Le canal cationique TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid 1) est activé par la capsaïcine, une acidose, de fortes températures ainsi que par les anesthésiques volatils (AV) dans les neurones sensoriels. Dans le muscle squelettique, TRPV1 est impliqué dans le métabolisme énergétique et l'exercice d'endurance. Grâce à des techniques d'immunomarquage et d'imagerie calcique, la première partie de la thèse vise à caractériser TRPV1 en tant que canal de fuite fonctionnel du réticulum sarcoplasmique (RS) dans les cellules musculaires squelettiques isolées de FDB (Flexor Digitorum Brevis) de souris. Par la suite, nous nous sommes intéressés à son rôle physiopathologique dans le muscle strié squelettique. Ainsi, dans une seconde partie nous supposons une implication de TRPV1 dans les crises d'hyperthermie maligne (HM) chez l'homme. Cette pathologie musculaire correspond à une crise de métabolisme exacerbé du muscle strié squelettique menant à une brusque montée en température chez le patient (>42°C) endormi au moyen d'AV. Dans cette deuxième étude nous démontrons, à travers une approche combinant imagerie calcique et outils pharmacologiques spécifiques du canal, que TRPV1 est activé lors de l'exposition des cellules musculaires à l'isoflurane. TRPV1 est donc une cible des AV dans la cellule musculaire. Puis, des variants de TRPV1 (T612M et N394del) de patients susceptibles à l'HM ont été découvertes. Nous avons pu montrer, suite à la transfection in vivo de ces variants dans des souris déficientes en TRPV1 et grâce à la mesure de flux calciques intracellulaires, que les variants humains de TRPV1 rendent ces canaux plus sensibles aux anesthésiques volatils que le canal TRPV1 humain sauvage. La troisième partie de la thèse a pour but de déterminer le rôle de TRPV1 dans le muscle squelettique en conditions physiologiques par des études fonctionnelles (fonction locomotrice, consommation d'oxygène) sur animal entier. Les résultats préliminaires de cette étude tendent à montrer que l'entraînement physique est moins efficace sur la fonction musculaire des souris déficientes en TRPV1. En conclusion, l'ensemble de ces résultats révèlent pour la première fois que TRPV1 est un canal calcique de fuite fonctionnel du RS pouvant faire le lien entre le déclenchement de l'HM au cours des anesthésies et la présence des RyR1 mutés dans le muscle squelettique / TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid 1) cation channel is activated by capsaicine, acidosis, high temperature and by volatile anaesthetics (VA) in sensory neurons. In skeletal muscle, TRPV1 appears to be implied in exercice endurance and energy metabolism. The present work aims first to characterize the functionality of this channel using immnostaining and calcium imaging. We report that TRPV1 is functionally expressed in isolated mouse skeletal muscle cells of FDB (Flexor Digitorum Brevis). These experiments point out that TRPV1 acts as a SR calcium leak channel. In contrast to earlier reports, our analysis shows that TRPV1 is only located to the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Subsequently, we have studied its physiological role in skeletal muscle. Thus, in a second part, we suppose that TRPV1 could be involved in malignant hyperthermia (MH) crisis in human. MH is a muscular pathology linked to an abrupt increase in body temperature (> 42°C) in patients. MH crisis is a severe and feared complication of anesthesia. Nevertheless, any studies have demonstrated that RyR1 mutants are activated by VA. If the triggering agents of MH are known, their targets remain to be determined. By combining calcium imaging and pharmacological agents, our data first demonstrate that TRPV1 is activated by isoflurane in skeletal muscle cells. TRPV1 is so a target of volatile anaesthetics in skeletal muscle. Afterwards, TRPV1 mutants (T612M and N394del), obtained from susceptibles MH patients, were discovered. In the second part of the work, using in vivo transfection of TRPV1 mutants in TRPV1-/- mice and intracellular calcium measurements we have been able to demonstrate that human TRPV1 mutants are more sensitive to VA than human wild type TRPV1. The last part of the work investigates the physiological role of TRPV1 in skeletal muscle, using a functional exploration (locomotor function, oxygen consumption) in TRPV1-/- mice. Preliminary data point out that training seems to be less effective on skeletal muscle function of TRPV1-/- mice. To conclude, these results indicate for the first time that TRPV1 is a functional SR calcium leak channel and that TRPV1 may be the missing link between MH induction and RyR1 mutants in skeletal muscle during anesthesia

Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique. / Voltage dependent calcium channels (VDCC) participate to various cellular processes such as neurotransmitters release, muscular contraction or gene expression regulation. VDCC are composed of a pore-forming subunit (alpha1 or Cav), that allows Ca2+ to enter the cells associated with auxiliary subunits, alpha2delta, beta and gamma. My thesis studies on a new signaling pathway in which the beta4 subunit of VDCC couples neuronal excitability to transcription. In particular it focuses on the understanding of the beta4 nuclear translocation determinants and the mechanisms of gene expression regulation by this VDCC subunit. beta4 translocation from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronal differentiation. This translocation depends on beta4 structural integrity and more precisely on interaction between the beta4 SH3 (Src Homology 3) and GK (Guanylate Kinase) domains. beta4 nuclear translocation is conditioned by its association with a partner: the regulatory subunit of phosphatase protein 2A (PP2A), B56delta. Membrane depolarization induces beta4 channel uncoupling and association with B56delta. Thus, beta4 migrates to the nucleus in complex with B56delta/PP2A. A study on gene expression generated by microarray was carried on to compare profiles of gene expression in lethargic (lh) mice, considered as spontaneous beta4 KO with wild-type (WT) mice cerebellum. This study proved the influence ofbeta4 on the repression and the activation of certain genes. Particularly, beta4 strongly represses tyrosine hydroxylase (TH) gene expression. In the nucleus, beta4 interacts with a transcription factor: the thyroid hormone receptor alpha (TR alpha). This association allows beta4/B56delta/PP2A complex to target the TH gene promoter as shown by chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments. This complex is also able to associate itself with histones and dephosphorylate Ser10 histone H3 in the TH gene promoter. This chromatin modification is correlated with HP1 gamma (Heterochromatin Protein 1 gamma) recruitment in the TH gene promoter. HP1 gamma is known to promote heterochromatin formation that could explain the TH gene repression by beta4. Thus, in lh mice cerebellum, the absence of beta4 triggers a complete disorganization of this signaling pathway that results in the up-regulation of the TH gene. R482X, the human mutation inducing the C-terminus domain deletion of beta4 and responsible for a form of juvenile myoclonic epilepsy prevents beta4 nuclear localization. In fact, the mutant beta1-481 unable to associate with B56delta/PP2A and to migrate to the nucleus does not interact with HP1gamma and histones. The signaling pathway allowing gene regulation by beta4 is prevented by the mutant. Thus, beta4 does not play a confined role in the cytoplasm as CCVD auxiliary subunit but also functions in the nucleus as a gene expression regulator.

Les plantes médicinales constituent un réservoir important de substances naturelles pour la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques. L’intérêt de ce travail est d'explorer le potentiel thérapeutique des plantes médicinales connues pour leurs vertus neuromodulatrices et potentiellement d’intérêt pour le traitement de maladies neurologiques, y compris l’épilepsie, en étudiant leur capacité à cibler l’activité des canaux calciques de type T qui jouent un rôle important dans l’hyperexcitabilité neuronale et la physiopathologie des épilepsies. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet des extraits de plantes méditerranéennes ; Lavandula stoechas, Rosmarinus officinalis et Peganum harmala, ainsi que leurs principes actifs ; le linalol, l’acide rosmarinique et l’harmaline, respectivement, sur des courants calciques de type T en utilisant la technique patch-clamp en configuration cellule-entière. Les enregistrements électrophysiologiques à partir de cellules HEK-293 exprimant les canaux T montrent que la lavande, le romarin et l’harmal réduisent significativement les courants de type T sur la gamme de potentiel membranaire testée. Les produits naturels arrivent à déplacer l'état stable d’inactivation vers des potentiels de membrane plus négatifs et certains (Peganum harmala) accélèrent significativement la cinétique d'inactivation des canaux T. Le deuxième objectif était d’étudier l’effet anticonvulsivant et/ou antiépileptique de ces plantes et du TTA-A2 ; un bloqueur sélectif des canaux T, sur un modèle animal d’épilepsie. Nos résultats valident le PTZ et la 4-AP comme inducteurs de crises chez le poisson zèbre, ces deux modèles permettant le criblage pour des molécules anticonvulsivantes et/ou antiépileptiques. Nos résultats montrent que le romarin, la lavande ainsi que le TTA-A2 inhibent les crises pseudo-épileptiques chez ces deux modèles. Dans l’ensemble, ce projet suggère que les canaux T seraient impliqués dans les propriétés neuroprotectrices et anticonvulsivantes des plantes médicinales étudiées et valide le rôle des plantes médicinales comme source intéressante de produits thérapeutiques. / Medicinal plants represent an interesting reservoir of natural substances for the discovery of new therapeutic molecules. The interest of this work is to explore the therapeutic potential of medicinal plants, which are known for their neuromodulation effects, by studying their ability to target the activity of T-type calcium channels which play a major role in neuronal hyperexcitability and the pathophysiology of epilepsy and other neurological diseases.The first objective of my thesis was to study the effect of Mediterranean plant extracts; Lavandula stoechas, Rosmarinus officinalis and Peganum harmala and their active ingredients; linalool, rosmarinic acid and harmaline, respectively, on T-type calcium currents using the patch clamp technique in whole-cell configuration. Electrophysiological recordings from HEK-293 cells expressing T-type channels show that lavender, rosemary and Harmal significantly reduce T-type currents over the potential range tested. The natural products shifted steady-state inactivation towards more negative membrane potentials and some plants (Peganum harmala) significantly accelerate the inactivation kinetics of T-type channels. The second objective was to study the anticonvulsant / antiepileptic activity of these plants as well as TTA-A2, a selective T-type channel blocker, in an epilepsy model in zebrafish. Our results validate the PTZ and 4-AP as inducers of convulsions in zebrafish and both models could be used to screen for anticonvulsant and/or antiepileptic molecules. Our results show that rosemary, lavender and TTA-A2 inhibit seizures-like activity in these two models. Overall, this project suggests that T-type channels are involved in the neuroprotective and anticonvulsant properties of the studied medicinal plants and validates the role of medicinal plants as a valuable source of therapeutic products.

L’automatisme cardiaque est généré par un mécanisme fondamental partiellement compris et controversé, initié par des cardiomyocytes spécialisés dans le nœud sino-atrial (NSA). Ces cellules pacemaker (cNSA) présentent une phase spontanée de dépolarisation diastolique (DD), qui mène le potentiel de membrane de la fin de la repolarisation du potentiel d’action (PA) au seuil de déclenchement du PA suivant. Cette activité spontanée implique plusieurs canaux ioniques à la surface de la membrane plasmique et la dynamique calcique intracellulaire. Les cardiomyocytes contractiles du myocarde expriment majoritairement le canal calcique Cav1.2 tandis que les cNSA en expriment d’autres isoformes. Ce sont les canaux calciques de type L (LTCC) Cav1.3 et de type T (TTCC) Cav3.1, qui sont impliqués dans la DD. Les souris génétiquement modifiées pour Cav1.3 et/ou Cav3.1 ont des caractéristiques physiopathologiques et sont utilisées comme modèle d’étude des dysfonctions sinusales de l’homme. La cartographie optique du NSA isolé a permis de révéler une activité électrophysiologique intrinsèque altérée par les mutations. L’expérimentation en patch clamp et en imagerie calcique des cNSA isolées montrent que les mutations altèrent la mécanistique cellulaire du pacemaker. Le couplage de ces approches à l’utilisation d’outils pharmacologiques spécifiques a permis d’évaluer la contribution des différents éléments à cette mécanistique cellulaire et de préciser les controverses sur les fondements de l’automatisme cardiaque. Cette thématique de recherche présente des enjeux majeurs dans le domaine de la santé puisque les perspectives thérapeutiques et les stratégies pharmacologiques pour traiter les dysfonctions sinusales nécessitent une connaissance intégrale du mécanisme. / Heart automaticity is generated by a basic pacemaker mechanism not fully understood and still controversial. Pacemaker activity is initiated by specialized cardiomyocytes in the Sino-atrial node (SAN). The spontaneous phase of diastolic depolarization (DDP) characterizes SAN cells (SANc). This phase drives the membrane potential of SANc from the end of the repolarization to the threshold of the next action potential (AP). This spontaneous activity involves several ion channels on the plasma membrane and the intracellular dynamic of calcium. In terms of calcium channels, atrial and ventricular cardiomyocytes express mostly Cav1.2 whereas SANc express two additional isoforms. Specifically, in SANc are expressed Cav1.3 LTCC (L type Calcium channels) and the Cav3.1 TTCC (T type Calcium channels), which are activated during the DD. Genetically modified mice inactivated for Cav1.3, Cav3.1 and Cav1.3/Cav3.1 we generated and used as a models of study of human SAN dysfunctions. In particular, we highlighted the impairment of the pacemaker activity in these mice by optical mapping of the intact SAN, and by patch clamping and calcium imaging of isolated SANc. Coupling this approaches with pharmacological tools allowed us to evaluating the contribution of the various elements constituting to the pacemaker mechanism. This thematic of research presents major issues in terms of public health. Indeed, we need a better understanding of the pacemaker mechanism to develop pharmacological strategies against SAN dysfunction.

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique s'articule sur les interactions entre le détecteur de potentiel membranaire (récepteur des dihydropyridines, DHPR), et le canal calcique du réticulum (récepteur de la ryanodine, RyR). Le DHPR est localisé dans les tubules transverses et les cavéoles, deux structures sarcolemmales enrichies en cholestérol. De plus, les cavéoles contiennent la synthase de l'oxyde nitrique (NO). Le travail présenté apporte des éléments nouveaux concernant la modulation fonctionnelle du couplage EC par le cholestérol et le NO, à l'aide d'une approche d'électrophysiologie cellulaire combinée à des mesures de fluorescence. La teneur membranaire en cholestérol régule les fonctions de canal calcique et de détecteur de potentiel du DHPR. Le NO cible spécifiquement le RyR. À des niveaux physiologiques, il module l'activation du canal lors d'une dépolarisation ; en excès, il maintient certains RyR en configuration activée

Les plantes perçoivent et enregistrent les stimuli environnementaux. Du fait de leur immobilité, elles y répondent principalement par des modifications de leur croissance et de leur morphogenèse. La modification transitoire de la concentration du calcium libre dans divers compartiments cellulaires semble avoir un rôle fondamental dans les mécanismes de perception. Les systèmes de transduction des signaux font aussi intervenir des kinases pour véhiculer l'information jusqu'au noyau cellulaire et générer une réponse spécifique. Dans ce travail nous avons étudié l'effet de stimuli abiotiques (stress mécaniques, de froid ou exposition à des micro-ondes de fréquence 0.9 et 105 GHz à une puissance non thermique) chez le lin (Linum usitatissimum L.) et Arabidopsis thaliana. Chez le lin, le modèle de la production de méristèmes épidermiques hypocotylaires nous a permis d'analyser les effets des différents stimuli en l'absence ou en présence d'inhibiteurs de canaux calciques et de chélateur du calcium. En parallèle nous avons développé l'analyse protéomique de l'hypocotyle de lin. Ainsi, nous avons établi un critère statistique permettant d'améliorer la fiabilité de détermination des changements observés sur une carte protéique obtenue par 2-DE. De plus, afin de déterminer si certains changements observés correspondent à des phosphorylations, nous avons mis au point une nouvelle technique d'analyse par spectrométrie de masse d'ions secondaires permettant de détecter directement la présence de phosphore dans un spot après une séparation électrophorétique et qui pourrait permettre la mise en évidence de phosphorylations difficiles à observer par les méthodes conventionnelles. L'analyse protéomique chez le lin a révélé que 4 protéines au moins interviennent dans la réponse rapide aux stimuli mécaniques, 7 à un choc de froid et 3 à une irradiation à 0.9 GHz. Les effets des inhibiteurs de canaux calciques et de l'EGTA portent sur 5 protéines et ceux d'une déplétion calcique (nécessaire pour induire la formation de méristèmes) sur 7. Cependant 5 parmi ces protéines sont affectées de la même façon par deux à quatre de ces stimuli et ont probablement un rôle fondamental dans le traitement des signaux abiotiques chez le lin. Parmi ces protéines une seule impliquée dans la réponse à un choc de froid a été identifiée comme étant la saccharopine déshydrogénase. L'absence de bases de données sur le lin rend difficile l'identification des protéines modifiées par les stimuli. Ainsi en utilisant le modèle Arabidopsis thaliana nous avons mis en évidence des modifications concernant quatre protéines après un choc de froid et outre ces quatre, deux autres après une irradiation de 2 h à 0.9 GHz. Parmi les protéines modifiées par ces deux stimuli, 2 ont été identifiées : l'anhydrase carbonique et la spermidine synthase. De plus l'une des protéines affectées spécifiquement par le rayonnement à 0.9 GHz est une protéine homologue aux phérophorines. Nous avons ainsi apporté des données nouvelles permettant d'avancer dans la compréhension des phases précoces du traitement des signaux abiotiques chez les plantes. En particulier nous avons montré que, de façon inattendue, les plantes perçoivent le rayonnement électromagnétique dans le domaine des GHz en utilisant probablement les voies de transduction des signaux abiotiques.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1. / Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.

Les canaux calciques dépendants du voltage (CCVD) sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou encore la régulation de l'expression génique. Les CCVD sont constitués d'une sous-unité canalaire (alpha1 ou Cav) par laquelle les ions Ca2+ entrent dans le milieu intracellulaire, associée à différentes sous-unités auxiliaires, alpha2delta, beta et gammaqui régulent leur fonction. Ma thèse a contribué à la mise en évidence d'une nouvelle voie de régulation du couplage excitation-transcription impliquant la sous-unité beta4 des CCVD. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à la compréhension des déterminants de l'entrée de beta4 dans le noyau et aux mécanismes de régulation de l'expression génique par cette sous-unité des CCVD. Un modèle animal nous a été particulièrement utile, la souris léthargique (lh), déficiente pour la sous-unité beta4 et considérée comme un modèle d'étude de l'épilepsie-absences. Une translocation de beta4 du cytoplasme vers le noyau est observée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l'intégrité structurale de beta4 et plus précisément de l'interaction de ses domaines SH3 (Src Homology 3) et GK (Guanylate Kinase). La translocation de beta4 au noyau nécessite son association avec un partenaire : la sous-unité régulatrice de la protéine phosphatase 2A (PP2A), B56delta. La dépolarisation membranaire permet un décrochage de beta4 du canal et son association à B56delta. beta4 migre donc vers le noyau sous forme de complexe avec B56delta/PP2A. Une étude transcriptomique réalisée pour comparer le profil d'expression dans le cervelet de souris lh par rapport aux souris wild-type a montré l'implication de beta4 dans la répression et l'activation d'un certain nombre de gènes. Particulièrement beta4 réprime fortement l'expression du gène qui code pour la tyrosine hydroxylase (TH). Dans le noyau, beta4 interagit avec un facteur de transcription, le récepteur aux hormones thyroïdiennes alpha(TRalpha). Cette association permet au complexe beta4/B56delta/PP2A de cibler la région promotrice du gène TH comme cela a été montré par des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Le complexe beta4/B56delta/PP2A est capable de s'associer aux histones et de déphosphoryler spécifiquement les histones H3 en Ser10 au niveau de la région promotrice du gène TH. Cette modification de la chromatine est corrélée avec le recrutement de Heterochromatin Protein 1 gamma (HP1gamma au niveau du promoteur du gène TH. HP1gamma est impliquée dans la formation d'hétérochromatine et pourrait expliquer la répression de l'expression du gène TH. Ainsi dans le cervelet de souris lh, l'absence de beta4 déclenche un dérèglement de cette voie de signalisation qui entraîne la sur-expression du géne TH. La mutation humaine R482X à l'origine de la délétion d'une partie du domaine C-terminal de beta4 et responsable d'une forme d'épilepsie juvénile myoclonique, perturbe la localisation nucléaire de beta4. En effet, le mutant beta1-481 incapable de s'associer à B56delta/PP2A et de migrer au noyau n'interagit pas avec les histones. La voie de signalisation permettant la régulation de l'expression génique par beta4 n'est donc plus assurée par le mutant. Ainsi, la fonction debeta4 ne se limite pas à son action cytoplasmique en tant que sous-unité auxiliaire des CCVD. En effet, ce travail montre combien dans le noyau,beta4, joue un rôle important dans la régulation de l'expression génique.

La conductivité hydraulique foliaire (KF) est une composante majeure du transport d'eau dans toute la plante. Dans les feuilles de noyer, la KF est stimulée à la lumière et est étroitement liée à l'accroissement du taux des transcrits d'aquaporines JrPIP2s. Par ailleurs, la corrélation entre la stimulation de la KF et des transcrits d'aquaporines à la lumière, n'est pas générale et dépend de l'espèce. Ici, nous étudions cette corrélation chez cinq espèces forestières (Juglans regia, Fagus sylvitica, Quercus robur, Salix alba et Populus tremula) différant par leur réponse à la lumière. Nous démontrons seulement chez le noyer (Juglans regia), la contribution des deux familles d'aquaporines PIP1s et PIP2s. Afin de mieux comprendre le rôle des JrPIP1s et JrPIP2 dans la réponse à la lumière, nous avons isolé 8 nouvelles isoformes dans les feuilles de noyer et nous avons étudié leurs profils d'expression sur une cinétique lumière. Toutes les isoformes étudiées sont accumulées à la lumière et réprimées à l'obscurité. De plus, la KF est dépendante de la qualité de lumière. Elle est réduite de 65% en absence de lumière bleue. Cette diminution serait liée à l'inhibition des transcrits d'aquaporines. Afin de caractériser les mécanismes moléculaires précoces impliqués dans la modulation de KF par la lumière, l'approche globale cDNA-AFLP a été menée sur des feuilles de noyer sous différentes conditions d'éclairement. Nous obtenons 12000 transcrits différentiels dérivés (TDFs) générés par les 128 couples d'amorces. Parmi les 187 séquences obtenues, 93 d'entre elles ont une fonction putative. Leur classification fonctionnelle montre que les gènes relatifs à la régulation cellulaire représentent environ 58% des TDFs identifiés. Les feuilles exposées à la lumière, montrent des changements dans les voies de : signalisation calcique, protéolyse, trafic vésiculaire et l'expression de divers facteurs de transcription et protéines de régulation. Pour mieux comprendre le rôle potentiel de la signalisation calcique dans la modulation de la KF par la lumière, nous avons étudié l'effet d'un inhibiteur des canaux calciques [LaCl3] et d'un antagoniste de calmoduline [W7] sur la KF et les transcrits des 10 JrPIPs. Comparées aux feuilles témoins, les inhibiteurs calciques provoquent une réduction de la KF et de la majorité des JrPIPs étudiées à la lumière. Nos résultats confirment l'implication du complexe Ca2+ /calmoduline dans la transduction du signal lumineux responsable de la stimulation de la KF et des transcrits d'aquaporines chez le noyer.

Les anticorps monoclonaux (AcM) anti-CD20 sont essentiels pour le traitement du lymphome non hodgkinien et de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Les AcM agissent soit en activant directement la signalisation apoptotique dans les cellules cibles, soit via le système immunitaire. Dans une étude préclinique, nous avons montré que le traitement avec AcM anti-CD20, rituximab et GA101, induit l'expression de la protéine early growth response 1 (EGR-1) (Dalle et al., 2011). EGR-1 est un facteur de transcription régulé par le calcium (Ca2+) et CD20 est impliqué dans la régulation du flux calcique transmembranaire. Nous avons donc étudié le rôle d'EGR-1 et du flux Ca2+ dans l'activité cytotoxique des AcM anti-CD20. Nous avons montré qu'EGR-1 est rapidement induit suite à l'exposition au rituximab et à GA101. La baisse de l'expression d'EGR-1 par shRNA a supprimé l'effet cytotoxique du GA101 à la fois in vitro et in vivo, indiquant qu'EGR-1 est requis pour la mort cellulaire médiée par CD20. De plus, la surexpression d'EGR-1 augmente la sensibilité au GA101 in vitro et in vivo. En outre, nos résultats indiquent que les AcM anti-CD20 induisent un flux Ca2+. Le blocage du flux Ca2+ par inhibiteurs de canaux calciques (ICC) a aboli l'induction d'EGR-1 ainsi que l'efficacité du GA101 in vivo et ex vivo dans des échantillons de LLC. Plus important, nos données indiquent que les patients recevant des ICC ont une moins bonne réponse au traitement par les AcM anti-CD20. En conclusion, nous avons identifié EGR-1 comme potentiel biomarqueur pour prédire la réponse à la thérapie anti-CD20 et démontré que les ICC ont un impact négatif sur l'efficacité des AcM anti-CD20 chez les patients / Anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) are an essential component of the treatment of patients with non-Hodgkin's lymphoma and chronic lymphocytic leukemia (CLL). They mediate their antitumor effects by activating the immune system or by direct apoptotic signaling in target cells. In a previous preclinical study, we showed that treatment with anti-CD20 mAbs, rituximab and GA101, resulted in upregulated expression of early growth factor 1 (EGR-1) (Dalle et al. 2011). EGR-1 is a calcium (Ca2+) regulated transcription factor and CD20 is hypothesized to regulate transmembrane Ca2+ flux. Therefore, we aimed to assess the role of EGR-1 and Ca2+ flux in the cytotoxic activity of anti-CD20 mAbs. We have shown that EGR-1 expression is rapidly upregulated in CD20+ cells following rituximab and GA101 exposure. Decreasing EGR-1 expression by shRNA abolishes the direct cytotoxic effect of GA101 both in vitro and in vivo, indicating that EGR-1 is required for CD20-mediated cell death. Additionally, the overexpression of EGR-1 enhances the cytotoxic activity of GA101 both in vitro and in vivo. Furthermore, our results indicate that anti-CD20 mAbs induce calcium influx. Blocking the Ca2+ flux with calcium channel blockers (CCB) abolishes EGR-1 induction and impaires the GA101 efficacy in vivo and ex vivo in CLL blood samples. More importantly, our data indicate that patients receiving CCBs and anti-CD20 therapy have worst progression free survival and overall survival. In conclusion we have identified EGR-1 as a potential biomarker to predict response to anti-CD20 therapy. We demonstrated that co-treatement with CCBs negatively impacts the outcome of patients receiving anti-CD20 mAbs