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[ES] El tratamiento de enfermedades neurológicas está muy limitado por la ineficiente penetración de los fármacos en el tejido cerebral dañado debido a la barrera hematoencefálica (BHE), lo que imposibilita mejorar la salud del paciente. La BHE es un mecanismo de protección natural para evitar la difusión de agentes potencialmente peligrosas para el sistema nervioso central. No obstante, la BHE se puede inhibir mediante ultrasonidos focalizados e inyección de microburbujas de forma segura, localizada y transitoria, una tecnología empleada mundialmente. La principal ventaja es su carácter no invasivo, siendo así muy atractiva y cómoda para el paciente. Normalmente, la zona cerebral enferma se trata en su parte central empleando un único foco. Sin embargo, enfermedades como el Alzheimer o el Parkinson requieren un tratamiento sobre estructuras de geometría compleja y tamaño elevado, situadas en ambos hemisferios cerebrales. Por tanto, la tecnología actual está muy limitada al no cumplir dichos requisitos. Esta tesis doctoral tiene como objetivo el desarrollo de una técnica novedosa, basada en hologramas acústicos, para resolver las limitaciones presentes en los tratamientos neurológicos empleando ultrasonidos. Se estudian las lentes acústicas holográficas impresas en 3D, que acopladas a un transductor mono-elemento, permiten el control preciso del frente de onda ultrasónico tanto para (1) compensar las distorsiones que sufre el haz hasta alcanzar el cerebro, como (2) focalizarlo simultáneamente en regiones múltiples y de geometría compleja o formando de vórtices acústicos, proporcionando así efectividad en tiempo y coste. Por ello, la investigación desarrollada en esta tesis abre un camino prometedor en el campo de la biomedicina que permitirá mejorar los tratamientos neurológicos, además de aplicaciones en neuroestimulación o ablación térmica del tejido. / [CA] El tractament de malalties neurològiques està molt limitat per la ineficient penetració del fàrmac en el teixit cerebral danyat a causa de la barrera hematoencefàlica (BHE), i així no és possible una millora de salut del pacient. La BHE és un mecanisme de protecció natural per a evitar la difusió d'agents potencialment perillosos per al Sistema Nervios Central. No obstant això, aquesta barrera es pot inhibir mitjancant una tecnologia emprada mundialment basada en ultrasons focalitzats i injeccio de microbombolles. El principal avantatge és el seu caràcter no invasiu, sent així molt atractiva i còmoda per al pacient, i permet obrir la BHE de manera segura, localitzada i transitòria. Normalment, la zona cerebral malalta es tracta en la seua part central, emprant un unic focus. No obstant això, malalties com l'Alzheimer o el Parkinson requereixen un tractament al llarg d'estructures de geometria complexa i grandària elevada, situades en tots dos hemisferis cerebrals. Per tant, la tecnologia actual està fortament limitada al no complir amb aquests requeriments. Aquesta tesi doctoral està enfocada a investigar i desenvolupar una tècnica nova, basada en hologrames acústics, per a solucionar les limitacions presents en els tractaments neurològics. Una lent acústica holograca de baix cost impresa en 3D acoblada a un transductor d'element simple permet el control precs del front d'ona ultrasònic punt per a (1) compensar les distorsions que pateix el feix en el seu camí cap al cervell, i (2) focalització simultània del feix en regions multiples i de geometria complexa, proporcionant aix un tractament efectiu en temps i cost. Per això, la investigació desenvolupada en aquesta tesi demostra la possibilitat de realitzar qualsevol tractament neurològic, a més d'aplicacions en la neuroestimulació o l'ablació tèrmica dins del camp biomèdic. / [EN] Treatments for neurological diseases are strongly limited by the inefficient penetration of therapeutic drugs into the diseased brain due to the blood-brain barrier (BBB), and therefore no health improvement can be achieved. In fact, the BBB is a protection mechanism of the human body to avoid the diffusion of potentially dangerous agents into the central nervous system. Nevertheless, this barrier can be successfully inhibited by using a worldwide spread technology based on microbubble-enhanced focused ultrasound. Its main advantage is its non-invasive nature, thus defining a patient-friendly clinical procedure that allows to disrupt the BBB in a safe, local and transient manner. Conventionally, the diseased brain structure has been targeted in its center, with a single focus. However, Alzheimer's or Parkinson's Diseases do require that ultrasound is delivered to entire, complex-geometry and large-volume structures located at both hemispheres of the brain. Therefore, current technology presents several limitations as it does not fulfill these requirements. This doctoral thesis aims to develop a novel technique based on using focused ultrasound acoustic holograms to solve the existing limitations to treat neurological diseases. In this dissertation, we study 3D-printed holographic acoustic lenses coupled to a single-element transducer that allow to accurately control the acoustic wavefront to both (1) compensate distortions suffered by the beam in its path to the brain, and (2) simultaneous focusing in multiple and complex-geometry structures or acoustic vortex generation, providing a time- and cost- efficient procedure. Therefore, the research carried out throughout this thesis opens a promising path in the biomedical field to improve the treatment for neurological diseases, neurostimulation or tissue ablation applications. / Acknowledgments to the Spanish institution Generalitat Valenciana, which funding grant allowed me to develop this doctoral thesis, and as well funded my research stay at Columbia University. The development of the entire thesis was supported through grant Nª. ACIF/2017/045. Particularly, the research carried out in Chapter 3 and Chapter 4 was possible thanks to and supported through grant BEFPI/2019/075. Action co-financied by the Agència Valenciana de la Innovació through grant INNVAL10/19/016 and by the European Union through the Programa Operativo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) of the Comunitat Valenciana 2014-2020 (IDIFEDER/2018/022). / Jiménez Gambín, S. (2021). Transcranial Ultrasound Holograms for the Blood-Brain Barrier Opening [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171373

Glioblastoma (GBM) is the most common and deadliest of the malignant primary brain tumors in humans, with a reported 5-year survival rate of only 6.8% despite years of extensive research. Failure to improve local tumor control rates and overall patient outcome is attributed to GBM's inherent therapeutic resistance. Marked heterogeneity, extensive local invasion within the brain parenchyma, and profound immunosuppression within the tumor microenvironment (TME) are some of the unique features that drive GBM therapeutic resistance. Furthermore, tumor cells are sequestered behind the blood-brain barrier (BBB), limiting delivery of effective therapeutics and immune cell infiltration into the local tumor. Electroporation-based therapies, such as irreversible electroporation (IRE) and second generation, high-frequency IRE (H-FIRE) represent attractive alternative approaches to standard GBM therapy given their ability to induce transient BBB disruption (BBBD), achieve non-thermal tumor cell ablation and stimulate local and systemic anti-tumor immune responses without significant morbidity. The following work explores the use of H-FIRE to overcome GBM-induced therapeutic resistance and improve treatment success. Chapter 1 opens with an overview of GBM and known barriers to treatment success. Here, we emphasize the utility of spontaneous canine gliomas as an ideal translational model for investigations into novel treatment approaches. Chapter 2 introduces novel ablation methods (i.e. IRE/H-FIRE) capable of targeting treatment-resistant cancer stem cells. The focus of Chapter 3 is to highlight IRE applications in a variety of spontaneous tumor types. In Chapter 4, we investigate the feasibility and local immunologic response of percutaneous H-FIRE for treatment of primary liver tumors using a spontaneous canine hepatocellular carcinoma (HCC) model. In chapter 5, we characterize the mechanisms of H-FIRE-mediated BBBD in an in vivo healthy rodent model. In Chapter 6, we characterize the local and systemic immune responses to intracranial H-FIRE in rodent and canine glioma models to enhance the translational value of our work. Collectively, our work demonstrates the potential for H-FIRE to overcome therapeutic resistance in GBM, thereby supporting its use as a novel, alternative treatment approach to standard therapy. / Doctor of Philosophy / Glioblastoma (GBM) is the most common and deadliest form of primary brain cancer in humans, with only 6.8% of people surviving 5-years after their diagnosis. GBM is characterized by a number of unique features that make it resistant to standard treatments, such as surgery, radiation and chemotherapy. Examples include: (1) extensive invasion of tumor cells into the brain, making complete removal via surgery very difficult; (2) tumor cells are protected by a structure called the blood-brain barrier (BBB), which restricts the entry of most drugs (i.e. chemotherapy) and many immune cells, into the brain, thereby preventing them from reaching tumor cells; (3) tumor cells produce substances that block the immune system from being able to detect the tumor itself, which allows it to continue to grow undetected. High-frequency irreversible electroporation (H-FIRE) represents a new approach for the treatment of GBM. H-FIRE uses electric pulses to temporarily or permanently injure cell membranes without the use of heat, which allows for very precise treatment. The following work explores the ways in which H-FIRE can interfere with specific GBM features that drive its resistance to treatment. Here, we demonstrate that H-FIRE is capable of temporarily disrupting the BBB and characterize the mechanisms by which this occurs. This allows for drugs and immune cells within the blood to enter the brain and access the tumor cells, particularly those extending beyond the visible tumor mass and invading the brain. We also illustrate the potential for H-FIRE treatment within the brain to stimulate local and systemic immune responses by causing the release of proteins from injured cells. Similar to a vaccine, these proteins are recognized by the immune system, which becomes primed to help fight off cancer cells within the body. The end result is an anti-tumor immune response. Collectively, this work supports the use of H-FIRE as an alternative treatment approach to standard therapy for GBM given its potential to overcome certain causes of treatment resistance.

Over 50 million people globally suffer from neurodegenerative disorders—a number that is steadily increasing as the general population ages. Yet, effective treatments for neurodegenerative disorders including Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), and Huntington’s disease (HD) remain limited, primarily due to the presence of a natural protective biological barrier lining cerebral blood vessels called the blood-brain barrier (BBB). The blood- brain barrier prevents passage of nearly 98% of small molecules from blood vessels to brain tissue, while most therapies designed for neurodegenerative disorders, such as gene therapies, are considered large-molecule drugs, making development of efficacious pharmacological treatments extremely challenging. Present strategies to bypass the BBB for drug delivery broadly fall into two categories: non-invasive but non-targeted methods, or targeted but invasive surgical procedures such as direct intracranial injection. Currently, the only method poised clinically to provide both non-invasive and targeted drug delivery to the brain is focused ultrasound (FUS). When combined with intravenously administered ultrasound contrast agents called microbubbles which oscillate within blood vessels in response to FUS pressure waves, FUS can safely and reversibly open the blood-brain barrier (BBB) in a highly targeted manner. This enhances drug delivery to brain regions affected by neurodegenerative disorders through a physical mechanism known as acoustic cavitation. A majority of FUS research to date has centered around development and clinical translation of stereotactic FUS guided by magnetic resonance imaging (MRI) for treatment monitoring, commonly referred to as MRgFUS. However, MRgFUS exhibits cost, accessibility, and portability barriers to implementation in medical centers globally. Alternatively, our group has developed cost-effective and accessible ultrasound-guided FUS (USgFUS) configurations, which have the potential to enable BBB opening and drug delivery treatment outside of an MRI with treatment guidance facilitated by neuro-navigation technology and cavitation monitoring. While most USgFUS systems developed prior to this dissertation achieve therapeutic opening of the BBB and cavitation monitoring with separate ultrasound transducers, this thesis focuses primarily on development and optimization of a single-transducer technique for both therapy and monitoring called theranostic ultrasound (ThUS). In Aim 1, we show that a repurposed diagnostic ultrasound array reprogrammed with focused imaging pulses can produce therapeutically relevant ultrasound energy through primate skulls, and can induce multi-site modulatory drug and gene delivery depending on the ThUS parameters applied. In Aims 2 and 3, we apply ThUS-mediated drug and gene delivery for pre-clinical neuroscience and therapeutic applications in PD, respectively. In Aim 2, we demonstrated non-invasive delivery of specialized genes and nanoparticles which together enable remote stimulation and recording of neuronal activity, a synergistic process which could enable remote brain-to-brain communication. In Aim 3, we leveraged ThUS-mediated gene therapy to restore degenerated neurons in a PD mouse model, achieving nearly 85% restoration of diseased dopaminergic neurons non-invasively. Finally, in Aim 4, we translated ThUS-mediated BBB opening to non-human primates (NHP) to determine initial feasibility of targeted gene expression facilitated by a low frequency, custom ThUS array. We demonstrated that both conventional USgFUS and ThUS configurations can safely induce targeted gene expression in brain regions implicated in PD in rhesus macaques, motivating translation of USgFUS for gene therapy in the clinic. The aims in this dissertation collectively underscore the growing number of pre-clinical applications which could benefit from ThUS technology, while propelling USgFUS methodologies as a whole to the brink of clinical translation for unprecedented access to efficacious non-invasive gene therapy for neurodegenerative disorders in the future.

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires. / Objective: In multiple sclerosis (MS), pro-inflammatory lymphocytes use adhesion molecules to cross the blood-brain barrier (BBB) and accumulate in central nervous system (CNS) lesions. CD4 T lymphocytes polarized into auto-aggressive encephalitogenic TH17 (IL-17 secreting) are known to partake in MS lesion formation. Much less is known about the role of CD8 TC17. Identification of specific surface markers and adhesion molecules expressed by TH17 and TC17 lymphocytes would allow further characterization of these pathogenic subsets and would provide new therapeutic targets in MS. Methodology: We identified MCAM in a proteomic screen of human BBB endothelial cells (ECs) and on a subset of T lymphocytes. We characterized the phenotype and function of MCAM-expressing cells ex vivo, in vitro and in situ using human and mouse material obtained from controls, MS subjects and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) animals. Results: MCAM is expressed by human BBB-ECs and by human effector memory CD161+ and CCR6+ T lymphocytes. Both CD4 and CD8 MCAM+ lymphocytes express more IL-17, IL-22, GM-CSF and Gz B than MCAMneg lymphocytes. Moreover, MCAM is strikingly up-regulated in human on CD4+ and CD8+ T lymphocytes during MS relapses, while treatment decreases MCAM expression. In situ, MCAM+ CD8 and CD4 T lymphocytes are present in perivascular infiltrates of MS and EAE CNS specimens, while MCAM expression is up-regulated on BBB-ECs within lesions. In vitro, MCAM+ CD8 T lymphocytes display higher killing capacity of oligodendrocytes, and MCAM blockade reduces CD8 TC17 and CD4 TH17 transmigration across human BBB-ECs. In vivo, depletion of MCAM+ cells from reactivated CD4 T lymphocytes and from CD8 T lymphocytes decreases clinical symptoms in adoptive transfer EAE. Furthermore, expression of MCAM is up-regulated on CD4 and CD8 T lymphocytes in the TCR1640 transgenic mice, a model of spontaneous EAE. Finally, blocking MCAM in both MOG35-55-induced and spontaneous primary progressive EAE attenuates chronic neurological deficits. Conclusions: Our data demonstrate that encephalitogenic IL-17-producing lymphocytes with high effector and migratory capacity express MCAM, and that MCAM could serve as a biomarker for MS and a valuable target for the treatment neuroinflammatory conditions.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire démyélinisante et neurodégénérative du système nerveux central (SNC). Les cellules T activées qui expriment le PD-1 sont inhibées via l’interaction avec l’un des ligands: PD-L1 ou PD-L2. Des études effectuées chez le modèle murin de la SEP, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), ont démontré que l’interaction du PD-1 avec ses ligands contribue à atténuer la maladie. Toutefois, le rôle du PD-1 et de ses ligands dans la pathogenèse de la SEP chez l’humain et dans le modèle murin n’a pas été complètement élucidé. Nous avons déterminé que plusieurs cellules du SNC humain peuvent exprimer les ligands du PD-1. Les astrocytes, les microglies, les oligodendrocytes et les neurones expriment faiblement le PD-L1 dans des conditions basales mais augmentent de façon significative cette expression en réponse à des cytokines inflammatoires. Le blocage de l’expression du PD-L1 par les astrocytes à l’aide de siRNA spécifiques mène à l’augmentation significative des réponses des cellules T CD8+ (prolifération, cytokines, enzymes lytiques). Nos résultats établissent ainsi que les cellules gliales humaines peuvent exprimer des niveaux suffisants de PD-L1 en milieu inflammatoire pour inhiber les réponses des cellules T CD8+. Notre analyse de tissus cérébraux post-mortem par immunohistochimie démontre que dans les lésions de la SEP les niveaux de PD-L1 sont significativement plus élevés que dans les tissus de témoins; les astrocytes et les microglies/macrophages expriment le PD-L1. Cependant, plus de la moitié des lymphocytes T CD8+ ayant infiltré des lésions de SEP n’expriment pas le récepteur PD-1. Au cours du développement de l’EAE, les cellules du SNC augmentent leur niveau de PD-L1. Le PD-1 est fortement exprimé par les cellules T dès le début des symptômes, mais son intensité diminue au cours de la maladie, rendant les cellules T insensibles au signal inhibiteur envoyé par le PD-L1. Nous avons observé que les cellules endothéliales humaines formant la barrière hémato-encéphalique (BHE) expriment de façon constitutive le PD-L2 mais pas le PD-L1 et que l’expression des deux ligands augmente dans des conditions inflammatoires. Les ligands PD-L1 et PD-L2 exprimés par les cellules endothéliales ont la capacité de freiner l’activation des cellules T CD8+ et CD4+, ainsi que leur migration à travers la BHE. L’endothélium du cerveau des tissus normaux et des lésions SEP n’exprime pas des taux détectables de PD-L1. En revanche, tous les vaisseaux sanguins des tissus de cerveaux normaux sont positifs pour le PD-L2, alors que seulement la moitié de ceux-ci expriment le PD-L2 dans des lésions SEP. Nos travaux démontrent que l’entrée des cellules T activées est contrôlée dans des conditions physiologiques grâce à la présence du PD-L2 sur la BHE. Cependant, l’expression plus faible du PD-L2 sur une partie des vaisseaux sanguins dans les lésions SEP nuit au contrôle de la migration des cellules immunes. De plus, une fois dans le SNC, les cellules T CD8+ étant dépourvues du PD-1 ne peuvent recevoir le signal inhibiteur fourni par le PD-L1 fortement exprimé par les cellules du SNC, leur permettant ainsi de rester activées. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Responses of activated T cells are suppressed upon engagement of the receptor programmed cell death-1 (PD-1) with its ligands (PD-L1 and PD-L2). Experiments using the mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), have demonstrated that the PD-1/PD-Ls interaction contributes to attenuate disease severity. However, the expression and the role of PD-1 and PD-Ls have been partially documented in inflammatory murine models and human CNS data are still incomplete. We determined that primary cultures of human astrocytes, microglia, oligodendrocytes, or neurons expressed low or undetectable PD-L1 levels under basal conditions, but inflammatory cytokines significantly induced such expression, especially on astrocytes and microglia. Blocking PD-L1 expression in astrocytes using specific siRNA in co-culture led to significantly increased CD8 T cell responses (proliferation, cytokines, lytic enzyme). Thus, our results establish that inflamed human glial cells can express sufficient and functional PD-L1 to inhibit CD8 T cell responses. Extensive immunohistochemical analysis of post-mortem brain tissues demonstrated a significantly greater PD-L1 expression in MS lesions compared to control tissues, which co-localized with astrocyte and microglia/macrophage cell markers. However, more than half of infiltrating CD8 T lymphocytes in MS lesions did not express PD-1, the cognate receptor. Similar results were obtained in EAE mice. Even though CNS cells expressed PD-L1 at the peak of the disease, PD-1 intensity on infiltrating T cells decreased throughout EAE disease development. This reduction of PD-1 level on activated T cells prevented these cells to receive PD-L1 inhibitory signal. We also investigated whether human brain endothelial cells (HBECs), which form the blood brain barrier (BBB), can express PD-L1 or PD-L2 and thereby modulate T cells. HBECs expressed PD-L2 under basal conditions, whilst PD-L1 was not detected. Both ligands were up-regulated under inflammatory conditions. Blocking PD-L1 and PD-L2 led to increased transmigration and enhanced responses by human CD8 T cells in co-culture assays. Similarly, PD-L1 and PD-L2 blockade significantly increased CD4 T cell transmigration. Brain endothelium in normal tissues and MS lesions did not express detectable PD-L1; in contrast, all blood vessels in normal brain tissues were PD-L2-positive, while only about 50% expressed PD-L2 in MS lesions. Therefore, our results demonstrate that under basal conditions, PD-L2 expression by HBECs impedes the migration of activated immune T cells through the BBB, and inhibits their activation. However, such impact is impaired in MS lesions due to down-regulation of PD-L2 levels on the endothelium. The majority of infiltrating CD8 T cells is devoid of PD-1, thus insensitive to PD-L1 inhibitory signal providing by CNS cells once they have entered the CNS.

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau / Multiple Sclerosis is an inflammatory demyelinating disease in which immune cells from the peripheral blood infiltrate the central nervous system (CNS) to cause a pathologic neuroinflammatory reaction. Blood borne leucocytes cross the restrictive cerebral endothelium, the blood brain barrier (BBB), to gain access to the CNS parenchyma and cause cellular damage leading to the characteristic demyelinating lesions. The BBB is the interface between the blood and the CNS and as such is a critical mediator of neuro-immune reactions and an important therapeutic target to modulate neuroinflammation. It is essential to have a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the BBB properties to elaborate new therapeutic strategies to modulate the BBB and thus the local neuroinflammation reaction. This Ph.D. thesis describes three distinct molecular mechanisms which regulate key BBB properties. The first section describes a novel role for the renin-angiotensin system (RAS) in the neuro-vascular unit (NVU) as a regulator of paracellular permeability. The second part of this thesis characterises the role of a novel adhesion molecule of the BBB, ALCAM. The third part of this work studies the interactions between neural stem cells (NSC) and the BBB and identifies MCP-1 as a critical factor involved in NSC recruitment to the CNS. In the first experimental section we provide evidence that angiotensinogen (AGT) produced and secreted by astrocytes, is cleaved into angiotensin II (AngII) and acts on type 1 angiotensin receptors (AT1) expressed by BBB endothelial cells (ECs). Activation of AT1 restricts the passage of molecular tracers across human BBB-derived ECs through threonine-phosphorylation of the tight junction protein occludin and its mobilization to lipid raft membrane microdomains. We also show that AGT knockout animals have disorganized occludin strands at the level of the BBB and a diffuse accumulation of the endogenous serum protein plasminogen in the CNS, as compared to wild type animals. Finally, we demonstrate a reduction in the number of AGT-immunopositive perivascular astrocytes in multiple sclerosis (MS) lesions, which correlates with a reduced expression of occludin similarly seen in the CNS of AGT knockout animals. Such a reduction in astrocyte-expressed AGT and AngII is dependent, in vitro, on the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ. Our study defines a novel physiological role for AngII in the CNS and suggests that inflammation-induced downregulation of AngII production by astrocytes is involved in BBB dysfunction in MS lesions. In the second experimental part we focus on adhesion molecules of the BBB. Using a lipid raft-based proteomic approach, we identified ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) as an adhesion molecule involved in leukocyte migration across the BBB. ALCAM expressed on BBB endothelium co-localized with CD6 expressed on leukocytes and with BBB endothelium transmigratory cups. ALCAM expression on BBB cells was up-regulated in active multiple sclerosis and experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) lesions. Moreover, ALCAM blockade restricted transmigration of CD4+ lymphocytes and monocytes across BBB endothelium in vitro and in vivo, and reduced the severity and time of onset of EAE. Our findings point to an important role for ALCAM in leukocyte recruitment into the brain and identify ALCAM as a potential therapeutic target to dampen neuroinflammation. The third experimental part of this thesis studies the interactions between NCS and BBB. NCS represent an attractive source for cell transplantation and neural tissue repair. After systemic injection, NCS are confronted with the specialized BBB endothelial cells before they can enter the brain parenchyma. We investigated the interactions of human fetal neural precursor cells with human brain endothelial cells in an in vitro model using primary cultures. We demonstrated that human fetal neural precursor cells efficiently and specifically migrate to sub-endothelial space of human BBB-endothelium, but not pulmonary artery endothelial cells. When migrated across BBB-endothelial cells, fetal neural precursor cells spontaneously differentiate to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Effective migration and subsequent differentiation was found to be dependant on the chemokine CCL2/MCP-1, but not CXCL8/IL-8. Our findings suggest that an intact blood-brain barrier is not an intrinsic obstacle to neural stem cell migration into the brain and that differentiation of neural precursor cells occur in a sub-endothelial niche, under the influence of the chemokine CCL2/MCP-1. These three experimental sections demonstrate the crucial roles that the BBB plays in regulating the CNS homeostasis. Under pathological conditions, such as during neuro-immune reactions, the BBB is altered and becomes an important local player. The three different molecular mechanisms described in this thesis, contribute to our understanding of the BBB and may allow for the development of novel therapeutic strategies to limit neuroinflammation.

L'épilepsie est une maladie neurologique chronique caractérisée par des crises spontanées et récurrentes. Les crises sont générées par un déséquilibre dans le fonctionnement des neurotransmetteurs et des canaux ioniques qui contrôlent l'excitabilité. L'épileptogenèse est majoritairement associée à des pertes neuronales, une gliose, une inflammation plus ou moins importants. Un tiers des patients deviennent réfractaires. Récemment, plusieurs équipes ont montré une association entre les épilepsies focales pharmacorésistantes et la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE). De plus, une implication du système immunitaire ainsi qu'une cause auto-immune de l'épilepsie ont été suggérées. Dans cette thèse, nous avons observé dans le tissu de patients atteints d'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal (ELT), des fuites d'Immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme et leur accumulation dans les neurones présentant des signes de neurodégénérescence. Le récepteur d'IgG de grande affinité FcyRI est surexprimé sur les cellules ayant une morphologie de type microglie/ macrophages, tandis que le récepteur de faible affinité FcyRIII et le récepteur inhibiteur FcγRII sont moins présents. Dans ce même tissu nous avons noté que les protéines du complément C3c et C5b9 sont exprimées. Ensuite, nous avons étudié si le modèle murin d'épilepsie focale induite par injection intra-amygdalienne de kaïnate reproduit la physiopathologie de l'ELT associée à une rupture de la BHE. ZO-1, la principale protéine des jonctions serrées, présente un marquage discontinu indiquant que la BHE a été affectée. Nous avons remarqué des fuites d'IgGs et d'albumine ainsi que leur accumulation dans le parenchyme coïncidant avec la survenue des crises. La présence d‘IgG dans l'épilepsie pourrait également avoir une cause auto-immune. Nous avons utilisé des puces à protéines pour identifier des antigènes qui induisent une réponse immunitaire, dans le plasma des patients atteints d'ELT, Nous avons sélectionné 19 auto-anticorps spécifiques qui peuvent servir de potentiels biomarqueurs diagnostiques L'ensemble de ces résultats suggère que les fuites d'IgG sont associées à une déficience neuronale, conduisant à des changements immunologiques dans le foyer épileptique qui participent à la pathogénèse de l'ELT. Nous pensons qu'une meilleure interprétation des profils de ces auto-anticorps pourrait offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent unprovoked seizures. Seizures are generated by an imbalance in the functioning of neurotransmitters and ion channels that control excitability. Epileptogenesis is mostly associated with neuronal loss, gliosis, and inflammation more or less important. A third of patients become drug refractory. Recently, several teams have shown an association between drug-resistant focal epilepsy and disruption of the blood-brain barrier (BBB). In addition, a possible role of the immune system and an autoimmune nature in epilepsy has been suggested. In this thesis, in the tissue of patients with drug-resistant temporal lobe epilepsy (TLE), leakage of immunoglobulin G (IgG) into the parenchyma and IgG accumulation in neurons with attendant signs of neurodegeneration was observed. In addition, the high affinity IgG receptor, FcγRI was expressed on microglia/macrophage shaped cells. The expression of the low affinity IgG receptor, FcγRIII and the inhibitory IgG receptor, FcγRII was decreased. In the same tissue the complement proteins C3c and C5b9 were present on astrocyte/ microglia and macrophage/ microglia shaped cells respectively. Then, we evaluated whether the mouse model of focal epilepsy induced by intra-amygdala microinjection of kainic acid reproduced a pathophysiology of TLE associated with BBB impairment. ZO-1, the main tight junction protein presented discontinuous staining indicating that BBB was affected. Both IgG and albumin extravasations from blood vessels were noted and its parenchymal accumulation was concomitant with seizure occurrence. Another hypothesis of IgG presence in epilepsy incriminates an auto-immune cause. Protein microarray technology was used for identification in pooled plasma samples, of antigens that bind plasma antibody from TLE patients. 19 potential autoantibodies were identified as potential diagnostic biomarkers. Together, these observations suggest that IgG leakage is associated with neuronal impairment, leading to immunological changes in epileptic focus involved in the pathogenesis of TLE. A better interpretation of the profiles of these autoantibodies could offer new therapeutic and diagnostic perspectives.