Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:24:46Z No. of bitstreams: 1 André Alves Dias.pdf: 1077781 bytes, checksum: cd03feff417d4066f650aed71ed822f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 André Alves Dias.pdf: 1077781 bytes, checksum: cd03feff417d4066f650aed71ed822f6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A resposta imune inata local ativada pelo patógeno, através do seu reconhecimento por receptores como os toll-like (TLR), é determinante na natureza da resposta imune adquirida gerada após a infecção. Neste contexto, tem sido demonstrado que o reconhecimento do DNA micobacteriano rico em motivos CpG não metilados pelo receptor TLR-9 representa uma via importante na ativação da produção de IL-12 por celulas dendriticas favorecendo a subseqüente geração de resposta imune Th1. As micobacterias expressam em abundância uma proteína catiônica semelhante às histonas de outras bactérias, denominada Hlp, presente tanto no envelope como no nucleóide bacteriano. A Hlp localizada no envoltório micobacteriano tem sido implicada no processo de adesão das micobacterias ao epitélio respiratório visto que interage com proteoglicanas da superfície destas células. Por outro lado, foi mostrado que o complexo Hlp-CpG ativa a sinalização celular via TLR-9, induzindo a produção de mediadores inflamatórios em macrófagos in vitro e um aumento na resistência à infecção por Mycobacterium tuberculosis in vivo. As micobacterias penetram no hospedeiro através das vias aéreas superiores, e as células epiteliais expressam receptores da imunidade inata, contribuindo para a resposta imune inata local. Este trabalho teve como objetivo investigar a capacidade da proteína Hlp de ativar, quando combinada ou não ao oligonucleotideo sintético CpG, a resposta imune inata de células epiteliais alveolares. Para atingir este objetivo, utilizamos a proteína Hlp recombinante (rHlp) de M. bovis BCG. O complexo rHlp-oligonucleotideo CpG induziu uma produção aproximadamente 2 vezes maior de interleucina 8 (IL-8) em relação às células só estimuladas com CpG e de quase quatro vezes em relação aos níveis observados com a célula só estimulada com rHlp, indicando um sinergismo entre estes dois estímulos. Este mesmo efeito da Hlp sobre a CpG foi observada em macrófagos, quando a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNFsintéticos derivados da sequencia da Hlp compreendendo os sítios de ligação a DNA e proteoglicanas, respectivamente, quanto à capacidade de mimetizar o efeito imunoestimulador da proteína inteira. Estes ensaios confirmaram que a presença de um sitio de ligação a DNA na molécula é essencial para sua atividade imunoestimuladora sobre o CpG. Finalmente, quando passamos a utilizar a micobacteria interia em vez da rHlp como estímulo, a adição de CpG ao M. smegmatis selvagem, mas não mutante para o gene hlp, aumentou a produção de IL-8 e RANTES pelas células epiteliais Os resultados descritos acima indicam que as células epiteliais respiratórias podem reconhecer micobacterias via TLR-9 e, assim, participar da resposta imune inata no sitio da infecção. Dentro deste contexto, aliado ao fato de tratar-se de uma proteína muito conservada encontrada em todas as micobactérias, a Hlp tem potencial de, quando combinada a DNA, ser empregada tanto como um bom imunógeno, assim como adjuvante em intervenções imunes contra as micobacterioses tais como a vacinação intranasal. / The local innate immune response induced by a pathogen at the site of infection, through its recognition by Toll-like receptors (TLRs), plays an important role in modeling the subsequent acquired immune response. In this context, it has been shown that recognition of mycobacterial DNA through its unmethylated CpG motifs by TLR-9 represents an important pathway for the production of IL-12 by dendritic cells favoring the subsequent generation of Th1 immune response. Mycobacteria express a major cationic histone-like protein (Hlp), which is present in the cell envelope and in the bacterial nucleoid. The bacterial surface-exposed Hlp has been implicated in mycobacterium adhesion on respiratory epithelium due to the capacity of Hlp to interact with cell surface proteoglycans. On the other hand, it has been shown that complexes of Hlp– CpG oligonucleotide activate cell signaling through TLR-9, inducing the production of inflammatory mediators in macrophages in vitro, and increasing resistance to Mycobacterium tuberculosis infection in vivo. The major port of entry of Mycobacteria in the host is the air way tract, and epithelial cells are known to express receptors of innate immunity and participate of local innate immune response. The objective of the present study was to investigate the capacity of Hlp to activate an innate immune response in alveolar epithelial cells. Cells were stimulated with M. bovis BCG recombinant Hlp (rHlp), combined or not with CpG oligonucleotide. The Hlp-CpG complex induced interleukin 8 (IL-8) production twice higher than the cell stimulated only with CpG, and 4 times higher than the cell treated only with Hlp, indicating a synergism between these two stimuli. The same effect was also observed in macrophages when the production of tumor necrosis factor- (TNF- ) was measured. We also tested the capacity of synthetic peptides displaying amino acid sequences identical to the Hlp DNA and proteoglycan binding sites for their ability to mimic the immune stimulatory effect of the whole protein. These assays confirmed that the presence of a DNA-binding site in the molecule is essential of its immune stimulating activity over CpG. Finally, the addition of CpG to wild type M. smegmatis, but not to the mutant strain for the gene hlp, increased the production of IL-8 and RANTES by epithelial cells. The results described above indicate that respiratory epithelial cells can recognize mycobacteria via TLR-9 and thus participate of the innate immune response at the site of infection. These observations, in addition to the fact that Hlp is a very conserved protein found in all mycobacteria, suggest that when combined with DNA Hlp can be potentially used both as a good immunogen, as well as an adjuvant, in immune interventions against mycobacteria such as intranasal vaccination.