As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Células-tronco mesenquimais (CTMs) estão entre os tipos de células-tronco encontradas a partir da fase fetal até a vida adulta de um indivíduo. As CTMs caracterizam-se pela morfologia similar à de fibroblastos associada à presença das proteínas de superfície celular CD73, CD90 e CD105, não apresentando expressão de marcadores hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45. As CTMs são consideradas multipotentes e capazes de diferenciarem-se em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Além de humanos, as CTMs já foram isoladas de uma série de organismos modelo, dentre eles o camundongo e o frango doméstico (Gallus gallus). Apesar de pouco difundido nesse campo de estudo, o modelo G. gallus apresenta uma série de características que o torna uma alternativa interessante ao modelo murino. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar molecularmente as CTMs deincubação. Como resultado, obtiveram-se células com as características esperadas para uma CTM clássica. As CTMs isoladas apresentaram morfologia característica, expressão das proteínas de superfície CD73, CD90 e CD105 e ausência de marcadores hematopoiéticos. Além disso, as células mostraram-se capazes de diferenciarem-se em osteoblastos e pré-adipócitos. No entanto, as células isoladas de coração, apesar de apresentarem características de CTMs, foram incapazes de diferenciarem-se em adipócitos. A análise do perfil transcricional destas células, em comparação às obtidas de medula óssea, revelou que as mesmas superexpressam genes relacionados a morfogênese cardíaca, a angiogênese, a diferenciação de células de músculo cardíaco e a coagulação sanguínea. Considerando as características apresentadas pelas células isoladas de músculo cardíaco, existe a possibilidade de ter havido o isolamento de um tipo específico de célula-tronco cardíaca denominada de células derivadas de epicárdio (EDPCs – do inglês Epicardium derived cells). Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho indicam que é possível isolar CTMs de medula óssea e músculo esquelético de fetos de frango. No entanto, as células obtidas de músculo cardíaco reúnem características de potenciais EPDCs e mais estudos são necessários para determinar a sua identidade. / Mesenchymal stem cells (MSC) are found in both fetal and adult individuals. MSC are characterized by their fibroblast-like morfology, the expression of the surface proteins like CD73, CD90 and CD105 and absence of hepatopoietic markers, such as CD34 e CD45. Besides, MSC are considered multipotent stem cells due to their capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts. MSC have been already isolated from human being and several model organisms, as mice and chicken (Gallus gallus). Unfortunately, G. gallus is not widely applied for the study of MSC, but it can be an interesting alternative to the murine model. In this context, the aim of this work was to isolate and molecularly characterize MSC derived from bone marrow, cardiac and skeletal muscle of 18-19 days chicken fetuses. Cells isolated from bone marrow and skeletal muscle presented the expected characteristics for MSC. They expressed CD73, CD90 and CD105, but were negative for hematopoietic markers. Moreover, the cells were able to differentiate into osteoblastic and adipogenic lineages. Cells obtained from cardiac muscle presented the same molecular and morphological characteristics, except that they were not able to differentiate into adipocytes. Transcriptional profile analysis of cardiacderived cells revealed that they overexpress genes related to heart morphogenesis, angiogenesis processess, smooth muscle cells differentiation and blood coagulation. There is a possibility that cells isolated from cardiac muscle are of an specific type named epicardium derived cells (EPDCs). The results obtained in this work point that is possible to isolate MSC from bone marrow and skeletal muscle from chicken fetuses. Nevertheless, cells obtained from cardiac muscle gather characteristics of putative EPDCs and further studies are necessary to elucidate the real identity of cardicac muscle isolated cells.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados. / As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T13:23:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Larissa Araújo.pdf: 2851246 bytes, checksum: 2fb40a78a939715f701a0bd590c904ec (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:23:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Larissa Araújo.pdf: 2851246 bytes, checksum: 2fb40a78a939715f701a0bd590c904ec (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / Moringa oleifera é amplamente utilizada na medicina popular e no tratamento de água para consumo humano. As sementes desta planta contêm as lectinas (proteínas que ligam a carboidratos) cMoL (do inglês coagulant M. oleifera lectin) e WSMoL (do inglês water-soluble M. oleifera lectin). O presente estudo investigou extratos (aquoso e aquoso diluído) e as lectinas cMoL e WSMoL quanto à citotoxicidade sobre células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) e células cancerígenas (NCI-H292, HT-29 e HEp-2), atividade hemolítica e atividade anti-inflamatória em macrófagos estimulados com LPS. O extrato aquoso também foi avaliado quanto à toxicidade aguda em camundongos (2.000 mg/kg) e atividade anti-inflamatória utilizando modelo murino de pleurisia induzida por carragenina. cMoL e o extrato aquoso foram potencialmente citotóxicos para PBMCs (IC50: 11,72 ± 1,51 μg/mL e 34,3 ± 2,31 μg/mL, respectivamente), enquanto WSMoL e o extrato aquoso diluído foram atóxicos para estas células (IC50: >100 μg/mL e 144,8 ± 1,56 μg/mL, respectivamente). No ensaio de toxicidade aguda do extrato aquoso concentrado em camundongos, não houve diferença em relação ao grupo controle, nos seguintes parâmetros: peso dos animais, peso dos órgãos, consumo de água e ração. No entanto, houve redução do número de hemácias, leucócitos, plaquetas, hematócrito e hemoglobina corpuscular média. As preparações avaliadas não apresentaram atividade hemolítica e não interferiram na sobrevivência das células cancerígenas avaliadas. Baixas concentrações do extrato aquoso e lectinas (6,25 μg/mL) bem como do extrato aquoso diluído (50 μg/mL) promoveram significativa atividade anti-inflamatória sobre macrófagos murinos estimulados com LPS através da regulação de óxido nítrico, TNF-α e IL-1β, mas não de IL-6. No teste da pleurisia, o extrato aquoso reduziu a migração leucocitária de forma dose dependente (inibição de 45,4, 56,1 e 71,2% para as doses de 125, 250 e 500 mg/kg, respectivamente), promoveu a redução dos níveis de óxido nítrico, TNF-α, IL-1β e MPO e não atuou sobre IL-6. Em conclusão, o extrato aquoso e cMoL são potencialmente tóxicos para PBMCs, enquanto WSMoL e o extrato aquoso diluído não são citotóxicos. Adicionalmente, o extrato aquoso não causou toxicidade a nível sistêmico em camundongos após exposição única à dose elevada (2.000 mg/kg v.o.). As preparações avaliadas não causam danos à membrana celular e são potenciais ferramentas farmacológicas por sua atividade anti-inflamatória.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-02-16T16:55:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Anna LíviaFINALIZADA E COM FICHA.pdf: 4755413 bytes, checksum: 4691e65d161267ed8769212d59e3b396 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-16T16:55:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Anna LíviaFINALIZADA E COM FICHA.pdf: 4755413 bytes, checksum: 4691e65d161267ed8769212d59e3b396 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / FACEPE / Ensaios baseados em fluorescência possuem alta sensibilidade, o que pode proporcionar a identificação e quantificação de biomoléculas e ajudar a elucidar diversos eventos celulares. O desenvolvimento de novas sondas fluorescentes, tais como os Quantum Dots (QDs), tem permitido aos pesquisadores usufruir de todo o potencial de fluorescência. QDs são nanopartículas de materiais semicondutores, de 2 a 10 nm, que possuem características ópticas únicas, tais como fotoestabilidade. Todavia sua utilização no estudo intracelular ainda é limitada, pois sua passagem através da membrana celular não se dá passivamente, ficando preso em vesículas endocíticas, necessitando assim de um método que realize a sua entrega livre no citosol. Dentre algumas metodologias já descritas para entrega intracelular de QDs destacam-se a eletroporação, microinjeção e a fixação celular. Todavia, essas apresentam algumas desvantagens, sendo metodologias laboriosas ou danosas às células. Dentro dessa realidade os lipossomas fusogênicos aparecem como uma ferramenta capaz de sanar essas desvantagens, por serem vesículas de bicamadas lipídicas que podem se fundir às células liberando seu conteúdo no citosol. Assim, neste trabalho teve-se como objetivo desenvolver dois métodos utilizando lipossomas para carrear QDs hidrofílicos ao interior de células vivas. Primeiramente QDs de CdTe aniônicos foram encapsulados em lipossomas de fosfatidilcolina, catiônicos (contendo DOTAP) e fusogênicos (contendo DOPE, DOTAP e DPPE-Rh). A análise por microscopia de fluorescência de hemácias e células tronco incubadas com os lipossomas fusogênicos contendo os QDs negativos, evidenciou que os QDs ficaram ligados à membrana celular devido à diferença de cargas negativas dos QDs e positivas dos lipídeos. Portanto, na continuidade deste trabalho uma segunda abordagem, baseada na método de injeção em etanol, foi desenvolvida para a encapsulação de QDs e aplicada para os mesmos tipos de lipossomas anteriormente descritos. Nessa segunda metodologia, os QDs de CdTe positivos foram também utilizados, de forma a evitar a interação eletrostática entre os QDs e os lipídeos. Para ambos os métodos desenvolvidos, os lipossomas foram caracterizados por medidas de potencial zeta, de raio hidrodinâmico, microscopia de fluorescência e eletrônica de transmissão, confirmando que houve a encapsulação de QDs para todos os sistemas lipossomais utilizados. Ao longo de todo o estudo as hemácias foram células modelo importantes para avaliar a fusão dos lipossomas com a membrana celular, pois estas não apresentam atividade endocítica. Os lipossomas de fosfatidilcolina e catiônicos serviram de modelo para desenvolver as duas metodologias de encapsulação que posteriormente foram aplicadas aos fusogênicos. Os estudos feitos com hemácias e células HeLa, utilizando a segunda metodologia de encapsulação e lipossomas fusogênicos, sugerem a entrega dos QDs positivos nas células vivas. No entanto, estudos adicionais precisam ser desenvolvidos para comprovar se os QDs positivos se encontram livres ou não no citosol. Este novo método apresenta ainda potencialidade para a encapsulação de QDs bioconjugados, pois o processo de congelamento do anterior poderia desnaturar as proteínas. Esperamos que este estudo possa ajudar no desenvolvimento de métodos efetivos de liberação de QDs no citosol, de forma que seja possível se utilizar as vantagens dessas sondas fluorescentes para melhor compreender vários processos intracelulares. / Fluorescence-based assays have high sensitivity, which can provide the identification and quantification of biomolecules and help elucidate cellular events. The development of new fluorescent probes such as Quantum Dots (QD) has enabled researchers to take advantage of the full fluorescence potential. QDs are semiconductor nanoparticle materials from 2 to 10 nm which have unique optical properties such as photostability. However, their use in intracellular study is limited because its passage through the cell membrane does not occur passively, getting stuck in endocytic vesicles, thus requiring a method to conduct their free delivery in the cytosol. Among some methods already described for the intracellular delivery of the QDs include electroporation, microinjection and cell attachment. However, these have disadvantages, like being laborious methods or damaging the cells. Within this reality, the fusogenic liposomes appear as a tool to solve these drawbacks, being vesicles of lipid bilayers that can merge the cells releasing its contents into the cytosol. Thus, this study was aimed to develop two methods using liposomes to adduce hydrophilic QDs inside living cells. First of anionic CdTe QDs were encapsulated in phosphatidylcholine liposomes, cationic (containing DOTAP) and fusogenic (containing DOPE, DOTAP and DPPE-Rh). Analysis by fluorescence microscopy of stem cells and red blood cells incubated with the fusogenic liposomes containing the negative QDs, the QDs showed that they were bound to the cell membrane due to the difference of negative and positive charges of QDs and lipids, respectively. Therefore, the continuation of this work a second approach based on the ethanol injection method has been developed for encapsulating and implemented QDs for the same types of liposomes described above. In this second method, the positive CdTe QDs were also used in order to prevent electrostatic interaction between the lipid and the QDs. For both developed methods, the liposomes were characterized by zeta potential measurements, hydrodynamic radius, fluorescence microscopy and transmission electron confirming that there was encapsulating QDs for all liposomal systems used. The study with red blood cells were important to assess the fusion of the liposomes with the cell membrane, because they do not have the endocytic activity. The cationic and the phosphatidylcholine liposomes served as a model to develop methods for encapsulation, and subsequently applied to the fusogenic. Studies done with red blood cells and HeLa cells using the second method of encapsulation and fusogenic liposomes, suggest delivery of positive QDs in living cells. However, additional studies are needed to see if the positive QDs are free or not in the cytosol. This new method also has potential for encapsulating QDs bioconjugates because the freezing process, used before, may denature proteins. We hope that this study may help in the development of effective methods of QDs release in the cytosol, so being possible to use the full advantages of these fluorescent probes to better understand several intracellular processes.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4450_1.pdf: 834431 bytes, checksum: 9b8ba911262a1f186c2483cb694e92ba (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / A densidade energética de baixa potência (Laser e campo eletromagnético) vem sendo utilizada, nos últimos anos, com bastante freqüência na área médica e odontológica. O principal uso do Laser é auxiliar o reparo tecidual, para aliviar a dor, controlar a inflamação e o edema. Enquanto que, a ação de campos eletromagnéticos de baixa freqüência sobre os seres vivos é alvo de estudo ao longo dos últimos anos e tem se constatado a sua interferência sobre a debilidade do sistema endócrino. Vale ressaltar que o estudo de marcação das hemácias com tecnécio-99m é usado para diversas avaliações em medicina nuclear incluindo o estudo do volume sangüíneo em tratamento intensivo neurológico. Este trabalho visa avaliar a influencia da radiação não ionizante sobre a marcação de hemácias "in vitro" e avaliar o efeito do laser na cicratização em camundongos. Para isto foram utilizadas amostras de sangue de ratos da linhagem Wistar com 60 dias de idade pesando cerca de 240g. O sangue foi colhido por punção cardíaca e dividido em dois grupos. O primeiro para ser submetido à indução com Laser de Baixa Potência (LBP) nas seguintes densidades energéticas separadamente: 3, 6 , 9 e 18 J/cm2 .Nos experimentos, com a indução do LBP foram utilizados o EDT A e a Heparina como anticoagulante. O segundo grupo foi submetido a um campo eletromagnético (CEM) de 60 Hz durante 2, 4, 17 e 21 horas separadamente. Após a indução do laser e do campo eletromanético as amostras de sangue foram submetidas a marcação com Tecnécio 99m (99mTc). Os resultados mostram que a presença de EDT A e Heparina no sangue, como anticoagulante é capaz de modificar a captação de tecnécio-99m pelas hemácias. A indução do laser promove uma redução da capacidade de ligação do tecnécio-99m a partir de 3J/cm2 obtendo uma redução em torno de 50% e permanecendo inalterada até 18J/cm2. Por outro lado, pode-se verificar que o campo eletromagnético também altera a capacidade de ligação em função do tempo de exposição, porém a inibição da captação pelas hemácias é menos acentuada que o laser. No experimento "in vivo" com camundongos machos, após incisões no abdome da ordem de 1 cm, com posterior aplicação do laser na densidade energética de 3J/cm2, na incisão esquerda, observa-se que 48 horas após as aplicações, o tecido epitelial e conjuntivo, macroscopicamente, encontra-se totalmente livre de inflação e infecção e com uma cicatrização superficial mais pronunciada que a incisão direita. Pode-se concluir que o laser e o campo eletromagnético promovem alterações na marcação dos elementos sangüíneos, e o laser é capaz de acelerar o reparo celular

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-10T22:53:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T22:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gisely Juliane Barbosa de Albertim.pdf: 3413482 bytes, checksum: 3b7142ff44bc24f648147cb01ae4d8dc (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / CNPQ / FACEPE / A regulação do volume celular é importante em vários processos fisiológicos. A diminuição regulatória do volume (RVD) é o processo pelo qual as células recuperam o seu volume após terem sido submetidas a um choque hipoosmótico. Este processo se deve principalmente à liberação de K⁺ e Cl⁻ através de canais e transportadores iônicos. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos canais de potássio e canais de cloreto envolvidos na RVD e na proliferação das células-tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (hWJ-MSCs). As hWJ-MSCs foram isoladas de acordo com a técnica de migração espontânea do explante. As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 15 % soro fetal bovino, 10 % F-12, 100 U/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina e mantidas em atmosfera de 5% de CO₂ a 37 °C. Nos experimentos da RVD, as hWJ-MSCs foram depositadas em uma cubeta acoplada a um microscópio invertido com um sistema de vídeo imagem, sendo submetidas inicialmente a um choque hipoosmótico (300 mOsm→200 mOsm) por perfusão. A dinâmica de variação do volume foi monitorada por 30 min e as imagens antes (300 mOsm) e durante o choque hipoosmótico (200 mOsm) foram obtidas a cada minuto e analisadas usando o software ImageJ. As hWJ-MSCs foram submetidas aos seguintes inibidores de canais: tetraetilamônio (TEA) 10 mM, (canal de Kv); glibenclamida (GB) 100 µm, (canal de Kir6.x); 4-aminopiridina (4-AP) 5 mM, (canal de Kv1, KCNA), Iberiotoxina (IBTX) 10 nM (canal BKca), (ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzóico (NPPB), (canal de Cl⁻ ), ácido disulfônico di-isocianatoestilbeno (DIDS) 100 µm e Tamoxifeno (TAM) 10 µm. Posteriormente, as células foram submetidas aos ensaios de MTT, curva de crescimento, quantificação do conteúdo de DNA e RT-PCR. A técnica de patch clamp na configuração Whole-cell foi empregada para caracterização das correntes iônicas. Os dados foram analisados usando o teste t Student’s ou ANOVA, com pós-teste de Tukey ou de Bonferroni. Um valor de p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A RVD presente nas hWJ-MSCs foi suprimida na presença dos inibidores de canais de potássio e de canais de cloreto. As hWJ-MSCs apresentaram três perfis de corrente iônica: Maxi K (BK ou Kca); corrente de potássio transiente de saída (Ito) e uma corrente de retificação tardia (Kᴅʀ). As hWJ-MSCs na presença dos inibidores de canais iônicos reduziram a proliferação permanecendo na fase G0/G1 do ciclo celular. As hWJ-MSCs expressaram os canais de potássio (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 e KCNH1) e os canais de cloreto (pl-VDAC e CLCN3). Deste modo, conclui-se que os canais de potássio dependentes de voltagem (Kv), canais de potássio dependentes de ATP, ativados por cálcio de alta condutância (Kca) e canais de cloreto participam no mecanismo da RVD e consequentemente interferem na proliferação das hWJ-MSCs. / Cell volume regulation is one of the most fundamental homeostatic mechanisms and essential for normal cellular function. The phenomenon of shrinkage and / or cell swelling caused by osmotic changes are called regulatory volume increase (RVI) and regulatory volume decrease (RVD), respectively. The RVD is the process by which cells recovery its volume after being subjected to hypoosmotic environment. This process occurs due to release K⁺ and Cl⁻ through ion channels and transporters. The aim of this study was to investigate the involvement of ionic channels involved in RVD and proliferation of mesenchymal stem cells from Wharton's Jelly of the human umbilical cord (hWJ-MSCs). The hWJ-MSCs were isolated according to the spontaneous migration of the explant technique. Cells were grown in DMEM supplemented with 15% fetal bovine serum, 10 % F-12, 100 U / ml penicillin and 100 ug / ml streptomycin and maintained in an atmosphere of 5 % CO₂ at 37 °C. In the experiments the RVD, the hWJ-MSCs were placed in a chamber coupled to an inverted microscope with a video image system and initially subjected to shock hypo-osmotic (300 mOsm → 200 mOsm) perfusion. The dynamics of volume change was monitored for 30 minutes before (300 mOsm) and during hypo-osmotic shock (200 mOsm) and the images (every min) analyzed using the ImageJ software. Specific cation channel inhibitors such as tetraethylammonium (TEA) 10 mM (Kv channel); glibenclamide (GB) 100 μm (Kir6.x channel); 4-aminopyridine (4-AP) 5 mM (Kv1 channel KCNA), iberotoxin (IBTX) 10 nM (BKCa channel) and cellular anion inhibitors (5-Nitro-2- (3-phenylpropylamino) benzoic acid (NPPB) (Cl⁻channel), disulfonic acid di-isocianatoestilben- (DIDS) 100 μm (Cl⁻ channel) and tamoxifen (TAM) 10 μm (Cl- channel) were used as molecular tools to evaluate the influence of ion channels in regulate mechanism RVD and cell proliferation. Subsequently, the cells were subjected to MTT assay, growth curve, flow cytometer to quantify the DNA content and RT-PCR. The patch clamp technique in Whole-cell configuration was employed to characterize the ionic currents. For statistical analysis, one-way ANOVA followed Tukey's or Bonferroni post hoc test were performed. A p-value less than 0.05 were considered statistically significant. The RVD in hWJ-MSCs was abolished in the presence of ionic channels inhibitors (potassium and chloride). The electrophysiological recording presents, at least, three different profiles compatible with: noisy current as a Maxi K current (BK or Kca), transient outward K+ current (Ito) and a slower activating delayed rectifier (Kᴅʀ). Also showed that hWJ- MSCs in the presence of the ionic channel inhibitors reduced the cell proliferation and arrest cells in G0/G1 cell cycle stage. As hWJ-MSCs expressed of the potassium channels (MaxiK, KCND2, KCND3, KCNS1, KCNH2 and KCNH1) and chloride channels (pl-VDAC and CLCN3). The results showed that there are a relationship of cell cycle progression and membrane permeability. Thus, we concluded that there is participation of KATP, BKCa Kv and Cl⁻ channels in the mechanism of RVD and proliferation of hWJ-MSCs.

A piplartina ou piperlongumina (PPLGM) é uma amida isolada de plantas do gênero Piper, da qual se obtêm as pimentas. As plantas desse gênero encontram-se distribuídas pelo mundo inteiro e têm sido utilizadas medicinalmente em diferentes culturas há muitos anos. A piplartina é o composto isolado desta espécie que mais se destaca, mostrando diferentes atividades biológicas e promissoras propriedades anticancerígenas. A resistência adquirida ao tratamento convencional é muito comum no câncer colorretal, na maioria dos casos devido à perda de função nas vias de apoptose e proteínas relacionadas ao ciclo celular. Sendo assim, buscou-se avaliar a capacidade da piplartina de induzir a morte celular na linhagem celular de carcinoma colorretal HCT 116. As células de HCT 116 selvagem e deficientes para as proteínas Bax, p21 e p53 foram tratadas com diferentes concentrações de piplartina, bem como a linhagem celular não tumoral Hek-293. Observou-se uma redução importante na viabilidade celular das células HCT 116, independentemente do estado de Bax, p21 e p53. As alterações morfológicas características de apoptose foram evidenciadas por coloração de Giemsa, microscopia eletrônica de varredura e coloração de laranja de acridina e brometo de etídeo. Para confirmar a indução de apoptose, foi realizado o ensaio de Anexina-V/PI, que evidenciou um aumento no percentual de células apoptóticas após o tratamento com piplartina, com o aumento da concentração relacionado ao aumento de células em apoptose tardia e pequeno aumento no número de células necróticas. A análise do ciclo celular mostrou alteração na distribuição tanto na linhagem selvagem quanto nas deficientes após o tratamento com a piplartina. Neste ensaio, o resultado mais expressivo foi o aumento de células na fase Sub-G0/G1, o que está relacionado à diminuição do conteúdo de DNA devido à fragmentação e indução de apoptose. Para avaliar a interação da piplartina com o DNA foram realizados ensaios com DNA plasmidial. Nesses ensaios, não foi observada interação direta da piplartina com o DNA, evidenciando sua ação indireta sobre o mesmo, que pode estar associado ao aumento de espécies reativas de oxigênio. Os dados aqui apresentados sugerem que PPLGM trata-se de uma molécula promissora na terapia de câncer colorretal. / Universidade de Caxias do Sul, UCS / Piplartine or piperlongumine is an amide isolated from plants of the genus Piper, from which the peppers is obtained. Plants of this genus are distributed all over the world, and have been used medicinally in different cultures for many years. From the isolated compounds found in these species, piperlongumine is the most outstanding, showing different biological activities and promising anticancer properties. Acquired resistance to conventional treatment is very common in colorectal cancer, in most cases due to loss of function in apoptotic methabolism and cell cycle protein regulation. Therefore, we sought to evaluate the ability of piperlongumine to induce cell death in HCT 116 colorectal carcinoma cell line. HCT 116 wild-type and lines deficient in Bax, p21 and p53 were treated with different concentrations of piperlongumine, as well as the non-tumor cell line Hek-293. A significant reduction in the cell viability of HCT 116 cells was observed, independent from Bax, p21 and p53 status. The morphological alterations from apoptosis were evidenced by Giemsa staining, scanning electron microscopy and acridine orange and ethidium bromide staining. To confirm apoptosis induction, Annexin-PI assay was performed, which evidentiate an increasing percentage of apoptotic cells after PPLGM treatment, with increasing concentrations related with higher percentage of late apoptosis stage and small increase of necrotic cells number. Cell cycle analysis showed altered distribution in both proficient and deficient cells after PPLGM treatment. In this assay, the most expressive result was the increase of Sub-G0/G1 cells phase, which is related to decrease DNA content due to fragmentation and apoptosis induction. To evaluate direct interaction of PPLGM with DNA, plasmidial DNA assays were performed. In this trials, there were no direct interaction of PPLGM with DNA observed, evidencing the indirect action of PPLGM through the increase of reactive oxygen species. The data presented here suggest that PPLGM should be a promising molecule in colorectal cancer therapy

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:56:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9027_Lívia Reisen Perin.PDF: 49 bytes, checksum: 8c6e65937148973000b4ea24ffddbae3 (MD5) Previous issue date: 2017-02-13 / O tratamento para a leishmaniose tegumentar e visceral tem um custo elevado e uma alta toxidade para o organismo, com isso, vem-se buscando alternativas. O alfabisabolol, um óleo essencial presente em várias plantas, é descrito como um bom agente leishmanicida. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito in vitro, de diferentes concentrações, do alfa-bisabolol e seus derivados sintéticos sobre os macrófagos e formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis e L. infantum. Avaliar se os derivados tem resultados melhores contra os parasitos e menor toxicidade, que o alfa-bisabolol. Para atividade contra as formas promastigotas, a L. amazonensis e L. infantum foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com diferentes concentrações do alfa-bisabolol e seus derivados (P1, P2 e P3), em um experimento foi feito a contagem das Leishmania spp. em microscópio óptico nos tempos de 24, 48 e 72 horas e no outro foi avaliado a viabilidade e feito o IC50 de cada composto no tempo de 48 horas. No teste de citotoxicidade, macrófagos foram plaqueados em placas de 96 poços e tratados com as mesmas concentrações dos compostos da avaliação das formas promastigotas, após 48 horas foi analisado a viabilidade e o CC50. Na avaliação da atividade contra as formas amastigotas, os macrófagos foram infectados e tratados com diferentes concentrações dos compostos. Após 48 horas de tratamento foi observado em microscópio óptico a porcentagem de macrófagos infectados e o número de amastigotas para cada macrófago. Foi calculado o índice de seletividade através da divisão do CC50 dos macrófagos pela IC50 das Leishmania spp. Para avaliação da carga intracelular de Leishmania spp. foi feito a infecção dos macrófagos e após as 48 horas de tratamento as células foram lisadas para liberar as amastigotas e analisar a viabilidade e a capacidade das mesmas se transformarem novamente em promastigotas. Foi analisado a morfologia, em microscópio óptico, de promastigotas tratadas com os compostos. Os resultados foram avaliados pela análise de variância (ANOVA) e teste de tukey para comparação das médias e feito o cálculo do IC50, com o software GraphPad Prism 5.0.4. O alfa-bisabolol (IC50: 3,43 µg/mL) apresentou uma melhor atividade contra as formas promastigotas da L. amazonensis, para a L. infantum o melhor foi P1 (IC50: 9,1 µg/mL). O composto com menor toxidade para os macrófagos foi o P3 (CC50: 31,23 µg/mL). Na atividade contra as formas amastigotas o P3 (IC50: 3,39 µg/mL) e o alfa-bisabolol (IC50: 7,629 µg/mL) foram melhores para a L. amazonensis e L. infantum, respectivamente. Considerando o índice de seletividade alfa-bisabolol e o P1 foram mais promissores para as formas promastigotas de L. amazonensis e L. infantum, respectivamente. E para a forma amastigota o derivado P3 foi melhor. Além disso, todos os compostos diminuem a capacidade das amastigotas de se transformarem novamente em promastigotas Observou que as promastigotas tratadas tinham presença de vacúolos e alteração do formato, mudança no número de núcleos e cinetoplasto.

Orientador: Paulo Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T00:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kemper_EdsonLuis_M.pdf: 5308612 bytes, checksum: db237ee334b77fd3abfbb7a66a5f95d6 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica de Plantas / Mestre em Ciências Biológicas