Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une cible rationnelle pour les traitements anticancéreux des carcinomes épidermoïdes (CE). Cependant, seule une petite fraction de patients présente des avantages cliniques. Afin de comprendre l’échec de ces thérapies, j’ai étudié la voie de signalisation de l’EGFR en présence de fibroblastes associés aux carcinomes (FAC), principales cellules non malignes au sein des tumeurs. J'ai démontré que dans les CE, la voie de signalisation de l’EGFR coopère avec la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) induite par les FAC. Par la suite, j'ai cherché à résoudre les voies moléculaires qui sous-tendent cette coopération afin d'identifier de nouvelles cibles pharmaceutiques. Grâce à un criblage d'inhibiteurs pharmacologiques, j’ai identifié le vérapamil et le diltiazem, bloqueurs des canaux calcique CaV1, comme étant de puissants inhibiteurs de l'invasion des CE. Au niveau moléculaire, j'ai révélé que la rigidité de la MEC dérivée de la tumeur et la signalisation de l'EGFR déclenchent l'augmentation du calcium intracellulaire par le canal CaV1.1 dans les CE. Le blocage de l'activité de ces canaux inhibe l’invasion et la prolifération des cellules tumorale in vitro. Plus important encore, je démontre une forte réduction du développement des tumeurs dans deux modèles in vivo, à la fois dans un modèle de xénogreffe de cellules dérivées de patient atteint de carcinome de la tête et du cou, et dans un modèle CE cutané chez la souris. Par conséquent, je suggère une réaffectation du vérapamil et du diltiazem en tant qu’agents anticancéreux. / Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a rational target for squamous cell carcinoma (SCC) anticancer therapies, nevertheless; only a subset of patients shows clinical benefits. I demonstrated a cooperation between EGFR signaling and extracellular matrix (ECM) stiffness that could explain this phenomenon. I sought to resolve the molecular pathway underlying this cooperation in SCC proliferation and expansion in order to identify new pharmaceutical targets. Screening of pharmacological inhibitors, in an in vitro 3-D assay, identified verapamil and diltiazem, FDA approved L-type calcium channels inhibitors, as potent blockers of SCC invasion. Mechanistically, I revealed that tumor-derived ECM stiffness and EGFR signaling trigger increased of intracellular calcium through the L-type CaV1.1 channel in SCC. Blocking L-type calcium channels activity resulted in reduced SCC cells invasion and proliferation in vitro. More importantly, I also demonstrate a strong reduction in tumor development in two in vivo models, both head and neck patient derived xenograft and skin SCC mice model. Consequently, I suggest a repurpose of verapamil and diltiazem to anti-cancer agents.

Au cours de l’infarctus du myocarde, aussi bien l’ischémie que la reperfusion (I/R) entrainent des dégâts irréversibles au sein du myocarde. Parmi ces lésions cellulaires, la dérégulation de l’homéostasie calcique mène à la mort cellulaire. Afin d’augmenter la récupération suite à un épisode d’I/R, le « remote », pré- et post-conditionnement ont été montré comme cardioprotecteur. En particulier, certaines stratégies basées sur des molécules pharmacologiques modulant les canaux TRPV1 (Transient Receptor Vanilloid 1) ont été utilisées. Le but de cette étude est de comprendre le rôle de TRPV1 dans la cardioprotection. Nous avons récemment montré que TRPV1 est exprimé et est fonctionnel dans des cardiomyocytes adultes de souris. En revanche, afin d’utiliser des sondes génétiques, un modèle alternatif aux cardiomyocytes a été utilisé dans cette étude : la lignée cellulaire de cardiomyoblastes de rats.Grâce à des techniques de Western blot et d’imagerie confocale, nous avons d’abord montré que TRPV1 est exprimé dans les H9C2 et semble être localisé à la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Puis, nous avons démontré grâce à des techniques d’imagerie calcique dans le cytoplasme et le réticulum (Fura2-AM et ErGAP1 respectivement) que TRPV1 est un canal de fuite calcique fonctionnel RE. Comme la synthèse d’ATP et le métabolisme cellulaire sont dépendants des échanges de calcium (Ca2+) entre le RE et la mitochondrie, nous avons analysé le rôle de TRPV1 en mesurant le Ca2+ mitochondrial avec la sonde R-GECO. Nous avons montré que la modulation pharmacologique de TRPV1 augmente à la fois les contenus en Ca2+ cytoplasmique et mitochondrial d’au moins 20%. Enfin, nous avons effectué des séquences d’hypoxie-reoxygenation et nous avons évalué la mort cellulaire par cytométrie en flux. Nous avons montré que l’activation de TRPV1 a des effets hétérogènes sur la viabilité cellulaire alors que l’inhibition de TRPV1 augmente systématiquement la survie cellulaire, d’au moins 22%. Des évènements de Ca2+ précis et spatiotemporel du RE à la mitochondrie sont nécessaires pour initier ou réguler des multitudes de processus tels que la balance entre la mort cellulaire et la survie cellulaire. Dans cette étude, nous avons montré que TRPV1 pouvait être un de ces canaux impliqués dans cet échange de Ca2+ entre le RE et la mitochondrie et que les H9C2 sont un modèle viable pour évaluer le rôle de TRPV1 dans les flux calciques au cours de l’ischémie-reperfusion / During myocardial infarction, both I/R cause irreversible myocardial injuries. Among the cellular damages, calcium dysregulation occurs leading to cell death. To improve the recovery from I/R episodes, remote, pre- and post-conditioning are recognized to be cardioprotective. In particular, some strategies based on molecules acting on the TRPV1 channels have been used. The aim of our work is to better understand TRPV1 role in cardioprotection. We have recently demonstrated that TRPV1 is expressed and functional in adult mouse cardiomyocytes. In order to perform live imaging with genetic probes, an alternative model to cardiomyocytes was used in the present work: H9C2 cells. Thanks to Western blot and confocal microscopy, we first showed that TRPV1 is expressed in H9C2 and seems to be localized at endoplasmic reticular (ER) plasma membrane. Secondly, we demonstrated that TRPV1 is a functional ER Ca2+ leak channel via cytoplasmic and reticular Ca2+ imaging (respectively with Fura-2 and ErGAP1). As ATP synthesis and cell fate are dependent of Ca2+ exchanges between ER and mitochondria, we have analyzed the role of TRPV1 in the mitochondrial [Ca2+] using R-GECO probe. We observed that pharmacological TRPV1 modulation increases both cytosolic and mitochondrial Ca2+ contents by at least 20%. Finally, we performed hypoxia-reoxygenation sequences and we evaluated cell death by flow cytometry. We showed that TRPV1 activation has heterogeneous effects on cell viability, whereas TRPV1 inhibition always improves cell survival (at least by 22%). Precise and spatiotemporal Ca2+ release events from ER to mitochondria are required to initiate or to regulate many processes like the balance between cell death/cell survival. In the present study, we show that TRPV1 could be one of the channels involved in Ca2+ exchanges between ER and mitochondria, and that H9C2 is a valuable model to evaluate the role of TRPV1 in Ca2+ fluxes during I/R

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules ciliées internes (CCI) sont les cellules sensorielles de l'organe de l'audition, elles transforment les ondes sonores en messages nerveux. Avant l’entrée en fonction de la cochlée, les CCI émettent spontanément des potentiels d’action (PA) calciques, ce qui active la voie auditive ascendante et assure le développement de l’axe tonotopique, à savoir la représentation du codage en fréquence, dans chaque relais de la voie auditive. Le profil et les mécanismes à l’origine des PA des CCI sont fortement débattus. Nous nous sommes donc attachés à étudier l’empreinte développementale des cellules sensorielles, c'est à dire déterminer le profil et les mécanismes à l’origine de leur activité.Après avoir incubé l’épithélium neuro-sensoriel avec la sonde calcique Fura2-AM, nous avons observé des vagues calciques se propageant le long des cellules de soutien et des cellules sensorielles. Plus précisément, l’activité des cellules ciliées se caractérisait par des élévations transitoires de calcium (pics calciques) à intervalles de temps réguliers. Nous avons ensuite démontré que les pics calciques des CCI correspondaient bien à des bouffées de PA en mesurant simultanément les oscillations calciques et l’émission de PA en patch-clamp. La fréquence, la durée et la distribution temporelle des pics calciques des CCI étaient en grande partie invariantes le long de l’axe base-apex de la cochlée. Enfin, les cellules voisines montraient une activité fortement synchrone à l’inverse des cellules spatialement éloignées. Ces résultats indiquent donc que l’activité des CCI est majoritairement identique le long de l’axe tonotopique de la cochlée.Nous nous sommes ensuite intéressés au mécanisme responsable de l’activité spontanée, la dépendance à l’ATP. L’incubation d’apyrase, une ecto-nucléotidase, entraine une diminution de l’activité des cellules de soutien, à savoir une réduction de l’aire et de la vitesse de propagation des vagues calciques. En revanche, l'activité des CCI n'est pas altérée par la déplétion d’ATP. Ces résultats suggèrent 2 mécanismes distincts, le premier ATP-dépendant et le second ATP-indépendant dans les cellules de soutien et sensorielles, respectivement.L’ensemble de ces résultats indique que la maturation des centres supérieurs serait déterminée par l’activation synchrone d’un nombre limité de cellules sensorielles. / During development, the sensory cells of the cochlea, the inner hair cells (IHCs), fire spontaneous calcium action potentials. This spontaneous spiking activity at the pre-hearing stage allows the IHCs to automatically stimulate the auditory nerve fibers and hence, ensures the proper shaping of the tonotopic organization along the ascending auditory pathway. Spontaneous spiking patterns may depend on the IHCs position on the cochlea (the tonotopic axis). Those patterns may also rely on ATP secretion from neighboring supporting cells. In this study, we used calcium imaging in the immature neuro-sensory epithelium of the cochlea, the Kölliker´s organ, to gain insights in the IHCs spiking activity. After loading the Kölliker´s organ with the calcium dye fura-2 AM, propagation of spontaneous calcium waves was readily observed across supporting and sensory cells. Both basal and apical IHCs were characterized by similar spontaneous calcium transients interspaced with silent periods, reminiscent of bursts of action potential recorded in patch-clamp. In addition, neighboring cells show a strong degree of synchronous activity. Incubation with apyrase, which hydrolyzes ATP, prevents the spontaneous calcium increase that propagates across the supporting cells within the Kölliker's organ. However, it leaves the spontaneous calcium transients in IHCs mostly unaffected. All these results show that the tonotopic map refinement in higher auditory centers comes from a coordinated activity of neighboring sensory cells, whose activity seems to be independent of ATP

Bien que la régulation des canaux calciques par les récepteurs couplés aux protéines G soit connue depuis une trentaine d'année, ce n'est que récemment qu'il a été découvert que ce phénomène pouvait passer par une interaction directe entre ces deux partenaires. Les RCPGs sont les senseurs d'un grand nombre de paramètres (des simples photons aux molécules odorantes en passant par des hormones, acides aminés et nucléotides) et ils contrôlent un grand nombre de processus cellulaires en fonction de ces différents stimuli, ce qui en fait une cible thérapeutique majeure. Une de leurs cibles est l'activité des canaux calciques voltage dépendants qui est responsable d'un grand nombre de processus tels que le contrôle du potentiel de membrane, le relargage de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou, bien sûr, le contrôle du taux de calcium intracellulaire qui est lui-même un second messager impliqué dans de nombreuses voies de régulations.Il nous a donc paru intéressant de se pencher plus en avant sur ces interactions et de trouver une méthode nous permettant de cribler ces interactions potentielles avec des RCPG ciblés pouvant intervenir dans une thématique de contrôle de la douleur. Pour cela nous avons développé une stratégie de FRET en temps résolu utilisant les cryptates de terres rares à déactivation lente couplés aux ligands du tag SNAP comme donneurs de fluorescence, les canaux calciques étudiées étant fusionnés avec cet épitope et l'eGFP fusionnée aux RCPGs en tant qu'accepteur. Ce test nous a permis de confirmer l'interaction entre CaV2.2 et ORL1 le récepteur de la nociceptine. Nous avons ensuite cherché à caractériser plus précisément cette interaction et nous avons déterminé quelles en étaient les séquences peptidiques responsables au sein des domaines C-terminaux de ces deux protéines grâce à des expériences de GST-pull down. Nous avons synthétisé un peptide reproduisant la séquence d'interaction d'ORL1 que nous avons couplé à la séquence TAT, le rendant ainsi capable de pénétrer les membranes cellulaires. Lorsque nous ajoutons ce peptide leurre dans les expériences de TR-FRET, l'augmentation de fluorescence observée en présence de CaV2.2-SNAP et ORL1-GFP disparait totalement alors que l'ajout d'un peptide contrôle composé des mêmes acides aminés mais présentés dans le désordre n'a aucun effet. Nous avons ensuite cherché à étudier les effets de ce peptide in vivo lors d'un protocole de tolérance à la morphine étant donné que les souris K.O. pour le gène d'ORL1 sont résistantes à l'apparition de cette tolérance. Cette stratégie de découplage CaV2.2 :: ORL1 abolit complètement le phénomène de tolérance aux effets analgésiques de la morphine par une action au niveau spinal. Ce travail peut conduire à l'utilisation d'une telle approche dans une perspective thérapeutique visant à améliorer l'utilisation de morphiniques lors du traitement des douleurs chroniques. / The regulation of the calcium channels by GPCRs has been known for almost thirty years but the direction interaction between those two proteins is a recent breakthrough. GPCRs are sensors for a great number of parameters (photons, smell molecules, hormones, amino acids, nucleotides…) and they control numerous cellular functions according to those parameters making them a major target for pharmacology. One of the GPCR's targets is the calcium channel activity which is responsible for a great number of cellular processes like control of the membrane potential, neurotransmitters or hormonal secretion, muscular contraction and, of course, control of the intracellular calcium level which is a second messenger of numerous cell-regulation pathways.It appears to us that it would be interesting to study more closely those interactions and find a way to screen the GPCR/calcium channels interactions that may occur in pain regulation. We developed a strategy of time resolved FRET, using rare earth cryptate coupled to the ligand of the SNAP tag which is fused to the calcium channel as fluorescence donor and eGFP fused GRPRs as acceptors. That test confirmed the interaction between CaV2.2 and ORL1, the nociceptin receptor. We characterized more precisely the peptide sequence of the carboxy-terminal domain of the two proteins which is responsible for the interaction using GST-pull down experiments. We synthesized a peptide reproducing the ORL1 interaction sequence coupled to the TAT sequence allowing to go through the cell membranes. When we add this decoy peptide to ours TR-FRET experiments we lose all the increase of fluorescence that we see in presence of CaV2.2-SNAP and ORL1-GFP but the adding of a control peptide made of the same peptides but scrambled didn't affect the experiment. Then we look for the effects of this peptide in vivo, during a morphine tolerance protocol as it was reported that the ORL1 knock-out mice were insensitive to this phenomenon. This strategy of uncoupling CaV2.2 and ORL1 leads to a complete suppression of the tolerance to the analgesic effects of the morphine by an action at the spinal level. This work could lead to a therapeutic use of this approach which could enhance the use of morphinic compounds in treatment of chronics pains.

La lithiase rénale touche environ 10% de la population dans les pays industrialisés. 75% des calculs sont composés majoritairement d'oxalate de calcium; 10% sont composés de phosphate de calcium, 9% d'acide urique, 5% de struvite et moins de 1% de cystine. La composition des calculs dépend des espèces sursaturées dans les urines. Dans la première partie de ma thèse, je décris un modèle murin de cystinurie de type A lié à une mutation spontanée apparue dans la souche de souris 129S2/SvPasCrl. La cystinurie est une maladie autosomique récessive responsable de 7% des lithiases de l'enfant. Les calculs de cystine récidivent fréquemment et la cystinurie est caractérisée par un risque élevé de développer une insuffisance rénale chronique. Le modèle que nous proposons permet de tester de nouvelles thérapeutiques. Il met aussi en évidence une atteinte parenchymateuse avec un infiltrat inflammatoire associée aux calculs de cystine. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'évalue le rôle des Escherichia coli dans la genèse des calculs phospho-calciques. J'ai étudié en microscopie électronique à balayage des calculs phosphocalciques issus de patients et analysé les propriétés calcifiantes de différentes souches bactériennes sauvages et mutées dans des milieux spécifiques et dans de l'urine. En milieu synthétique le rôle des phosphatases est déterminant mais le type de source de carbone influence l'activité des phosphatases. Dans les urines, certains E. coli induisent la précipitation de phosphate de calcium aussi rapidement que les Klebsiella sans moduler le pH. Le type de source de carbone dans les urines semble déterminant pour moduler la biominéralisation. / Urolithiasis is a disease that corresponds to the presence of kidney stones in the urinary tract. It affects about 10% of the population in industrialized countries. About 75% of the stones are made of calcium oxalate. Less than 10% are made of calcium phosphate, 9% are made of uric acid, 5% are made of struvite and less than 1% are made of cystine. The composition depends on the species that are supersaturated in urine. In the first part of my thesis I will present a mouse model of cystinuria type A. Cystinuria is an autosomal recessive disease caused by the mutation of either SLC3A1 gene encoding for rBAT (type A cystinuria) or SLC7A9 gene encoding for b0,+AT (type B cystinuria). In 129S2/SvPasCrl strain, we evidenced cystine crystals, as well as cystine stones. We observed an heterogenous inflammatory infiltrate and cystine tubular casts in the parenchyma. We identified a single mutation and a defect of the heavy subunit rBAT. This mouse model could allow for further pathophysiological studies and may be useful to analyse the crystal/tissue interaction in cystinuria. In the second part of my thesis I will test the pathogenesis of E. coli in calcium phosphate stones. In this part, I observed calcium phosphate stones by scanning electron microscopy. I also analysed calcifying properties of wild type bacteria and mutant bacteria in urine or in specific calcifying medium. In synthetic medium phosphatases play a role in calcification but carbohydrate source seems to play a major part in the phosphatase activity. In urine some E. coli induce phosphate calcium precipitation as quickly as Klebsiella does.

Les canaux calciques neuronaux activés par la dépolarisation membranaire<br />contrôlent diverses fonctions cellulaires telles que l'excitabilité neuronale et la<br />transmission synaptique. Les canaux calciques sont formés d'une sous-unité principale<br />Cav associée à 3 sous-unités régulatrices (b, a2d et g). La sous-unité auxiliaire Cavb joue<br />un rôle crucial dans la régulation des propriétés biophysiques du canal et dans l'adressage<br />membranaire de la sous-unité Cav. Chez l'homme, un isoforme de cette sous-unité Cavb4<br />est l'objet de mutations qui conduisent à des phénotypes épileptiques. L'une de ces<br />mutations est une délétion d'une partie du domaine carboxy-terminal de Cavb4 (R482X).<br />Les efforts effectués pour comprendre les mécanismes cellulaires du phénotype<br />épileptique des patients concernés n'ont pas encore aboutit à des explications probantes.<br />Ainsi, le phénotype neurologique ne semble pas lié à une altération de l'activité du canal,<br />mais plus vraisemblablement à des fonctions cellulaires inconnues de Cavb4.<br />Ma thèse porte sur la caractérisation des déterminants moléculaires et cellulaires<br />du mutant humain R482X impliqué dans le phénotype neurologique des patients qui<br />portent la mutation. Etant donné que l'épilepsie implique essentiellement les neurones du<br />lobe temporal, je me suis particulièrement intéressée à l'étude des fonctions et de la<br />localisation de Cavb4 dans les neurones d'hippocampe. Dans ces cellules, une<br />translocation de la sous-unité Cavb4 du cytoplasme vers le noyau est notée au cours de la<br />différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de<br />la sous-unité Cavb4, elle est perdue dans le cas de la mutation R482X. La perte du<br />fragment carboxy-terminal conduit à une altération de la structure de Cavb4 suite à la<br />rupture de l'interaction intramoléculaire entre les deux domaines conservés, au sein de la<br />protéine native. Dans les neurones d'hippocampe, cette déstructuration empêche la<br />localisation nucléaire de la protéine mutante. Etant donné que la sous-unité Cavb4 ne<br />possède aucun signal d'adressage nucléaire, la technique du double hybride a été réalisée<br />afin de déterminer les partenaires protéiques capables d'adresser la sous-unité Cavb4 vers<br />le noyau. Parmi les trois protéines criblées qui interagissent spécifiquement avec Cavb4 et<br />pas avec le mutant, une est capable d'adresser Cavb4 dans le noyau alors que l'autre la<br />retient dans le cytoplasme. Afin d'étudier l'effet de la localisation nucléaire de la sousunité<br />Cavb4 sur la régulation génique, une étude transcriptomique a été réalisée. La sousunité<br />Cavb4 montre un effet répressif sur l'expression génique. Cette répression est<br />inversée dans le cas du mutant incapable de s'adresser vers le noyau des neurones. Parmi<br />ces gènes, plusieurs sont des candidats potentiels pour expliquer l'altération d'activités<br />neuronaux impliquée dans le phénotype épileptique.<br />Enfin, l'absence de l'adressage nucléaire de la sous-unité Cavb4 mutante (R482X)<br />due à la déformation de sa structure native, altèrerait la régulation transcriptionnelle des<br />gènes, qui serait à la base du phénotype épileptique des patients qui portent cette<br />mutation.

Le calcium est un élément indispensable à la formation du système nerveux. Il intervient dans de nombreuses fonctions qui permettent la mise ne place et le fonctionnement d'un organe. Le but de ce travail a été de caractériser les canaux calciques de type T dépendants du potentiel présents transitoirement dans les neurones vestibulaires primaires et de comprendre le rôle des influx calciques qu'ils induisent au cours du développement périnatal chez la souris. <br />Grâce à des études électrophysiologiques et pharmacologiques nous avons caractérisé les propriétés des sous-unités du canal de type T, Cav3.1 et Cav3.2, cette dernière générant un courant de forte amplitude à un stade précoce du développement. L'étude de l'activité électrique de ces neurones révèle la présence d'une dépolarisation post potentiel corrélée avec l'expression du canal Cav3.2.<br />L'analyse des propriétés de l'activité électrique aux stades précoces du développement révèle qu'elle présente un ralentissement de la phase de repolarisation du potentiel d'action bloqué par le cadmium. Cette activité devient plus rapide aux stades plus matures. Ces observations ont été faites à des stades de développement où se déroulent la neuritogenèse et la synaptogenèse.<br />Nous avons pu déterminer le rôle physiologique de Cav3.2 et de l'activité électrique qui découle de son activation par l'utilisation d'antisens sur un modèle de culture de neurones. En l'absence de ces dernières, un ralentissement de la pousse neuritique a été observé, démontrant l'implication cruciale des courants calciques de type T dans la formation de ce système sensoriel.

La réaction acrosomique de Mammifère nécessite l'ouverture successive de trois canaux calciques : un canal calcique activé par de faibles dépolarisations (LVA), le récepteur à l'IP3 et un canal activé par la vidange des stocks (SOC) TRPC2. Nos données montrent une intéressante interaction fonctionnelle entre le canal LVA et les protéines dont l'activité est liée au niveau de remplissage du réticulum (vraisemblablement les canaux TRPCs et l'IP3R). Toute la signalisation calcique de la RA est sous le contrôle du canal LVA qui est le premier à s'activer. En utilisant les souris déficientes pour Cav3.1, Cav3.2, nous avons montré que la sous-unité α1H est la sous-unité majoritaire dans les cellules spermatogéniques sauvages. Nos données fournissent de nouvelles hypothèses concernant l'activation de TRPC2 : celle-ci pourrait être due à des modifications de son interaction avec la junctate et l'IP3R, induite par la vidange des stocks.