaluated for a better understanding of these breeds differences.

Neste estudo foi analisada a expressão gênica e protéica, uterina e embrionária da quimiocina Ccl25 e de seu receptor Ccr9 nas fases iniciais da implantação embrionária (dias 3,5, 4,5, 5,5 e 7,5 de gestação). Por meio de reações imunohistoquímicas e de citometria de fluxo, foram identificadas as populações celulares envolvidas nesta expressão. Também, foram realizados ensaios de quimiotaxia com o silenciamento da expressão de Ccl25 (ODNs-Antisense) nas células trofoblásticas, para a avaliação das atividades desta quimocina. Nossos resultados sugerem o estabelecimento de uma comunicação embrião (células trofoblásticas) - endométrio (células do sistema immunológico), via Ccl25/Ccr9. Esses achados são relevantes para a compreensão das interações blastocisto/sistema immunológico materno no estabelecimento dos mecanismos imunoreguladores durante a implantação embrionária. / In this study, we analyzed the gene and protein, uterine and embryonic expression of Ccl25 chemokine and its receptor Ccr9 in early stages of embryo implantation (days 3.5, 4.5, 5.5 and 7.5 of gestation). By using immunohistochemistry and flow cytometric assays, cell populations involved in this expression were identified. In addition, chemotaxis assays were also performed after silencing of Ccl25 (ODNs-antisense) in trophoblast cells. . Our results suggest the establishment of an endometrium (immune cells) - embryo (trophoblast cells) dialogue via Ccl25/CCR9. These findings are relevant for understanding the interactions between blastocyst and maternal immune system in the establishment of immunoregulatory mechanisms during implantation.

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: Embora estágios iniciais de embriões de mamíferos tenham aparentemente uma grande plasticidade, eles, assim como o oócito em maturação, são bastante sensíveis a estresses exógenos. Responder a esses estresses é uma parte vital da fisiologia celular. Cada vez mais é aparente que um dos principais mecanismos, para iniciar a resposta celular a uma variedade de estressores exógenos, reside no retículo endoplasmático (RE). O RE é uma importante organela responsável pela síntese, processamento e transporte de proteínas e lipídeos. No entanto e in vitro, a perturbação do microambiente do RE pode causar alterações na estrutura das proteínas levando ao acúmulo de proteínas com o incorreto dobramento, uma condição denominada estresse do RE. Dependendo da intensidade do estresse, o RE pode desencadear a apoptose pela Unfolded Protein Response. Em várias espécies, estudos observaram uma melhoria da competência do oócito e no desenvolvimento do embrião quando foram adicionados inibidores do estresse do RE no meio de maturação e/ou meio de cultivo in vitro (CIV). Dentre os inibidores do estresse do RE, o ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) se mostrou benéfico na produção in vitro de embriões. Entretanto, pouco é conhecido sobre o seu efeito na maturação oocitária e no desenvolvimento do embrião bovino in vitro. Portanto, os objetivos gerais desta Tese foram: Capítulo 1 - investigar o efeito da adição de TUDCA durante a maturação in vitro (MIV) sobre a competência do oócito e do embrião [ma... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Although early stages of mammalian embryos appear to retain great plasticity, they and maturing oocytes are quite sensitive to exogenous stresses. Responding to those stresses is a vital part of cellular physiology, and it is increasingly apparent that one of the main mechanisms for initiating that response is based on the endoplasmic reticulum (ER). ER is an important organelle responsible for the synthesis, processing, folding and transport of proteins and lipids. However, in vitro, the disturbance of the ER microenvironment can cause changes in the structure and folding of proteins leading to the accumulation of misfolding proteins, a condition called ER stress. Depending on the intensity of the stress, the ER can trigger apoptosis by Unfolded Protein Response. In several species, studies have reported an improvement in oocyte and embryo competence when ER stress inhibitors have been added to the in vitro maturation (IVM) medium and/or in vitro culture (IVC) medium. Among the ER stress inhibitors, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) has been shown to be beneficial in in vitro embryo production. However, little is known about TUDCA’s effect on oocyte maturation and the development of bovine embryo in vitro. Therefore, the main objectives of this Thesis were: Chapter 1 - to investigate the effect of adding different TUDCA concentrations during IVM on the oocyte and embryo competence [nuclear maturation, mitochondrial activity, reactive oxygen species (ROS) production, pronucle... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

La congelación de espermatozoides es una técnica que supuso un importante paso para el desarrollo de la reproducción asistida. Esta es una técnica habitual y fundamental en las clínicas de reproducción que ha permitido lograr mejores resultados en las técnicas de reproducción asistida. A pesar de sus ventajas, durante la congelación, el espermatozoide sufre un gran número de alteraciones que dan lugar a la pérdida de función en el espermatozoide debido principalmente a: las bajas temperaturas a las que son sometidos, la cristalización de agua intracelular y los cambios osmóticos como consecuencia de la entrada y salida de crioprotector. Debido a los daños que se han observado, se está comenzando a desarrollar otro tipo de congelación ultrarápida llamada vitrificación, en la que los efectos que produce la entrada y salida de crioprotectores y los cambios de osmolaridad se ven disminuidos. Esta vitrificación es una técnica que consiste en el uso de crioprotectores diferentes y en un descenso de temperaturas brusco. Los primeros ensayos que se llevaron a cabo no resultaron exitosos debido a la poca tolerancia que presentan los espermatozoides a las altas tasas de crioprotector de las que se partieron. Ensayos posteriores en los que se reducía la concentración de crioprotector, se eliminaba el crioprotector permeable y la vitrificación se hacía mediante la aplicación directa de la solución espermática dentro de nitrógeno permitieron obtener mejores resultados. Es por ello que nos propusimos hacer un estudio en tres fases: una primera fase donde se realizara una valoración general de la congelación lenta y buscar un conjunto de biomarcadores útiles para la evaluación del criodaño. Posteriormente una segunda fase, en la que se realizó un estudio comparativo entre la congelación lenta y la vitrificación espermática, testando los biomarcadores elegidos en fase primera. Y, por último, en la tercera fase, un ensayo comparativo dentro de un ciclo de reproducción asistida donde la mitad del ciclo fuera fecundado con espermatozoides congelados y la otra mitad con espermatozoides vitrificados. Los resultados generales obtenidos mostraron que tras la congelación de muestras nomozoospérmicas y de baja calidad hay un conjunto de biomarcadores que dependen del estado inicial de la muestra y otros que dependen de la técnica de congelación. Que además se recomienda incluir en el estudio básico de la muestra seminal la fragmentación del ADN, el daño en el citoesqueleto y en el acrosoma, ya que son indicadores del criodaño. Que la nueva técnica de vitrificación permite criopreservar mejor las muestras seminales que la técnica de congelación lenta. Y que es seguro aplicar la técnica de vitrificación dentro de los ciclos de TRA, ya que se obtienen fecundaciones, desarrollos y niños nacidos normales. / Cátedra Human Fertility, Ivf Spain Foundation

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição crônica à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana e o desenvolvimento embrionário inicial. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar diferentes metodologias utilizadas para a coloração diferencial das linhagens celulares do blastocisto, um método mais adequado para a avaliação de sua qualidade e normalidade. As células de blastocistos intactos de camundongo obtidos através de fertilização in vitro (FIV) foram permeabilizadas e coradas utilizando-se diferentes concentrações de um detergente (TX-100; 0,5% ou 1%) e de iodeto de propídeo (IP; 50 g/mL ou 100 g/mL) e depois disso, incubadas durante a noite em uma solução contendo diferentes fixadores (etanol, metanol, paraformaldeído PFA1% ou 4%) e bisbenzimida. Para a avaliação da qualidade de coloração e contagem diferencial dos núcleos, os blastocistos foram montados em lâminas de vidro e analisados em um microscópio de epifluorescência. O escore de qualidade de coloração foi significativamente diferente (p<0,05) entre todas as soluções fixadoras, sendo maior para o etanol, seguido pelo metanol, PFA1% e PFA4%. Mudanças da concentração do IP e o uso de diferentes soluções de fixação revelaram efeitos significativos na contagem de células da massa celular interna (MCI) e na razão MCI/trofectoderma (TE). Concentrações diferentes do detergente utilizado para a permeabilização celular apresentaram efeitos significativos sobre a contagem de células TE e razão MCI/TE. Concluímos que o protocolo que utiliza TX-100 1% para a permeabilização celular, 50 g/mL de IP para coloração das células TE e etanol como solução de fixação representa o método mais eficiente para a coloração diferencial e contagem das células das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. No segundo projeto que compõe esta, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pós-natal ao ar ambiente sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de seis semanas tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré- e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante nove semanas. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos, razão sexual, resposta ovariana à estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e TE. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre a FIV, o desenvolvimento embrionário e a coloração diferencial dos blastocistos foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. Nenhuma diferença na contagem celular total foi observada. Baseando-se nessas observações, nosso estudo sugere que a exposição ao material particulado fino presente no ar ambiente de um grande centro urbano pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. Finalmente, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi de avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pósnatal ao ar ambiente no final da vida reprodutiva sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de cinco meses tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante seis meses. Os pontos de avaliação reprodutivos foram os mesmos que aqueles utilizados no segundo projeto. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre coloração diferencial dos blastocistos, mas não sobre a FIV e o desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular do TE dos blastocistos produzidos no protocolo FA-FA foi significativamente menor do que aquela em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular total foi similar entre os grupos. Nosso estudo sugere que a exposição à poluição ambiental particulada de um grande centro urbano não altera a função ovariana, mas pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina no período final do menacme, através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of chronic exposure to particulate air pollution on ovarian function and early embryo development. The objective of the first project was to assess different methodologies used in cell lineage differential staining of the blastocyst, a method for more accurate evaluation of its quality and normality. Cells of zona-intact mouse blastocysts obtained from in vitro fertilization (IVF) were permeabilized and stained using different concentrations of a detergent (TX-100; 0.5% or 1%) and propidium iodide (PI; 50 g/mL or 100 g/mL) followed by overnight incubation in a solution containing different fixatives (ethanol, methanol, paraformaldehyde - PFA 1% or 4%) and bisbenzimide. To evaluate the staining quality and count the nuclei differentially, blastocysts were mounted and viewed using epifluorescence microscopy. Staining quality scores were significantly different (P < 0.05) among all fixative solutions with the highest for ethanol followed by methanol, PFA1%, and PFA4%. Changes in PI concentration and use of different fixative solutions revealed significant effects on inner cell mass (ICM) cell count and ICM/trophectoderm (TE) ratio. Different concentrations of the detergent used for cell permeabilization showed significant effects on TE cell counts and ICM/TE ratio. I concluded that the protocol using 1% TX-100 for cell permeabilization, 50 g/mL of PI for TE cell staining, and ethanol as a fixative solution is the most efficient method for cell lineage differential staining and counting at the blastocyst stage. In the second project the objective was to evaluate the effects of preand/ or postnatal exposure to ambient air on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the IVF mouse model. Six-week old superovulated mice were preand/ or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FAAA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 for nine weeks. Reproductive endpoints evaluated included gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, sex ratio, ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and TE. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient fine particulate matter on IVF, embryo development, and blastocyst differential staining was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. No difference in the total cell count was observed. Based on these observations the study suggests that exposure to ambient fine particulate matter in a large urban center may negatively affect female reproductive health by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, the purpose of the third project was to evaluate the effects of pre- and/or postnatal exposure to particulate air pollution on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts during the late-life reproductive period using the IVF mouse model. Five-month-old superovulated mice were pre- and/or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FA-AA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 during six months. Reproductive endpoints were the same as the ones selected for the second project. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient air on blastocyst differential staining but not on IVF and embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. Cell counts in TE cells in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly lower than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. The total cell count was similar among groups. This study suggests that exposure to particulate air pollution in a large urban center has no effect on ovarian function but may negatively affect female reproductive health in the late-life period by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição crônica à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana e o desenvolvimento embrionário inicial. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar diferentes metodologias utilizadas para a coloração diferencial das linhagens celulares do blastocisto, um método mais adequado para a avaliação de sua qualidade e normalidade. As células de blastocistos intactos de camundongo obtidos através de fertilização in vitro (FIV) foram permeabilizadas e coradas utilizando-se diferentes concentrações de um detergente (TX-100; 0,5% ou 1%) e de iodeto de propídeo (IP; 50 g/mL ou 100 g/mL) e depois disso, incubadas durante a noite em uma solução contendo diferentes fixadores (etanol, metanol, paraformaldeído PFA1% ou 4%) e bisbenzimida. Para a avaliação da qualidade de coloração e contagem diferencial dos núcleos, os blastocistos foram montados em lâminas de vidro e analisados em um microscópio de epifluorescência. O escore de qualidade de coloração foi significativamente diferente (p<0,05) entre todas as soluções fixadoras, sendo maior para o etanol, seguido pelo metanol, PFA1% e PFA4%. Mudanças da concentração do IP e o uso de diferentes soluções de fixação revelaram efeitos significativos na contagem de células da massa celular interna (MCI) e na razão MCI/trofectoderma (TE). Concentrações diferentes do detergente utilizado para a permeabilização celular apresentaram efeitos significativos sobre a contagem de células TE e razão MCI/TE. Concluímos que o protocolo que utiliza TX-100 1% para a permeabilização celular, 50 g/mL de IP para coloração das células TE e etanol como solução de fixação representa o método mais eficiente para a coloração diferencial e contagem das células das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. No segundo projeto que compõe esta, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pós-natal ao ar ambiente sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de seis semanas tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré- e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante nove semanas. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos, razão sexual, resposta ovariana à estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e TE. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre a FIV, o desenvolvimento embrionário e a coloração diferencial dos blastocistos foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. Nenhuma diferença na contagem celular total foi observada. Baseando-se nessas observações, nosso estudo sugere que a exposição ao material particulado fino presente no ar ambiente de um grande centro urbano pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. Finalmente, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi de avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pósnatal ao ar ambiente no final da vida reprodutiva sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de cinco meses tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante seis meses. Os pontos de avaliação reprodutivos foram os mesmos que aqueles utilizados no segundo projeto. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre coloração diferencial dos blastocistos, mas não sobre a FIV e o desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular do TE dos blastocistos produzidos no protocolo FA-FA foi significativamente menor do que aquela em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular total foi similar entre os grupos. Nosso estudo sugere que a exposição à poluição ambiental particulada de um grande centro urbano não altera a função ovariana, mas pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina no período final do menacme, através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of chronic exposure to particulate air pollution on ovarian function and early embryo development. The objective of the first project was to assess different methodologies used in cell lineage differential staining of the blastocyst, a method for more accurate evaluation of its quality and normality. Cells of zona-intact mouse blastocysts obtained from in vitro fertilization (IVF) were permeabilized and stained using different concentrations of a detergent (TX-100; 0.5% or 1%) and propidium iodide (PI; 50 g/mL or 100 g/mL) followed by overnight incubation in a solution containing different fixatives (ethanol, methanol, paraformaldehyde - PFA 1% or 4%) and bisbenzimide. To evaluate the staining quality and count the nuclei differentially, blastocysts were mounted and viewed using epifluorescence microscopy. Staining quality scores were significantly different (P < 0.05) among all fixative solutions with the highest for ethanol followed by methanol, PFA1%, and PFA4%. Changes in PI concentration and use of different fixative solutions revealed significant effects on inner cell mass (ICM) cell count and ICM/trophectoderm (TE) ratio. Different concentrations of the detergent used for cell permeabilization showed significant effects on TE cell counts and ICM/TE ratio. I concluded that the protocol using 1% TX-100 for cell permeabilization, 50 g/mL of PI for TE cell staining, and ethanol as a fixative solution is the most efficient method for cell lineage differential staining and counting at the blastocyst stage. In the second project the objective was to evaluate the effects of preand/ or postnatal exposure to ambient air on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the IVF mouse model. Six-week old superovulated mice were preand/ or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FAAA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 for nine weeks. Reproductive endpoints evaluated included gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, sex ratio, ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and TE. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient fine particulate matter on IVF, embryo development, and blastocyst differential staining was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. No difference in the total cell count was observed. Based on these observations the study suggests that exposure to ambient fine particulate matter in a large urban center may negatively affect female reproductive health by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, the purpose of the third project was to evaluate the effects of pre- and/or postnatal exposure to particulate air pollution on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts during the late-life reproductive period using the IVF mouse model. Five-month-old superovulated mice were pre- and/or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FA-AA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 during six months. Reproductive endpoints were the same as the ones selected for the second project. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient air on blastocyst differential staining but not on IVF and embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. Cell counts in TE cells in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly lower than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. The total cell count was similar among groups. This study suggests that exposure to particulate air pollution in a large urban center has no effect on ovarian function but may negatively affect female reproductive health in the late-life period by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage.