by Lee Wing-cheung. / "November 2001." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2001. / Includes bibliographical references (p. 152-169). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

A novel calmodulin (CaM)-binding cysteine-rich protein from Dictyostelium, cyrA, with epidermal growth factor-like (EGFL) repeats was discovered and characterized. Calcium-dependent and –independent CaM-binding was verified. Western blots show that full length cyrA is detected constitutively throughout development. Analyses of the extracellular medium reveal that cyrA is cleaved and that the fragments containing the N-terminus are secreted early in development, while those containing the C-terminus are secreted later. In support of this, GFP and immunohistochemistry studies reveal that cyrA localizes to the endoplasmic reticulum and secretory vesicles of vegetative cells, and to the extracellular matrix (slime sheath) of migrating slugs. The addition of EGFL1 peptides enhanced cell motility and cAMP-mediated chemotaxis. Finally, cyrA cleavage is regulated by extracellular Dictyostelium CaM and by the extracellular EGFL repeats. In total the data suggest that cyrA is a true matricellular protein that mediates cell motility during multicellular development.

A novel calmodulin (CaM)-binding cysteine-rich protein from Dictyostelium, cyrA, with epidermal growth factor-like (EGFL) repeats was discovered and characterized. Calcium-dependent and –independent CaM-binding was verified. Western blots show that full length cyrA is detected constitutively throughout development. Analyses of the extracellular medium reveal that cyrA is cleaved and that the fragments containing the N-terminus are secreted early in development, while those containing the C-terminus are secreted later. In support of this, GFP and immunohistochemistry studies reveal that cyrA localizes to the endoplasmic reticulum and secretory vesicles of vegetative cells, and to the extracellular matrix (slime sheath) of migrating slugs. The addition of EGFL1 peptides enhanced cell motility and cAMP-mediated chemotaxis. Finally, cyrA cleavage is regulated by extracellular Dictyostelium CaM and by the extracellular EGFL repeats. In total the data suggest that cyrA is a true matricellular protein that mediates cell motility during multicellular development.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2007. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xi, 82 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [90]-109).

Thesis (M.S.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed June 30, 2007). Includes bibliographical references (p. 30-36).

BAI2 gehört zu den Adhesion-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (aGPCR). Diese bisher wenig untersuchte Klasse von ca. 30 GPCR ist charakterisiert durch eine komplexe genomische Struktur, sehr große extrazelluläre Domänen und eine Vielzahl von Splicevarianten. Bisher ist bei den meisten aGPCR, wie auch bei BAI2, wenig über ihre Signaltransduktion und Funktion bekannt. Zum Verständnis der physiologischen Relevanz und zur Suche nach dem endogenen Agonist sind Kenntnisse über Proteinstruktur, Splicevarianten und Signaltransduktion essentiell. Ziel dieser Arbeit war es, mittels verschiedener in vitro-Methoden die Proteinstruktur des BAI2 in den transmembranären und intrazellulären Domänen näher zu untersuchen, sowie die natürlichen Splicevarianten in diesem Bereich, deren evolutionäre Konservierung, Gewebespezifität und Quantität zu erfassen. Für beide gefundenen Splicevarianten, eine im dritten intrazellulären Loop (ICL3) und eine im C-Terminus, konnte eine evolutionäre Konservierung auf Aminosäure- und genomischer Organisationsebene, sowie ihre Entstehung durch Exonskipping nachgewiesen werden. Nachfolgend wurden die Splicevarianten auf mögliche Interaktionen mit intrazellulären Komponenten untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass beide ICL3-Splicevarianten natürlicherweise in einem definierten Verhältnis auftreten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die lange ICL3-Variante des BAI2 nicht zu einer Änderung der Membrantopologie des Rezeptors, einer Homodimerisierung über die zusätzliche Aminosäuresequenz oder zu einer Interaktion mit dem C-Terminus führt. Die Splicevariante im humanen C-Terminus des BAI2 konnte als eine variable, durch Exonskipping entstandene Calcium-unabhängige Calmodulin-Bindungsstelle identifiziert werden. Diese Arbeit belegt die Existenz mehrerer BAI2-Isoformen in vivo. Die Struktur dieser Isoformen lässt unterschiedliche Funktionalitäten vermuten. Auch wenn erste Untersuchungen zwischen den beiden ICL3-Varianten keinen Unterschied ergaben, sind diese Erkenntnisse für die weitere Analyse der Signaltransduktion und Ligandensuche bedeutend. Es ist z.B. denkbar, dass sich die beiden ICL3-Varianten in der G-Protein-Kopplung oder bei der Rekrutierung von intrazellulären Interaktionspartnern unterscheiden oder dass die Splicevariante im C-Terminus zu einer Scaffold- Funktion des Calmodulins führt und/oder die Signaltransduktion durch eine permanente Bindung des Calmodulins an einer Isoform moduliert wird.

The aromatic amino acids tryptophan, tyrosine, and phenylalanine have been extensively used for different label-free protein studies. These investigations extract information on protein conformations and interactions from the emitted fluorescence's intensity, wavelength, and/or polarization. Like most fluorescent organic compounds, these amino acids also undergo transitions into dark meta-stable states, including triplet and photo-radical states. These transitions are notably sensitive to the surrounding environment, offering an additional set of parameters that reflect the protein's interactions, folding states, and immediate surroundings. Transient State (TRAST) monitoring has been developed to quantify fluorophore transition dynamics by recording the average fluorescence intensity in response to a modulated excitation. In this work, we performed TRAST experiments to investigate tyrosine autofluorescence and used it to detect conformational changes in calmodulin, a calcium-binding protein containing two tyrosine residues. A photophysical model for tyrosine was established, and it was revealed how tyrosine's dark state transitions changed with excitation intensity, solvent pH, and redox conditions. The TRAST experiments demonstrated that tyrosine's dark state transitions could serve as valuable information sources for label-free analyses of protein conformations and interactions. / De aromatiska aminosyrorna tryptofan, tyrosin och fenylalanin har använts i stor utsträckning för olika inmärkningsfria proteinstudier. Dessa undersökningar extraherar information om proteinkonformationer och interaktioner från den emitterade fluorescens intensiteten, dess våglängd och/eller polarisering. Liksom de flesta fluorescerande organiska föreningar genomgår dessa aminosyror också övergångar till mörka metastabila tillstånd, inklusive triplett- och fotoradikaltillstånd. Dessa övergångar är särskilt känsliga för den omgivande miljön, och erbjuder en extra uppsättning parametrar som återspeglar proteinets interaktioner, vikningstillstånd och omedelbara omgivningar. Transient State (TRAST) monitorering har utvecklats för att kvantifiera fluoroforövergångsdynamik genom att registrera den genomsnittliga fluorescensintensiteten som svar på en modulerad excitation. I detta arbete utförde vi TRAST-experiment för att undersöka tyrosinautofluorescens och använde den för att detektera konformationsförändringar i calmodulin, ett kalciumbindande protein som innehåller två tyrosiner. En fotofysikalisk modell för tyrosin etablerades, och hur tyrosins mörka tillståndsövergångar förändrades med excitationsintensitet, lösningsmedels pH och redoxförhållanden kunde faststållas. TRAST- experimenten visade att tyrosins mörka tillståndsövergångar kan fungera som värdefulla informationskällor för inmärkningsfria analyser av proteinkonformationer och interaktioner.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2008. / Härtill 4 uppsatser.

published_or_final_version / abstract / Anatomy / Master / Master of Philosophy