FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Letinas tem sido usadas como modelo de bases moleculares em estudo da interaÃÃo e especificidade de proteÃna-carboidrato por serem capazes de decifrar o glicÃdigo de estruturas celulares. O objetivo do presente estudo foi purificar e resolver a estrutura primÃria completa usando espectrometria de massas tandem e a estrutura tridimensional da lectina de Camptosema pedicellatum (CPL) complexada com 5-bromo-4-cloro-3-indol-α-D-manose (X-Man) por cristalografia de raios X. CPL foi purificada em um Ãnico passo por cromatografia de afinidade. Os resultados de espectrometria de massas revelou que CPL apresenta uma combinaÃÃo de cadeias com pesos de 25.298 Â 2 Da (cadeia-α), 12.835 Â 2 Da (cadeia-β) e 12.481 Â 2 Da (cadeia-γ). A estrutura cristalina resolvida da CPL apresenta uma mutaÃÃo conservativa no subsÃtio hidrofÃbico, um componente do domÃnio de reconhecimento a carboidrato (CDR), indicando a relevÃncia da interaÃÃo hidrofÃbica no estabelecimento de interaÃÃes com os carboidratos. A substituiÃÃo e anÃlise da interaÃÃo da CPL com o X-Man tambÃm revelou que o efeito hidrofÃbico causado por uma pequena mudanÃa no subsÃtio hidrofÃbico interfere na formaÃÃo de pontes de hidrogÃnio devido a orientaÃÃo espacial do grupo indol no CDR. / Lectins have been used as models for studies of the molecular basis of protein% carbohydrate interaction and specificity by deciphe ring codes present in the glycan structures. The purpose of the present study was to purify and solve the complete primary and crystal structure of the lectin of Camptosema pedicellatum (CPL) complexed with 5%bromo%4%chloro%3%indolyl%α%D%manno se (X%Man) using tandem mass spectrometry. CPL was purified by single%step affin ity chromatography. Mass spectrometry findings revealed that purified CPL fe atures a combination of chains weighing 25,298 Â 2 Da (α%chain), 12,835 Â 2 Da (β% chain) and 12,481 Â 2 Da (γ% chain). The CPL amino acid sequence features a cons ervative mutation which correspond to the hydrophobic subsite, a constitue nt of the carbohydrate recognition domain (DRC), indicating the relevance of hydrophob ic interactions in the establishment of interactions with carbohydrates. T he substitution and the analysis of the interactions with X%Man also revealed that the hydrophobic effect caused by a minor change in the hydrophobic subsite interferes in the formation of H%bonds due to the reorientation of the indolyl group in the DRC.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFAHB.pdf: 1628733 bytes, checksum: fd3eaf59b3ea3ad27f519f1d97d21f33 (MD5) Previous issue date: 2007-11-01 / Financiadora de Estudos e Projetos / Lectins are (glico) proteins of non immune origin able to cause cellular agglutination or precipitation of glicoconjugates. Legume lectin refers to plant lectins that are found exclusively in species of the Leguminosae family. A notable characteristic of legume lectins is that all their proteins share tertiary structure consisting of a jelly-roll motif, which is basically composed by β sheet, but present great variability the quaternary association. This variability is considered responsible for conferring different degrees of stability to the legume lectins. This work presents the isolation and characterization of the camptosemin, a protein of legume lectins family, isolated from seeds of Camptosema ellipticum, a plant that belongs to the Brazilian open pasture. Camptosemin found to be a tetrameric protein, whose protomers exhibits approximately 26 kDa. It was able to agglutinate erythrocyte of all ABO sanguineous types and it was showed high affinity for N-acetylgalactosamin carbohydrate. Spectroscopic assays have demonstrated that camptosemin is an extremely resistant protein against the thermal and chemical unfolding. Through the analysis of the unfolding curves and the refolding assays, a model of two states for the unfolding of the protein was proposed. According to this model, at the equilibrium, only presents native tetramers and unfolded monomers. The obtained values of Tm and are in agreement with the ones described for other lectins. G O H Δ 2 / Lectinas são (glico)proteínas de origem não imune capazes de causar aglutinação celular e/ou precipitação de glicoconjugados. O termo lectina de legume refere-se às lectinas de plantas que são encontradas exclusivamente em exemplares da família Leguminosae. Uma característica notável das lectinas de legumes é que todas as proteínas compartilham estrutura terciária constituída pelo motivo jelly-roll , que é basicamente composto por folhas-β, mas apresentam grande variabilidade nas formas de associação quaternária. Acredita-se que esta variabilidade seja responsável por conferir diferentes graus de estabilidade a estas lectinas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização da camptosemina, uma proteína da família das lectinas de leguminosas, isolada a partir de sementes de Camptosema ellipticum, uma planta pertencente ao cerrado brasileiro. Camptosemina mostrou-se como uma proteína tetramérica, cujos protômeros apresentam aproximadamente 26 kDa, capaz de hemoaglutinar todos os tipos sanguíneos do sistema ABO e com afinidade de ligação ao carboidrato N-acetilgalactosamina. Ensaios de estabilidade estrutural utilizando técnicas espectroscópicas demonstraram que camptosemina é uma proteína extremamente resistente a desnaturação térmica e química. Através da análise das curvas de desnaturação e dos ensaios de reenovelamento, foi proposto um modelo de dois estados para o processo de desnaturação da proteína, no qual, durante o equilíbrio, só existem tetrâmeros completamente enovelados e monômeros completamente desnaturados. Os valores de Tm e obtidos estão em conformidade com os de outras lectinas, encontrados na literatura. G O H Δ 2