As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Células-tronco mesenquimais (CTMs) estão entre os tipos de células-tronco encontradas a partir da fase fetal até a vida adulta de um indivíduo. As CTMs caracterizam-se pela morfologia similar à de fibroblastos associada à presença das proteínas de superfície celular CD73, CD90 e CD105, não apresentando expressão de marcadores hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45. As CTMs são consideradas multipotentes e capazes de diferenciarem-se em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Além de humanos, as CTMs já foram isoladas de uma série de organismos modelo, dentre eles o camundongo e o frango doméstico (Gallus gallus). Apesar de pouco difundido nesse campo de estudo, o modelo G. gallus apresenta uma série de características que o torna uma alternativa interessante ao modelo murino. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar molecularmente as CTMs deincubação. Como resultado, obtiveram-se células com as características esperadas para uma CTM clássica. As CTMs isoladas apresentaram morfologia característica, expressão das proteínas de superfície CD73, CD90 e CD105 e ausência de marcadores hematopoiéticos. Além disso, as células mostraram-se capazes de diferenciarem-se em osteoblastos e pré-adipócitos. No entanto, as células isoladas de coração, apesar de apresentarem características de CTMs, foram incapazes de diferenciarem-se em adipócitos. A análise do perfil transcricional destas células, em comparação às obtidas de medula óssea, revelou que as mesmas superexpressam genes relacionados a morfogênese cardíaca, a angiogênese, a diferenciação de células de músculo cardíaco e a coagulação sanguínea. Considerando as características apresentadas pelas células isoladas de músculo cardíaco, existe a possibilidade de ter havido o isolamento de um tipo específico de célula-tronco cardíaca denominada de células derivadas de epicárdio (EDPCs – do inglês Epicardium derived cells). Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho indicam que é possível isolar CTMs de medula óssea e músculo esquelético de fetos de frango. No entanto, as células obtidas de músculo cardíaco reúnem características de potenciais EPDCs e mais estudos são necessários para determinar a sua identidade. / Mesenchymal stem cells (MSC) are found in both fetal and adult individuals. MSC are characterized by their fibroblast-like morfology, the expression of the surface proteins like CD73, CD90 and CD105 and absence of hepatopoietic markers, such as CD34 e CD45. Besides, MSC are considered multipotent stem cells due to their capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts. MSC have been already isolated from human being and several model organisms, as mice and chicken (Gallus gallus). Unfortunately, G. gallus is not widely applied for the study of MSC, but it can be an interesting alternative to the murine model. In this context, the aim of this work was to isolate and molecularly characterize MSC derived from bone marrow, cardiac and skeletal muscle of 18-19 days chicken fetuses. Cells isolated from bone marrow and skeletal muscle presented the expected characteristics for MSC. They expressed CD73, CD90 and CD105, but were negative for hematopoietic markers. Moreover, the cells were able to differentiate into osteoblastic and adipogenic lineages. Cells obtained from cardiac muscle presented the same molecular and morphological characteristics, except that they were not able to differentiate into adipocytes. Transcriptional profile analysis of cardiacderived cells revealed that they overexpress genes related to heart morphogenesis, angiogenesis processess, smooth muscle cells differentiation and blood coagulation. There is a possibility that cells isolated from cardiac muscle are of an specific type named epicardium derived cells (EPDCs). The results obtained in this work point that is possible to isolate MSC from bone marrow and skeletal muscle from chicken fetuses. Nevertheless, cells obtained from cardiac muscle gather characteristics of putative EPDCs and further studies are necessary to elucidate the real identity of cardicac muscle isolated cells.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados. / As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados.

Resumo não disponível

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Foi realizado o estudo qualitativo e quantitativo das células NK em pacientes com síndrome hiper-imunoglobulinemia E autossômica dominante (AD-HIES), uma imunodeficiência rara. Em uma análise pelo National Institutes of Health foi apresentada como uma doença multissistêmica, tendo dezenove características clínicas vistas em 30 pacientes [1]. Propomo-nos a estudar células NK para auxiliar a elucidar a patologia da HIES. Constatamos um declínio na quantidade total das células NK nos pacientes HIES. Foram constituídos painéis com marcadores da atividade citotóxica, de adesão, de ativação e de inibição. Observamos um aumento dos marcadores de atividade citotóxica NKp44, NKp46 e, principalmente, NKp30 em pacientes com AD-HIES, em conjunto com maior expressão constitutiva de perforina e CD107a, este último após estímulo com células da linhagem K562. Estes resultados sugerem que, embora com percentuais circulantes diminuídos de células NK, os pacientes com AD-HIES apresentam maior atividade citotóxica inata, que pode ser conseqüência das múltiplas infecções a que estão sujeitos. / Qualitative and quantitative study of the NK cells was performed in patients with autossomal dominant hyperimmunoglobulinemia syndrome (AD-HIES) a rara immunodeficiency. An evaluation by the National Institutes of Health has described it as a multisystemic desease, with nineteen clinical characteristics saw in thirty patients [1]. We did perform several observations trying to explain the role of NK cells in such disease, helping the understanding of its pathogenesis. We were able to show a lower frequency of NK cells in AD-HIES. After constituting panels to address NK cytotoxic, adhesion, activation, and inhibition function, we were able to detect that cytotoxic markers NKp44, NKp46, and NKp30 are upregulated in AD-HIES, along with along with higher expression of perforin and CD107a, the latter after stimulation with K562 lineage cells. These results suggest that, even in the context of diminished percentages of circulating NK cells, the patients with AD-HIES present higher innate cytotoxic activity, which can be a consequence of the recurrent multiple infections. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

FREITAS, Rosa Elayne Marques de. Avaliação biológica e de fatores gênicos modulados pelos retinóides no ciclo celular, proliferação, diferenciação, apoptose e necrose em células de cripta intestinal de rato. 2014. 91 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T15:58:43Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_remfreitas.pdf: 18814068 bytes, checksum: 2c625864a3c408b0890ffce574c5e148 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-02-19T16:00:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_remfreitas.pdf: 18814068 bytes, checksum: 2c625864a3c408b0890ffce574c5e148 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T16:00:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_remfreitas.pdf: 18814068 bytes, checksum: 2c625864a3c408b0890ffce574c5e148 (MD5) Previous issue date: 2014 / Infant mortality affects millions of children around the world and malnutrition contributes about one third of this mortality. Vitamin A is already used in the treatment of childhood malnutrition. However, few or no study has been done, carried out at the cellular level, to assess the impact of vitamin A supplementation in intestinal epithelial cells under in vitro protein malnutrition. Thus, we aimed to demonstrate the effects of malnutrition and treatment with retinoids in the processes of proliferation, apoptosis/necrosis, cell cycle and cell differentiation as well as activation of signaling pathways in IEC-6 rat cells under protein malnutrition. We demonstrated that malnutrition decreased cell proliferation in periods of 6, 12, 24 and 48 hours. In addition, retinyl palmitate treatment intensified the decrease of cell proliferation when compared to the malnourished group in the periods of 24 and 48 hours after supplementation. However, the reduction in proliferation was not related to cell death. Indeed, retinyl palmitate reduced apoptosis in the period of 48 hours after induction of malnutrition. Additionally, malnutrition stimulated cell quiescence, and the same was enhanced by retinol, which was identified by the increase in the percentage of cells in G0/G1 phase and the reduction of the percentage of cells in S phase and G2/M, especially in periods of 24 and 48 hours. To check if malnutrition, with or without supplementation of retinoids, was stimulating cell differentiation, we evaluated the gene transcription of the specific markers FABP and IAP within 42 hours. Both retinoids tested increased approximately 5-fold the expression of FABP and IAP mRNAs. Knowing that differentiation had been stimulated, we decided to check which intracellular signaling pathways, coupled to the activation of G proteins, were activated. Our results demonstrated that protein malnutrition decreased gene transcription of c-Jun, STAT3, MEF2C and ATF2, but increased the expression of the GLI-3 and c-Fos mRNAs in relation to the nourish group. However, retinoids increased the transcription of ELK-1, SRF, c-Jun, FOXO, STAT3, ATF2, GLI-3, NF-kB in relation to the malnourished group. Thus, this study showed that cell malnutrition interfered with cell proliferation stimulating cell quiescence. However, retinoids treatment intensified cell quiescence, decreased IEC-6 apoptosis and stimulated cell differentiation associated with the activation of the molecular pathways of ATF2, MAPK/ERK/JNK, IL-6, Hedgehog, PI3K/AKT and NF-kB. / A mortalidade infantil afeta milhões de crianças em todo mundo e a desnutrição contribui com cerca de um terço dessa mortalidade. A vitamina A já é utilizada no tratamento da desnutrição infantil. Contudo, poucos ou nenhum estudo fora realizado, ao nível celular, para avaliar o impacto da suplementação com a vitamina A em células epiteliais intestinais com desnutrição proteica in vitro. Desse modo, objetivamos demonstrar os efeitos da desnutrição e do tratamento com retinoides nos processos de proliferação, apoptose/necrose, ciclo celular e diferenciação celular, assim como na ativação das vias de sinalização em células IEC-6 de rato com desnutrição proteica. Demonstramos que a desnutrição diminuiu a proliferação celular nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas. Em adição, nos tempos de 24 e 48 horas a suplementação com palmitato de retinol intensificou esta redução em comparação ao grupo desnutrido. Contudo, a diminuição da proliferação não estava relacionada à morte celular. Na verdade, o palmitato de retinol reduziu apoptose no tempo de 48 horas após a indução de desnutrição. Adicionalmente, a desnutrição estimulou a quiescência celular e a mesma foi intensificada pelo retinol identificada pelo aumento do percentual de células na fase G0/G1 e diminuição dos percentuais de células nas fases S e G2/M, principalmente nos tempos entre 24 e 48 horas. Para verificar se a desnutrição, associada ou não à suplementação dos retinoides, estimulava a diferenciação celular foi realizada a análise da transcrição gênica dos marcadores específicos FABP e IAP no período de 42 horas. Os dois retinoides testados aumentaram em aproximadamente cinco vezes a expressão dos mRNAs de FABP e IAP. Visto que a diferenciação fora estimulada, foram verificadas quais as vias de sinalização intracelular, acopladas à ativação da proteína G, estavam ativadas. Os resultados deste trabalho demonstraram que a desnutrição proteica diminuiu a transcrição gênica de c-Jun, STAT3, MEF2C, e ATF2, mas aumentou a expressão dos mRNAs de GLI-3 e c-Fos em relação ao grupo nutrido. Entretanto, os retinoides aumentaram a transcrição dos mRNAs de ELK-1, SRF, c-Jun, FOXO, STAT3, ATF2, GLI-3 e NF-κB em relação com o grupo desnutrido. Deste modo, este trabalho mostrou que a desnutrição interferiu na proliferação estimulando a quiescência celular. Porém, o tratamento com os retinoides intensificou a quiescência diminuindo a apoptose com estimulação da diferenciação celular associado com a ativação das vias moleculares do ATF2, MAPK/ERK/JNK, IL-6, Hedgehog, PI3K/AKT e NF-κB.

HOLANDA, Andréa Gifoni Siebra de. Estudo comparativo dos efeitos da metilcelulose a 2% e 4% sobre as células endoteliais corneanas de pacientes submetidos à facoemulsificação. 2012. 100 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-27T12:20:41Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-27T12:21:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-27T12:21:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_agsholanda.pdf: 1810568 bytes, checksum: 7807864bad2bdcc40559f31c9a217b11 (MD5) Previous issue date: 2012 / Modern cataract surgery in normal corneas, independent of the surgical technique used, causes a mean 10 to 20% loss of endothelial cells. Viscoelastic substances were developed with the function of maintaining the natural spaces of the eye and providing mechanical protection to the intraocular structures during surgery. The objective of this study was to perform a comparative analysis of the effect of two viscoelastic compositions, methylcellulose 2% and 4%, in corneal endothelial protection against secondary damage to the phacoemulsification procedure. We performed a prospective, randomized, double-blind study with senile cataract patients, submitted to phacoemulsification surgery with intraocular lens (IOL) implant. All patients were submitted to a complete ophthalmological assessment, including specular microscopy. After initial assessment, the patients were randomized into two groups: in Group A (n=63) we used methylcellulose 2%, and in Group B (n=63) methylcellulose 4%. There was no statistically significant difference for the parameters analyzed between groups before surgery. However, at 30 days after surgery, mean density of endothelial cells (DCE) was 2128.78±277.55 cells/mm² in Group A and 2395.79±262.16 cells/mm² in Group B, representing a 15.15 and 6.76% loss of endothelial cells in Groups A and B, respectively. Mean DCE was significantly reduced (p<0.05), in both the inter- and inter-group analysis on the 1st, 15th, and 30th day after surgery. ECC increased on the 1st day after surgery in group A, this datum was statistically significant (p<0.05). There was no statistical difference for the other parameters assessed. In this study, we conclude that, despite the advantages of methylcellulose 4% over 2% in regards to the reduction of endothelial cell loss after phacoemulsification, both viscoelastic substances are similar in relation to clinical parameters such as central corneal thickness, coefficient of variation in cell size and percentage of hexagonal cells, which reflect corneal preservation and maintain adequate physiological conditions for proper endothelial function. However, due to the slight difference in cost between the two products and the benefits of methylcellulose 4% on endothelial cell preservation, this may be considered a choice product in routine cataract surgery, as indications for phacoemulsification are increasingly early, due to patients’ visual demands, promoting, in this manner, healthier corneas in the long term. / Com a cirurgia de catarata moderna realizada em córneas normais, independente da técnica cirúrgica utilizada, há uma perda celular endotelial média de 10 a 20%. Substâncias viscoelásticas foram desenvolvidas com a função de manter os espaços naturais do olho e conferir proteção mecânica às estruturas intraoculares durante a cirurgia. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise comparativa do efeito de duas formulações viscoelásticas, metilcelulose a 2% e 4%, na proteção do endotélio corneano contra o dano secundário à facoemulsificação. Foi realizado um estudo prospectivo, randomizado e duplo cego com pacientes portadores de catarata senil, submetidos à cirurgia de facoemulsificação com Implante de Lente Intraocular (LIO). Todos os pacientes foram submetidos a uma avaliação oftalmológica completa, incluindo microscopia especular. Após o exame inicial, os pacientes foram randomizados em dois grupos: no grupo A (n=63) foi utilizada a metilcelulose 2% e no grupo B (n=63) a metilcelulose 4%. A média da Densidade de Células Endoteliais (DCE) mostrou-se significativamente reduzida (p<0,05), tanto na análise intra como na intergrupo no 1º, 15º e 30º dias de pós-operatório, representando uma perda de células endoteliais de 15,26% e 6,79% nos grupos A e B, respectivamente. A Espessura Central da Córnea (ECC) mostrou-se aumentada no 1º dia pós operatório (DPO) no grupo A, sendo este dado estatisticamente significante (p<0,05). Houve aumento no Coeficiente de Variação da tamanho celular (CV) e diminuição no Percentual de Células Hexagonais (6 A), no entanto, sem significância estatística para esses dois parâmetros. Concluímos que, à despeito das vantagens da metilcelulose a 4% em relação à diminuição de perdas de células endoteliais após facoemulsificação, ambos os viscoelásticos são semelhantes em relação a parâmetros clínicos como ECC, CV e 6A, os quais refletem a manutenção de condições fisiologicamente adequadas para o bom funcionamento do endotélio. No entanto, devido à pequena diferença de custo entre os dois produtos e os benefícios da metilcelulose 4%, esta pode ser considerada um produto de escolha em cirurgias de catarata de rotina, uma vez que as indicações de facoemulsificação estão sendo cada vez mais precoces, devido às exigências visuais dos pacientes, promovendo, desta forma, córneas mais saudáveis por longo prazo.

ALVES, Luis Antonio de Oliveira. Expressão e regulação da quinase celular intestinal (ICK) em modelo de desnutrição in vivo e in vitro. 2014. 144 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-04T13:13:41Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_laoalves.pdf: 14635596 bytes, checksum: e4f1330eb5aa6bd3be3b7e58d448a025 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-04T13:14:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_laoalves.pdf: 14635596 bytes, checksum: e4f1330eb5aa6bd3be3b7e58d448a025 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T13:14:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_laoalves.pdf: 14635596 bytes, checksum: e4f1330eb5aa6bd3be3b7e58d448a025 (MD5) Previous issue date: 2014 / Malnutrition can affect the intestinal architecture, causing mucosal atrophy and compromising epithelial turnover. Although the gut is able to compensatorily respond to malnutrition, the molecular mechanisms by which the gut responds to protein deprivation are not completely understood. The intestinal cell kinase (ICK) is a highly conserved serine/threonine protein and a novel component of the signaling pathways that regulate cell proliferation in the intestinal crypt. In order to evaluate the role of the intestinal compensatory response to protein deprivation mediated by ICK, the activation of molecular pathways related to cell proliferation and survival were measured in C57BL/6J mice subjected to low protein diet (containing 2% protein) for five days and received standard chow-fed controls. We analyzed the intestinal canonical Wnt/β-catenin pathway, mammalian target of rapamycin (mTOR), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase B (PKB/Akt) by immunoblotting. We also measured the expression of intestinal stem cells markers (LGR-5 and Bmi1). We also conducted an in vitro study using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8) starved with low serum (0-1%) to evaluate the ICK response with or without gut trophic factors, such as glutamine (2 mM), alanyl-glutamine (10 and 50mM), and zinc (10 and 50μM), casein and bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 0.25 or 0.5% in the medium, respectively. We also assessed ICK mRNA transcript by q-PCR after protein deprivation. In order to evaluate the effect of this kinase on cell proliferation and apoptosis, the ICK gene was silenced using interference RNA in HCT-8 cells. Cell viability was measured by trypan blue exclusion. Furthermore, caspase 3 and 9, cleaved PARP, analyzed by western blot, and annexin V, measured by flow cytometry, were used to assess apoptosis. In order to measure ICK effect on cell proliferation, we analyzed Wnt/β-catenin and cyclin D1 pathways by western blot. We identified a significant and transient increase in ICK intestinal levels following low-protein induced malnutrition, concomitant with the activation of molecular pathways related to proliferation and survival, as well as increased expression of intestinal stem cell markers. This work also documented that the protein deprivation, induced by low serum concentration, increased the expression of ICK in HCT-8 cells, an effect that was reversed by BSA in the medium. This reverse effect was not seen with other compounds such as glutamine, alanyl-glutamine or zinc. Despite the increase in ICK expression after protein deprivation, no significant difference in its transcripts was found, when compared with controls. The silencing of the ICK gene significantly decreased Wnt/β-catenin and cyclin D1 signaling activation in HCT-8 cells with increased apoptosis by a caspase dependent mechanism. Our results suggest that the increased ICK expression in response to protein deprivation is a protective mechanism that limits cell apoptosis and supports epithelial cell proliferation following malnutrition. Keywords: Malnutrition. Protein deprivation. Intestinal cell kinase. β / A desnutrição pode afetar a arquitetura intestinal, causando atrofia da mucosa e comprometendo o turnover epitelial. Embora o intestino seja capaz de responder compensatoriamente à desnutrição, os mecanismos moleculares pelos quais o intestino responde à privação proteica não estão completamente esclarecidos. A quinase celular intestinal (ICK) é uma proteína altamente conservada do tipo serina/treonina e um novo componente das vias de sinalização que regulam a proliferação celular na cripta intestinal. Para avaliar o papel da resposta intestinal compensatória à privação proteica, regulada pela ICK, foi medida a ativação de vias moleculares relacionadas à proliferação e sobrevivência celulares, como a via canônica Wnt/β-catenina, a via da proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), vias da proteína-quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da proteína quinase B (PKB/Akt), bem como a expressão de marcadores para células-tronco intestinais (LgR-5 e Bmi1) por imunoblotting num modelo in vivo em camundongos fêmeas C57BL/6J submetidas à uma dieta hipoproteica (contendo 2% de proteína) por cinco dias e controles nutridos recebendo dieta padrão. Também foi realizado um estudo in vitro utilizando células HCT-8 de adenocarcinoma ileocecal humano desafiadas com meio padrão com restrição de soro fetal bovino (0-1%) para avaliar a resposta da ICK na presença ou não de fatores tróficos intestinais como glutamina (2mM), alanil-glutamina (10 e 50 mM) e zinco (10 e 50μM), além de caseína e albumina sérica bovina (BSA) na concentração de 0,25 e 0,5% no meio, respectivamente. A análise de RNAm foi feita para avaliar o transcrito de ICK por q-PCR, após privação proteica. No intuito de avaliar o efeito dessa quinase sobre a proliferação celular e apoptose, foi realizado o silenciamento do gene da ICK com uso de RNA de interferência em células HCT-8. A viabilidade celular foi avaliada com base na exclusão do azul de tripan. Posteriormente, foram realizados testes de western blot para caspase 3 e 9, PARP-clivada, além de anexina V por citometria de fluxo para avaliar apoptose, assim como western blot para via Wnt/β-catenina e ciclina D1 no intuito de medir os mecanismos relacionados à proliferação celular. Dessa forma, foi identificado um aumento significativo e transitório nos níveis intestinais de ICK na desnutrição induzida pela ração hipoproteica, concomitante com a ativação de vias moleculares relacionadas à proliferação e sobrevivência, bem como o aumento da expressão de marcadores para células-tronco intestinais. Esse trabalho também documentou que a privação proteica, induzida por baixa concentração de soro, aumenta a expressão de ICK em células HCT-8, efeito que foi revertido pela adição de BSA no meio. O mesmo resultado, não foi observado com outros compostos como glutamina, alanil-glutamina e zinco. Apesar do aumento da expressão da ICK após privação proteica, não houve diferença significativa da sua transcrição quando comparado com os controles. O silenciamento do gene de ICK reduziu significativamente a sinalização da via Wnt-β-catenina e ciclina D1 em células HCT-8 com aumento da apoptose por um mecanismo dependente de caspases. Os resultados sugerem que o aumento da expressão de ICK em resposta à privação proteica é um mecanismo de proteção que limita a apoptose e suporta a proliferação celular epitelial na desnutrição.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:21:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346384.pdf: 3864845 bytes, checksum: a3c27ca50f37b9383133a7affea47a92 (MD5) Previous issue date: 2017 / As lesões centrais e periféricas de células gigantes são processos proliferativos não-neoplásicos caracterizados pela presença de numerosas células gigantes multinucleadas, que apresentam características histológicas similares, mas com comportamento clínico distinto. O ligante do receptor ativador kappa-B (RANKL) e a osteoprotegerina (OPG) são importantes proteínas correlacionadas a osteoclastogênese e sua expressão pode estar envolvida na patogênese dessas lesões. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de RANKL e OPG em lesões periféricas de células gigantes (LPCG) e lesões centrais de células gigantes (LCCG), e quantificar o número de células gigantes multinucleadas (CGM) bem como seus núcleos em cada grupo de lesões. Vinte casos de cada lesão foram selecionados do Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina. A imunoexpressão de RANKL e OPG assim como a contagem de CGM e núcleos foi avaliada com o software Image J 1.45s. Não houve diferença estatística na quantificação de CGM por mm², no entanto, o número de núcleos por CGM foi maior em LCCG (P= 0,010). A expressão de RANKL foi notadamente maior nas LCCG que nas LPCG (P= 0,042). Entretanto, não houve diferença estatística entre as duas lesões na expressão de OPG. Nossos achados demonstraram maior expressão de RANKL e número de núcleos nas LCCG o que pode explicar a diferença de comportamento clínico entre as duas lesões e também a patogênese.<br> / Abstract : The central and peripheral giant cell granulomas are non-neoplastic proliferative processes characterized by the presence of numerous multinucleated giant cells having similar histologic features but distinct clinical behavior. The receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL), and osteoprotegerin (OPG) are the important proteins correlated to osteoclastogenesis, whose expression may be involved with the pathogenesis of these lesions. The aim of this study was evaluate immunohistochemically the expression of RANKL and OPG in peripheral giant cell granulomas (PGCG) and central giant cell granulomas (CGCG) and quantify the number of multinucleated giant cell (MGC) and their nuclei. Twenty cases of each lesion were selected from the Oral Pathology Laboratory of the Federal University of Santa Catarina. The immunoexpression of RANKL and OPG as well as quantification of MGC and nuclei was performed with the software Image J 1.45s. No statistic difference were found in the quantification of the MGC for mm², however the number of nuclei of the MGC was higher in CGCG (P = 0.010). RANKL expression in CGCG was higher than PGCG (P = 0.042). In contrast, there was no statistic difference between two lesions for OPG expression. Our findings showed a higher expression of RANKL and number of nuclei in CGCG which may explain the difference in the clinical behavior between these lesions and their pathogenesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017 / Made available in DSpace on 2017-09-19T04:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347028.pdf: 2777968 bytes, checksum: e2e99a611a7b5f21296a003c94110659 (MD5) Previous issue date: 2017 / O melanoma é o mais grave tipo de câncer de pele pela possibilidade de metástase e desde 1975, a dacarbazina continua a ser o tratamento padrão, mesmo apresentando muitas reações adversas. O número de candidatos a agentes antitumorais vem crescendo a cada ano, porém a falta de modelos in vitro representativos de um microambiente tumoral não acompanha este crescimento. A cultura tridimensional (3D) se mostra um dos melhores modelos in vitro para mimetizar o microambiente tumoral. Neste trabalho, utilizando a estratégia de formação de esferoide, desenvolveu-se um modelo celular 3D de melanoma murino isolado ou associado a macrófagos e fibroblastos. Para o melanoma, um modelo assim ainda não foi descrito na literatura. Dentre as tentativas, o modelo foi padronizado utilizando gel de agarose 2% como base e uma densidade celular de 1,2×104/poço para a formação dos esferoides. Os esferoides formados apresentaram tamanho médio de 300 µm compatível com a literatura. Além disso, o heteroesferoide composto pelas três linhagens celulares (melanoma, macrófagos e fibroblastos) mostrou-se mais rígido e estável aparentemente, em comparação com as outras condições testadas, características estas provavelmente provenientes da alta produção de matriz extracelular. Os esferoides supostamente demonstraram a formação de duas zonas: uma periférica de células viáveis e outra interna de células necróticas, que foram confirmadas pela contagem de células, a qual diminuiu no sétimo dia em relação ao quarto dia de cultivo 3D e pela presença de grandes espaços vazios no interior dos esferoides, observados pela microscopia. O perfil inflamatório dos macrófagos presentes nos esferoides foi induzido usando lipolissacarídeo (LPS) para polarização M1 e dexametasona (DEX) para polarização M2. Após caracterização dos esferoides, estes foram incubados com o sal de isotiourônio MF03 e a dacarbazina. Os resultados revelaram que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se mais citotóxico que a dacarbazina no modelo 3D de melanoma. Adicionalmente, observou-se diferenças importantes em termos de citotoxicidade das moléculas, comparando-se o modelo bidimensional (2D) com o 3D. Diante dos resultados, conclui-se que foi desenvolvido um modelo 3D de melanoma adequado para a triagem de possíveis agentes antitumorais, sendo que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se promissor para o tratamento antitumoral de melanoma.<br> / Abstract: Melanomas is the most severe type of skin cancer, and since 1975, dacarbazine remains the standard treatment for most patients, even presenting many adverse reactions. The number of candidates to antitumor agents is increasing every year, although the lack of in vitro models to represent the tumor microenvironment disrupts the process. Three-dimensional (3D) culture is one the best in vitro models to mimic the tumor microenvironment. In this work, using spheroid strategies, a 3D murine melanoma cellular model isolated or associated with macrophages and fibroblasts was developed. Melanoma model has not been described previously. Among the attempts the model was standardized using agarose gel 2 % and a cell density of 1,2×104/well to spheroid formation. Spheroids size was around 300 µm, as described in the literature. In addition, heterospheroids composed of three cell lines (melanoma, macrophages and fibroblasts) showed more rigid and stable apparently when compared with other tried conditions, probably due to high extracellular matrix production. Spheroids supposedly showed two different regions: a peripheral zone containing viable cells and an internal zone containing necrotic cells which was demonstrated by the decrease in the number of cells on the seventh day when compared with the day four, and by presence of large empty spaces inside the spheroids, visualized by microscopy. The inflammatory profile associated with the macrophages-containing spheroids was induced using lipopolysaccharide (LPS) to M1 polarization and dexamethasone to M2 polarization. Following the characterization, spheroids were incubated with MF03 isothiouronium salt and dacarbazine. The results showed that MF03 was most cytotoxic than dacarbazine using the 3D melanoma model. Additionally, it was observed significant cytotoxic differences between bidimensional (2D) and 3D models. In conclusion, we developed a 3D melanoma model to improve the screening of new antitumor agents as well as the promising application of MF03 as a new anti-melanoma.