Les Flavivirus neuropathogènes, tels que le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus West Nile (WNV), le virus de la fièvre jaune (YFV) et le virus Zika (ZIKV) causent des maladies neurologiques. Ces maladies sont dues à une infection des cellules du système nerveux central (CNS) par ces virus. Le CNS est un organe privilégié, isolé des agents pathogènes par une barrière entre le sang et le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique (BBB). Les Flavivirus neuropathogènes capables de traverser cette BBB afin d’atteindre leurs cellules cibles, localisées dans le CNS, sont neuroinvasifs. Le but de cette étude est de comprendre les mécanismes cellulaires permettant aux Flavivirus de traverser la BBB et les effets de l’infection par les virus ZIKV et WNV des cellules du CNS sur le développement de celles-ci.Le YFV est un virus hépatotrope, infectant majoritairement le foie et les reins. Deux vaccins vivants atténués dirigés contre le YFV, le vaccin FNV (pour French Neurotropic Virus) et le vaccin 17D, ont été obtenus empiriquement par passages successifs de souches virulentes de YFV sur cerveaux de souriceaux. Ces vaccins ne causent plus de maladies touchant les reins et le foie, mais peuvent parfois causer des encéphalites post-vaccinales. Ces cas d’encéphalites démontrent que ces souches vaccinales sont devenues neurovirulentes mais aussi neuroinvasives car les virus ont pu franchir la BBB. A cause d’une incidence trop élevée d’encéphalites post-vaccinales par rapport au vaccin 17D, le vaccin FNV a été retiré du marché dans les années 1980.Le JEV est un virus neurotrope, causant des encéphalites graves en Asie du Sud-Est. A ce jour, il existe un vaccin vivant atténué, le JEV SA14-14-2, obtenu empiriquement par passages successifs d’une souche virulente sur cellules de hamster. Ce vaccin est moins neurovirulent et moins neuroinvasif que les souches virulentes de JEV en modèle de souris, et protège contre des infections humaines par le JEV. Cependant, des cas d’encéphalites ont été rapportés après injection de ce vaccin. Il apparait donc que, dans certains cas, la souche vaccinale JEV SA14-14-2 est capable de traverser la BBB et d’infecter les cellules neuronales. Les dernières épidémies à virus ZIKV en Polynésie Française et en Amérique du Sud ont induit une augmentation de cas de malformations congénitales dans les zones touchées. Cela a soulevé de nouvelles questions quant à la capacité d’un Flavivirus à provoquer des malformations congénitales du CNS. Dans cette étude, nous avons identifié les mécanismes cellulaires permettant aux Flavivirus de traverser la BBB et les effets de l’infection par les virus ZIKV et WNV des cellules du CNS sur le développement de celles-ci.Nous avons utilisé deux systèmes in vitro permettant d’étudier le développement du CNS et la neuroinvasion des Flavivirus. Un premier système consiste en l’infection de coupes de cerveaux d’embryon de souris. En utilisant ce système, nous avons montré que le ZIKV a un tropisme préférentiel pour les cellules progénitrices de neurones, alors que le WNV a un tropisme préférentiel pour les neurones. Nous avons également montré que l’infection des progéniteurs neuronaux par le ZIKV induit un arrêt de la mitose cellulaire, alors que l’infection par le WNV n’a aucun effet sur la mitose. L’étude sur l’effet apoptotique de l’infection par les deux virus WNV et ZIKV n’a montré aucune différence entre les deux virus à des temps précoces d’infection.Un deuxième système a été mis au point pour l’étude de la neuroinvasion par les Flavivirus neuropathogènes. Ce système est composé de cellules endothéliales hCMEC/D3 pouvant former des jonctions serrées. Ces cellules ont été cultivées sur filtres d’insert de puits de culture cellulaire Transwell, placés au-dessus de cellules neuronales humaines. A l’aide de ce système, nous avons comparé la capacité à traverser la BBB de plusieurs Flavivirus. / Neuropathogenic Flaviviruses, such as Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus (WNV), yellow fever virus (YFV) and Zika virus (ZIKV), cause neurological diseases. These diseases are due to viral infection of central nervous system (CNS) cells. The CNS is a privileged organ, isolated from pathogenic agents by a barrier between the blood and the barrier, called the blood-brain barrier (BBB). Neuropathogenic Flaviviruses which can cross this BBB in order to reach their target cells in the CNS, are neuroinvasive. This study aims at understanding the cellular mechanisms by which YFV and JEV Flaviviruses cross the BBB and the effects of viral infection by WNV and ZIKV of the CNS cells during neocortex development.YFV is a hepatrotopic virus, which mostly infects the liver and the kidneys. The two live-attenuated vaccines against YFV, the FNV (for French Neurotropic Virus) vaccine and the 17D vaccine, were obtained empirically by several passages in suckling mouse brain of YFV virulent strains. These vaccines do not cause any disease targeting the liver or the kidneys, but can sometimes cause post-vaccine encephalitis. These encephalitis cases suggest that the vaccine strains have become neurovirulent and neuroinvasive. Due to high risks of post-vaccine encephalitis, the FNV vaccine use was discontinued in the 1980s.JEV is a neurotropic virus, causing acute encephalitis in South East Asia. To date, there is a live-attenuated vaccine against JEV, the JEV SA14-14-2 vaccine, which was obtained empirically by several passages in primary hamster kidney cells. This vaccine is less neurovirulent and less neuroinvasive than JEV virulent strains in mouse model, and it protects against JEV infections. However, some cases of post-vaccine encephalitis were reported. It thus seems that, in some cases, the vaccine strain JEV SA14-14-2 is able to cross the BBB and infect neuronal cells.The recent ZIKV epidemics in French Polynesia and South America were linked to an increase in the number of congenital malformations, rising questions regarding the capacity of a Flavivirus to induce CNS congenital malformations.In this study, we have identified cellular mechanisms involved in Flavivirus neuroinvasion and studied the effect of ZIKV and WNV infection of neuronal cells under development.To study CNS development, we have infected mouse embryos brain slices. We were able to show that ZIKV has a preferential tropism for neuronal progenitors, whereas WNV has a preferential tropism for neuronal cells. We also show that infection of neuronal progenitors by ZIKV impairs the cell life cycle, whereas no effect on the cell life cycle was observed for WNV-infected cells. Studies on apoptosis induction did not show any difference between both viruses at early time points of infection.To study Flavivirus neuroinvasion, we have used an in vitro model of BBB composed of human endothelial hCMEC/D3 cells that can form tight junctions. These cells were cultivated on Transwell inserts and placed above human neuronal cells. Using this system, we show that YFV FNV cross the BBB more efficiently than YFV 17D, suggesting that YFV FNV is more neuroinvasive than YFV 17D. This observation can explain the higher post-vaccine encephalitis risks associated with YFV FNV vaccine compared to YFV 17D vaccine. We also confirmed that JEV SA14-14-2 vaccine strain is less neuroinvasive than JEV RP9.We also examined how JEV crosses the BBB and the endothelial cell response following JEV treatment. We show that both JEV RP9 and SA14-14-2 are able to cross the BBB without infecting its endothelial cells and without disrupting the BBB. Preliminary results suggest that JEV RP9, but not JEV SA14-14-2, crosses the BBB by dynamin-dependant transcytosis. Transcriptomic analysis of endothelial cells treated by either virus show slight, but significant, differences in regulation of genes implicated in several pathways associated with CNS diseases.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est la structure formant les capillaires du système nerveux central (SNC). La BHE est responsable de maintenir l’homéostasie du cerveau en régulant précisé- ment les échanges entre le sang et le tissu cérébral. Elle est composée de trois types cellulaires : les cellules endothéliales (ECs), les péricytes (PCs) et les astrocytes (ACs). Du fait de ses propriétés très sélectives, la BHE est une des causes majeures des échecs observés dans le développement des médicaments destinés au SNC. En effet, ces médicaments en développement sont souvent in- capables de franchir la BHE pour atteindre leurs cibles thérapeutiques. C’est pour cette raison que la mise au point et l’utilisation de modèles de BHE sont cruciaux pour étudier la capacité de nou- veaux agents thérapeutiques à traverser la BHE mais également les mécanismes sous-jacents à leurs passages. Utilisé très tôt dans le développement pharmaceutique, un modèle de BHE infor- matif permettrait de réduire les échecs dans des phases de R&D plus avancées. Nous reportons dans cette thèse le développement et la validation d’un modèle de BHE réalisé sur un Transwell®, composé d’ECs extraites chez la souris. Les travaux ont été réalisés avec la perspective de fournir le plus d’informations possibles quant à la réalisation, l’utilisation et l’interprétation du modèle de BHE dans l’étude de la perméabilité de petites molécules en conditions saines et pathologiques. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole permettant l’isolation chez la souris des trois types cellulaires composant la BHE, soit les ECs chez la souris adulte, et les PCs et les ACs chez les nouveau-nés. Les méthodes décrites sont efficaces pour obtenir rapidement un grand nombre de cellules pures à moindre coût. De plus, les essais préliminaires démontrent que les cellules endo- théliales isolées sont pertinentes pour la création d’un modèle de la BHE. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris de valider un modèle sain de BHE. Pour ce faire, nous avons comparé les résultats de la perméabilité in vivo de 7 molécules à trois modèles de BHE composés respectivement d’ECs primaires, d’ECs immortalisées ou de lipides extraits du cerveau porcin. Le modèle de BHE composé des ECs primaires corrèle le mieux avec les résultats obtenus in vivo chez la souris. Dans un troisième temps, nous avons exploré la possibilité d’utiliser ce modèle de BHE validé comme modèle dans l’étude de la perméabilité lors d’une inflammation aiguë. Les résultats obtenus nous permettent de décrire les possibles voies empruntées par les molécules dont la perméabilité est augmentée lors de l’inflammation. Néanmoins, cette étude met aussi en lumière l’absence de généralisation possible quant à l’impact de l’inflammation aiguë sur le passage des petites molé- cules à travers la BHE. À l’issue de cette thèse, un modèle de BHE composé d’ECs primaire a été développé et validé. Ce modèle permettra l’étude systématique des nombreux paramètres impliqués dans le passage des molécules à travers la BHE très tôt dans le développement du médicament. / The blood-brain barrier (BBB) is the structure that forms the capillaries of the central nervous system (CNS). BBB major role is to maintain brain homoeostasis by precisely regulating exchange between blood and brain tissues. Three cellular types constitute the BBB, namely: endothelial cells (ECs), perycites (PCs) and astrocytes (ACs). Due to the BBB selectivity, this barrier is the major cause of failing in the drug development of molecules targeting the CNS. Indeed, drugs developed for CNS pathologies are often unable to cross the BBB to reach their therapeutic targets. The use of a relevant BBB model is therefore critical to study drug permeability when developing new drugs. Used earlier in drug development, this kind of BBB model could allow reducing failure rates in more advanced R&D phases. In this thesis, we report the development and validation of a BBB model made from ECs extracted from mouse and seeded in a Transwell®. This work aimed at providing as much information as possible regarding the production, use and interpretation of the BBB model in the study of small molecule permeability under healthy and pathological conditions. First, we established a protocol allowing the isolation of the three cell types from mice : endothelial cells from adult mice, and pericytes and astrocytes from newborns. The methods described herein are effective to quickly obtain a large number of pure cells at a low cost. Furthermore, preliminary tests show that isolated endothelial cells are relevant for the creation of a BBB model. Next, we focused on validating a healthy BBB model. We have compared the results of the in vivo permeability of 7 molecules with three models of BBB composed respectively of primary ECs, immortalized ECs or extracted porcine brain lipids. The BBB model composed of primary ECs best correlates with the results obtained in vivo in mice. Finally, we studied the possibility of using our BBB model as a model of permeability under acute inflammation. Our results allowed describing the possible routes used by the molecules whose permeability was increased during inflammation. The inflamed BBB model is relevant for studying the permeability of small molecules; however, this work also shows that one cannot generalize the impact of inflammation on the passage of small molecules through the BBB. Overall, we have developed and validated a BBB model composed of primary endothelial cells. This model allows studying drug permeability and provides a better understanding of the mechanisms involved in the permeability. This model could be used to study many parameters involved in the passage of molecules through the BBB at very early stages of drug development.

Neue aussichtsreiche Pharmazeutika scheitern regelmäßig in späten Entwicklungsphasen1 und stehen somit nicht als wertvolle Wirkstoffe zur Verfügung. Ein Grund hierfür ist die komplexe Pharmakinetik und der Mangel an geeigneten in-vitro Modellen. Daher befasst sich diese Dissertation mit der Entwicklung neuartiger in-vitro Membranmodelle am Beispiel der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Zu diesem Zweck wird der aktuelle Stand der Technik vorgestellt und anschließend das Konzept eines Mikrofluidikchips, in welchem mittels Dielektrophorese an eine zuvor erstellte Polyamidmembran CaCo-2-Zellen assembliert wurden. Die Auslegung und Optimierung des Chip-Designs, die Entwicklung der in-situ Membran sowie die Ermittlung der Randbedingungen sind wesentliche Bestandteil dieser Arbeit. Es konnte mittels FEM-Simulationen und Assemblierungsversuchen ein Modell erzeugt werden, mit dem ein Chipdesign entwickelt werden konnte, dass zum einen ein günstigeres Verhältnis von Zellflächen- und Abluminalen Volumen aufweist und zum anderen möglichst wenig Zellen für den Aufbau benötigt. Dieses System bietet somit ein hohes Potenzial für die Herstellung verbesserter in-vitro Modelle. Jedoch konnte auch durch die Charakterisierung mit Rhodamin, Fluorescein und FITC-Dextran aufgezeigt werden, dass dieser Vorteil durch spezifische und unspezifische Bindungen an der größeren Oberfläche z.T. reduziert wird, abhängig vom verwendeten Chipmaterial und untersuchten Wirkstoff. Als neuartig kann die in-situ Herstellung einer vertikalen Polyamidmembran in einem Polymerchip bezeichnet werden, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Für diese wurden die Parameter zur optimale Collagenbeschichtung für die Zelladhäsion ermittelt, sowie der Einfluss auf die Zellvitalität untersucht. Des Weiteren wurde das Medium zur Dielektrophorese und zur Kultivierung der Zellen ohne CO2-Begasung optimiert.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis / New promising pharmaceuticals regularly fail at late stages of development1 and thus do not become available as valuable active substances. Two of the main reasons for such failures are the complex pharmacokinetics and the lack of adequate in-vitro models. Therefore, this dissertation focuses on the development of novel in-vitro membrane models at the example of the blood-brain-barrier (BBB). It starts by presenting current investigations and the state-of-the-art technology and continues with the concept for a microfluidic chip in which CaCo-2 cells were assembled with dielectrophoresis on an in-situ membrane. The essential part of this work was to design and optimize this microfluidic chip, to develop an in-situ membrane to catch the assembled cells and to investigate the required boundary conditions. FEM simulations and assembling experiments conducted to the creation of a model to develop a chip design with a better ratio between cell area and abluminal volume, as well a low number of cells needed for the creation of this model. Such system might have a high potential to establish more sensitive in-vitro models than the current Transwell model. However, it was also demonstrated that this advantage is reduced by specific and nonspecific binding on the larger surface, depending on the chip material and the investigated test substance, shown during the chip characterization by using Rhodamine, Fluorescein and FITC-Dextran. Furthermore, the creation of a vertical polyamide in-situ membrane in a polymer chip like in this work, can be described as novel. To assemble cells on this supporting membrane, a protocol for a collagen coating as well for the dielectrophoresis medium were developed. Also, a modified culture medium was investigated, to allow the cultivation on standard atmospheric conditions.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis

Polymere Nanopartikel sind ein vielversprechender Ansatz für die Diagnose und Therapie von Krankheiten. Sie ermöglichen den Einsatz von schwerlöslichen oder instabilen Wirkstoffen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit das Targetings, durch gezielte Modifikationen des Nanopartikels wird der Wirkstoff zum Zielort transportiert und kann dort in der gewünschten Form freigesetzt werden; dadurch könnten bei erhöhter Wirksamkeit die Nebenwirkungen von Medikamenten reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln bestehend aus einem abbaustabilen Polystyren- Kern und einer biologisch abbaubaren Schale aus Polybutylcyanoacrylat. Es werden Methoden beschrieben, um die Größe, Struktur und den Abbau dieser Wirkstoffträger zu untersuchen. Die untersuchten Nanopartikel zeigen RAYLEIGH-Streuung, sowohl Größe als auch Abbau können durch Messung des Absorptionsspektrums bestimmt werden. Weiterhin konnten diese Eigenschaften mit Hilfe von dynamischer und statischer Lichtstreuung sowie Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht werden. Bei letzterer Methode konnte gezeigt werden, dass die Schale größtenteils abgebaut werden kann, während der Kern intakt bleibt. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke durch polymere Nanopartikel untersucht. Dabei wurde der fluoreszierende Thioflavine als Modellwirkstoffe eingesetzt. Das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke konnte nur mit Nanopartikeln erreicht werden, an deren Oberfläche ein Apolipoprotein E-Peptid gekoppelt war. Es konnte gezeigt werden, das die Nanopartikelschale im Gehirn abgebaut wird, der Wirkstoff freigesetzt wird und an Amyloid β, einem Marker der Alzheimer-Krankheit, bindet.

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A serious opioid crisis is affecting public health and economics, eroding people’s quality of life. 80% of patients who receive opioids suffer from adverse effects such as Opioid-induced constipation (OIC). However, there is no efficient medicine for these adverse effects. Notably, mainstream theory supports that analgesia effects are mainly controlled by CNS while OIC is predominately controlled by peripheral. In addition, the sites of action of opioid was based on the assumption that mu-opioid receptor antagonists (PAMORAs), did not cross the blood-brain barrier (BBB). Unfortunately, the BBB crossing of PAMORAs mislead the understanding of the role of the central nervous system (CNS) and gastrointestinal tract playing in the adverse effects such as opioid-induced constipation (OIC). Here, we developed a novel technology platform to prevent drugs from crossing the BBB. By applying this technology, naloxone- and oxycodone conjugates demonstrated superior potency, peripheral selectivity, pharmacokinetics, and effectiveness in rats compared to currently clinically used PAMORAs. By the help of these probes, it is revealed for the first time to that the mu-opioid receptors in the CNS played more important role in OIC than the peripheral receptors, which overturned the old theory. And the new theory points the way to better future PAMORAs drug design.

Contexte et objectifs : L'encéphalopathie hépatique (EH) est un trouble neuropsychiatrique, une complication majeure de la maladie hépatique chronique (MHC). L'EH se manifeste par un large éventail de symptômes, allant d'un léger manque d'attention et de troubles de la mémoire à une léthargie sévère et un coma. L'hyperammoniémie est centrale dans la pathogenèse de l'EH puisque l'ammoniac est neurotoxique et que l'ammoniac dérivé du sang traverse facilement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cependant, d'autres facteurs pathogènes sont également impliqués dans l'EH, notamment le stress oxydatif. Au cours de la MHC, le muscle joue un rôle compensatoire essentiel dans l'élimination de l'ammoniac par l'action de l'enzyme glutamine synthétase (GS), qui transforme le glutamate en glutamine. Étant donné que les cellules endothéliales de la BHE sont l'interface entre le sang et le cerveau, il est plausible qu'elles métabolisent l'ammoniac pour protéger le cerveau de la neurotoxicité induite par l'ammoniac. Cependant, cela n'a jamais fait l'objet d'études. Les thérapies de réduction de l'ammoniac sont les traitements courants de l'EH. Cependant, les réponses des patients aux traitements sont hétérogènes, et les différences de sexe pourraient en être la cause. Par conséquent, nos objectifs étaient 1) d'explorer le métabolisme de l'ammoniac dans les cellules endothéliales de la BHE par la présence de GS et 2) d'évaluer l'impact du sexe sur la MHC et ses complications, y compris la sarcopénie et l'EH. Méthodes : Pour le premier objectif, nous avons évalué l'expression et l'activité de la protéine GS in vitro et ex vivo chez des rats naïfs. Nous avons également évalué l'impact de l'ornithine, du glutamate et du α-kétoglutarate sur l'activité de la GS dans les cellules endothéliales de la BHE via la génération de glutamine 5-13C marquée. Pour le deuxième objectif, nous avons évalué l'impact du sexe sur le neurophénotype (anxiété, mémoire, coordination motrice et activité) chez des rats ligaturés des voies biliaires (BDL) (et contrôles respectifs) ainsi que sur le développement d'une EH sévère (léthargie/perte du réflexe de redressement). Nous avons également évalué les marqueurs des lésions hépatiques, l'hyperammoniémie, le stress oxydatif systémique, la masse et la fonction musculaire et la clairance de l'ammoniac musculaire. Résultats : Nous avons trouvé l'activité et l'expression de la GS in vivo et ex vivo dans les cellules endothéliales de la BHE. L'analyse au microscope confocal a montré que la GS dans les cellules endothéliales est moins abondante que dans les astrocytes. L'exposition de cellules endothéliales cultivées à des substrats marqués a révélé que l'ornithine est la plus efficace pour générer de la glutamine. Chez les femmes, la chirurgie BDL a provoqué une MHC (augmentation des enzymes hépatiques circulantes et de la bilirubine) et de l'EH (altération de la coordination motrice et de l'activité nocturne) par rapport aux rats contrôles respectifs. De plus, le degré d'hyperammoniémie et la clairance musculaire de l'ammoniac étaient similaires entre les sexes. Contrairement aux mâles, les rats femelles n'ont pas développé de perte musculaire, d'œdème cérébral et de perte de mémoire à court terme. De plus, les femelles présentaient un stress oxydatif plus faible et étaient complètement protégées contre les EH sévères précipitées par l'ammoniac par rapport aux mâles BDL. Conclusions : Nous concluons que la GS est exprimée dans les cellules endothéliales de la BHE, jouant peut-être un rôle dans l'atténuation ou le retard de l'entrée de l'ammoniac dans le cerveau et que la supplémentation en ornithine améliore l'activité de la GS en fournissant du glutamate pour la détoxification de l'ammoniac. De plus, nous concluons que le sexe a un impact sur les complications des maladies du foie, y compris la sarcopénie et l'EH, le stress oxydatif systémique jouant un rôle vital dans la susceptibilité à l'EH sévère induite par l'ammoniac. / Background and aims: Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychiatric disorder and a major complication of chronic liver disease (CLD). HE manifests with a wide range of symptoms, from mild lack of attention and memory impairments to severe lethargy and coma. Hyperammonemia is central in the pathogenesis of HE since ammonia is neurotoxic, and blood-derived ammonia easily crosses the blood-brain barrier (BBB). However, other pathogenic factors are also implicated in HE, including oxidative stress. During CLD, muscle plays an essential compensatory role in removing ammonia by the action of the enzyme glutamine synthetase (GS), which amidates glutamate into glutamine. Since the endothelial cells of the BBB are the interface between the blood and the brain, it is plausible that they metabolize ammonia to protect the brain from ammonia-induced neurotoxicity. However, this has never been investigated. Ammonia lowering therapies are the mainstream treatments for HE. However, patients' response to treatments are heterogeneous, and sex differences might be the cause. Therefore, our aims were 1) To explore ammonia metabolism in BBB’s endothelial cells through the presence of GS and 2) to assess the impact of sex on CLD and its complications, including sarcopenia and HE. Methods: For the first aim, we assessed GS protein expression and activity in vitro and ex vivo in naïve rats. We also evaluated the impact of ornithine, glutamate, and α-ketoglutarate on GS activity in endothelial cells of the BBB via the generation of labeled 5-13C glutamine. For the second aim, we assessed the impact of sex on the neurophenotype (anxiety, memory, motor coordination, and activity) in bile-duct ligated (BDL) rats (and respective SHAMs) as well as on the development of an ammonia-precipitated severe HE (lethargy/loss of righting reflex). We also assessed liver injury markers, hyperammonemia, systemic oxidative stress, muscle mass and function, and muscle ammonia clearance. Results: We found GS activity and expression in vivo and ex vivo in endothelial BBB cells. The confocal microscope analysis showed that GS in endothelial cells is less abundant than astrocytes. Exposing cultured endothelial cells to labeled substrates revealed that ornithine is the most efficient in generating glutamine. In females, BDL surgery caused CLD (increased hepatic enzymes and bilirubin) and HE (impaired motor coordination and night activity) vs. respective SHAMs. Furthermore, the degree of hyperammonemia and muscle ammonia clearance was similar between sexes. Contrary to males, female rats did not develop muscle loss, brain edema, and short-term memory loss. In addition, females had lower oxidative stress and were completely protected against ammonia-precipitated severe HE compared to male BDLs. Conclusions: We conclude that GS is expressed in endothelial cells of the BBB, possibly playing a role in attenuating or delaying ammonia entry into the brain and, ornithine supplementation enhances GS activity by providing glutamate for ammonia detoxification. In addition, we conclude that sex impacts the complications of liver disease, including sarcopenia and HE, with systemic oxidative stress playing a vital role in the susceptibility to ammonia-induced overt HE.

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La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante caractérisée par la formation de lésions multifocales à travers le système nerveux central. Les lymphocytes pro- inflammatoires CD4 Th1 et Th17 sont considérés pathogéniques en sclérose en plaques et dans son modèle animal, l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale. L’obésité et la composition du microbiome intestinal sont associées à une exacerbation de l’inflammation et à la progression de la sclérose en plaques, faisant des approches thérapeutiques métaboliques une méthode de choix afin d’améliorer l’évolution de cette maladie. La méthionine est un acide aminé essentiel métabolisé en S-adénosylméthionine (SAM), considéré comme le donneur universel de groupements méthyl, influençant l’expression génique. La restriction en méthionine est quant à elle associée à une diminution de la prise de poids et de l’inflammation, et in vitro, permet de réduire l’expansion des cellules Th17. Notre hypothèse est donc que diminuer l’activité du cycle de la méthionine permettrait de limiter la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale en modulant le métabolisme des cellules T, la barrière hémo-encéphalique et le microbiome intestinal. Pour ce faire, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale est induite chez des souris mâles et femelles exposées à une diète réduite en méthionine ou contrôle afin d’effectuer une évaluation clinique quotidienne. Des expériences de cytométrie en flux, d’immunofluorescence et de séquençage d’ADN ribosomal 16S sont effectuées afin de déterminer l’activité des cellules immunitaires, la perméabilité de la barrière hémo-encéphalique et la composition du microbiome intestinal. Nos résultats montrent que la diète réduite en méthionine est associée à un délai significatif de l’apparition des symptômes neurologiques, avec une évolution clinique différente entre les mâles et les femelles. Ceci est associé à une diminution du nombre de cellules immunitaires infiltrant le système nerveux central, en plus d’influencer la composition du microbiome intestinal, suggérant des changements vers un profil plutôt anti-inflammatoire. La diète réduite en méthionine semble donc améliorer la progression de l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale de manière différente selon les sexes et pourrait représenter une nouvelle voie thérapeutique contre la sclérose en plaques. / Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system with a sex bias towards women. Proinflammatory Th1 and Th17 cells are considered pathogenic in multiple sclerosis and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis. Obesity, western diet and gut dysbiosis increase inflammation and influence the course of this disease. Contrarily, dietary methionine restriction is associated with lower weight gain and reduced inflammation. In vitro, T cells upregulate components of methionine metabolism, including S- adenosylmethionine, upon activation and proliferation, while methionine restriction in the milieu reduces the expansion of Th17 cells. Thus, we hypothesized that limiting the activity of the methionine cycle will improve experimental autoimmune encephalomyelitis course by modulating Th17 cells through sex-specific epigenetic mechanisms and modification of the gut microbiome. To test this hypothesis, active experimental autoimmune encephalomyelitis is induced in male and female mice exposed to a methionine restricted or control diet. Clinical scores, flow cytometry, immunofluorescence and 16S rRNA sequencing are used to characterize the properties of immune cells, the blood-brain barrier, and the gut microbiome. Our results show that dietary methionine restriction is associated with a significantly delayed onset of neurological symptoms, with clinical differences in disease evolution between males and females. This is associated with a reduced number of immune cells and pathogenic proinflammatory T cells in periphery, then in the central nervous system. Methionine restricted diet is moreover associated with modification of the gut microbiome, suggesting a shift towards an anti-inflammatory profile. Finally, methionine restriction also influences the expression of adherence molecules such as VCAM-1, present in the blood-brain barrier, suggesting a neuro-protective effect. Our data reveal that methionine restricted diet ameliorates the clinical course and neuroinflammatory processes in experimental autoimmune encephalomyelitis in a sex-dependent manner and could represent a new therapeutic avenue to improve multiple sclerosis course.

Primäre und sekundäre Lymphome des zentralen Nervensystems (ZNS), PCNSL und SCNSL, sind schwer behandelbar und mit einer ungünstigen Prognose assoziiert. Der ZNS-Tropismus dieser Lymphome hängt mit einer Dysregulation von Genen zusammen, die für Immunabwehr, Chemotaxis, Zellmigration und die Blut-Hirn-Schranke (BBB) relevant sind. Zur Untersuchung der molekularen Mechanismen wurde das Eμ-myc-Mausmodell genutzt, um die Faktoren zu analysieren, die zur ZNS-Tropie beitragen, insbesondere jene, die die BBB destabilisieren und die Immunantwort beeinflussen. Eμ-myc-Lymphome wurden in C57BL/6-Mäuse transplantiert und ZNS-positive von ZNS-negativen Lymphomen histologisch unterschieden. RNA-Sequenzierungen identifizierten Signalwege, die mit dem ZNS-Tropismus korreliert sind. Der NF-κB-Signalweg zeigte hierbei besondere Relevanz: Seine Hemmung in ZNS-positiven Lymphomen verringerte die ZNS-Tropie und stabilisierte die BBB durch den Erhalt der Tight-Junction-Proteine. Zudem ergab sich eine Hochregulation von Gfrα-1 in ZNS-positiven Lymphomen, was eine verstärkte Zellmigration zu hirn-konditioniertem Medium bewirkte. Durch die Aktivierung von Astrozyten und GDNF-Hochregulation wurde die BBB zusätzlich destabilisiert. ZNS-trope Lymphome induzierten Immunmodulationen benachbarter Zellen, wie Mikroglia und Astrozyten, und verstärkten den ZNS-Tropismus durch post-seneszente Signaturen. Das Zusammenspiel zwischen Lymphomzellen und Astrozyten, die Aktivierung der GDNF/Gfrα-1/RET-Signalachse und die BBB-Störung gelten als zentrale Mechanismen der ZNS-Tropie bei DLBCL-ähnlichen Lymphomen. Die gezielte Modulation dieser molekularen Pfade könnte die ZNS-Beteiligung bei aggressiven B-Zell-Lymphomen reduzieren. Weitere Untersuchungen könnten therapeutische Ansätze zur Minderung der ZNS-Tropie und Verbesserung der klinischen Ergebnisse bieten. / Primary and secondary CNS lymphomas (PCNSL and SCNSL) are difficult to treat, with a poor prognosis. CNS tropism in these lymphomas involves immune evasion, chemotaxis, cell migration, and blood-brain barrier (BBB) integrity. This study aimed to identify factors behind CNS tropism using the Eμ-myc mouse lymphoma model to compare CNS-tropic and non-tropic lymphomas. Methods: Eμ-myc lymphomas were transplanted into immunocompetent mice, classified as CNS (+) or CNS (-) by histology. RNA sequencing identified pathways linked to CNS tropism, focusing on NF-κB, which was suppressed using IκBα∆N in CNS (+) lymphomas in vitro and in vivo. BBB disruption was assessed through astrocyte activation and ZO-1 degradation, while BBB permeability was evaluated with the Evans Blue assay. Lymphoma migration towards GDNF-conditioned medium was tested via Boyden chambers, with GDNF/Gfrα-1/RET pathway involvement assessed by knockdown and RET inhibition. Immune modulation was analyzed by PD-L1 expression in astrocytes and microglia co-cultured with CNS lymphomas. Results: RNA sequencing showed upregulation of NF-κB targets, pro-inflammatory cytokines, and SASP in CNS (+) lymphomas. NF-κB inhibition prevented CNS tropism and preserved BBB integrity by blocking ZO-1 degradation. CNS (+) lymphomas displayed Gfrα-1 upregulation and migration toward brain-conditioned medium. Astrocyte activation and GDNF upregulation by CNS (+) lymphomas further impaired BBB stability. CNS (+) lymphomas induced immune modulation in neighboring astrocytes and microglia, with a post-senescence signature linked to CNS tropism. Interactions between lymphoma cells, astrocytes, the GDNF/Gfrα-1/RET axis, and BBB disruption are key to CNS tropism in DLBCL-like lymphomas. Targeting these pathways may help prevent CNS involvement in aggressive B-cell lymphomas, offering potential therapeutic avenues to improve patient outcomes.