Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas, que no Brasil é transmitida pelos carrapatos Amblyomma cajennense e A. aureolatum. Para elucidar os mecanismos de virulência sobre seus vetores, construímos bibliotecas subtrativas utilizando RNA de A. aureolatum infectados ou não com o patógeno. Com a análise bioinformática, foram obtidas 56 sequências únicas com expressão induzida e 12 com expressão reprimida pela infecção. Após a validação dos dados por RT-qPCR 3 genes foram caracterizados por RNAi: uma hebraeína, uma proteína dissulfeto isomerase (PDI) e uma proteína com domínio Kunitz-type. Um maior número de carrapatos adquiriu R. rickettsii quando a expressão gênica da hebraeína e da PDI foi silenciada, sugerindo que elas participam na defesa do carrapato contra a infecção. Nenhum efeito foi observado sobre a transmissão da bactéria para o hospedeiro ou sobre o fitness de carrapatos nos três genes analisados. O presente estudo apontou genes importantes que possibilitam uma melhor compreensão da relação carrapato-riquétsia. / Rickettsia rickettsii is the etiological agent of Rocky Mountain Spotted Fever and, in Brazil, it is transmitted by Amblyomma cajennense and A. aureolatum. To elucidate mechanisms of virulence to its vectors, we construct cDNA libraries with RNA of ticks A. aureolatum infected or not with this pathogen. After bioinformatic analysis, 56 unique sequences were obtained representing up-regulated genes and 12 down-regulated by infection. After data validation by RT- qPCR, 3 genes were characterizated by RNAi: a hebraein, a protein disulfide isomerase (PDI), and a protein with Kunitz-type domain. A higher number of ticks acquired R. rickettsii when the gene expression of hebraein and PDI was silenced, suggesting that both proteins participate in the defense of the tick against infection. No effect on the transmission of the bacterium to the host or on the fitness of ticks was observed after knockdown of the 3 analyzed genes. Data obtained by the present study pointed out important genes that provide information to better understand of the tick-rickettsia relationship.

A Febre Maculosa Brasileira causada por riquétsias do Grupo Febre Maculosa (GFM) e transmitida por carrapatos ocorre principalmente na Região Sudeste, onde óbitos humanos são registrados. No estado do Rio de Janeiro, a letalidade devido à riquetsiose é alta, mas só recentemente investigações epidemiológicas foram realizadas, e indicaram a participação de novas espécies de ectoparasitas na circulação das riquétsias. O objetivo geral do projeto é avaliar riquétsias em ectoparasitos coletados em áreas de casos humanos de Febre Maculosa, suspeitos, compatíveis ou confirmados, em municípios do estado com focos recentemente comunicados. A detecção e análise de genes riquetsiais indicam a presença de Rickettsia bellii, Rickettsia felis e Rickettsia rickettsii, nos vetores Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Boophilus microplus, Ctenocephalides felis e Ctenocephalides canis, sugerindo ampla distribuição geográfica de riquétsias GFM, nas regiões Serrana, Noroeste Fluminense e Médio Paraíba do estado. / Brazilian spotted fever caused by spotted fever group (SFG) rickettsiae and mainly transmitted by ticks occurs in the southeast, where human deaths are recorded. In the state of Rio de Janeiro, lethality due to rickettsial infection is high, but only recently epidemiological investigations were conducted, and indicated the participation of new species of ectoparasites in rickettsiae circulation. The project\'s overall objective is to evaluate rickettsiae in ectoparasites collected in areas of human suspected, confirmed or compatible cases of spotted fever, in cities of the State with the recently reported outbreaks. The detection and analysis of rickettsial genes indicate the presence of Rickettsia bellii, Rickettsia felis and Rickettsia rickettsii in the vectors Amblyomma cajennense, Amblyomma dubitatum, Boophilus microplus, Ctenocephalides felis and Ctenocephalides canis, suggesting broad geographic distribution of SFG rickettsiae in the regions Serrana, Noroeste Fluminense and Médio Paraíba of the State.

Poucos são os estudos acerca da saúde de onças-pintadas em vida livre. Visando obter melhores parâmetros para avaliação clínica desta espécie ameaçada de extinção, foram realizados exame clínico, hemograma, perfil bioquímico e acompanhamento de 10 onças-pintadas da região de Corumbá, no Pantanal do Mato Grosso do Sul. Além disso, buscando obter informações sobre o possível papel da espécie como suscetível, hospedeira ou sentinela de patógenos de importância em saúde pública e animal, amostras destas 10 onças foram testadas através de métodos sorológicos para verificar contato com vírus rábico, Rickettsia spp. e Ehrlichia canis. As amostras das onças e os carrapatos que as parasitavam no momento das capturas foram testados por reação em cadeia pela polimerase para a família Anaplasmataceae e os gêneros Rickettsia, Borrelia, Coxiella, Hepatozoon e Babesia. Este é o primeiro estudo a relatar os valores de hemograma e perfil bioquímico de uma população de onças-pintadas de vida livre. Dois animais, assintomáticos, apresentaram baixo título sorológico para o vírus da raiva, sugerindo contato da espécie com este patógeno. Todas as onças capturadas foram consideradas soropositivas para Rickettsia spp., e Rickettsia parkeri foi sequenciada a partir de um Amblyomma triste que estava parasitando um dos animais. Foi descoberta uma possível nova espécie do gênero Ehrlichia através do sequenciamento de DNA obtido de um Amblyomma triste e um Amblyomma cajenense que estavam parasitando onças. Quatro onças-pintadas foram consideradas soropositivas para Ehrlichia canis, possivelmente uma reação cruzada com esta outra espécie. Todas as onças-pintadas avaliadas neste estudo apresentaram DNA de Cytauxzoon sp., com 98% de similaridade a C. felis, em amostras sanguíneas. Todas as onças avaliadas neste estudo apresentaram DNA de Hepatozoon sp., com 98% de similaridade a H. felis, em amostras sanguíneas. As onças apresentavam boas condições de saúde geral. / Few studies have been conducted to investigate the health of free-ranging jaguars. In order to obtain better parameters for clinical evaluation of this endangered species, clinical exams, hemogram, biochemical tests and ecological monitoring were done for 10 jaguars in the Pantanal region - Corumbá City, Mato Grosso do Sul State. This project also evaluated the possible role of this species as susceptible, host or sentinel for pathogens of public and/or animal health importance, testing samples from these animals by serological methods to rabies virus, Rickettsia spp. and Ehrlichia canis. All samples and all ticks collected from the jaguars were also tested by polymerase chain reaction to the Anaplasmataceae family and the genera Rickettsia, Borrelia, Coxiella, Hepatozoon and Babesia. This is the first report of hemograms and biochemical profile of a free-ranging jaguar population. Two asymptomatic animals presented low seropositivity for rabies virus, suggesting contact with this pathogen. All jaguars were considered seropositive for Rickettsia spp., and Rickettsia parkeri was sequenced from an Amblyomma triste that was parasitizing one of the animals. A possible new species of the genus Ehrlichia has been identified by DNA sequencing obtained from an Amblyomma triste and an Amblyomma cajenense that were parasitizing jaguars. Four jaguars were considered seropositive for Ehrlichia canis, possibly a cross-reaction with this other species. All jaguars evaluated in this study presented DNA fragments of Cytauxzoon sp., 98% similarity to C. felis in blood samples. In addition, all jaguars presented DNA fragments of Hepatozoon sp., 98% similarity to H. felis in blood samples. In general, these jaguars presented good health.

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture

Com o objetivo de obtermos isolados de Rickettsia spp. para confirmar as evidências sobre o papel do A. dubitatum e do A. triste na transmissão de riquétsia do GFM no Brasil e Uruguai, respectivamente, realizou-se em áreas endêmicas para febre maculosa nesses dois países, a avaliação da presença de riquétsia em carrapatos da espécie A. dubitatum no município de Pedreira, estado de São Paulo e em carrapatos da espécie A. triste, em uma área suburbana no sudeste do Uruguai, além da tentativa de isolamento em cultivo de células Vero e posterior caracterização molecular de isolados provenientes dessas duas espécies de carrapatos. Foram coletados um total de 841 (367 machos e 474 fêmeas) carrapatos adultos da espécie A. dubitatum e 78 (25 machos e 53 fêmeas) amostras de A. triste, os quais foram submetidos ao teste de hemolinfa. Todas as amostras foram submetidas à extração de DNA e testadas pela técnica da PCR para o gene gltA, presente em todas as espécies de riquétsias. Dos 841 A. dubitatum colhidos, em 153 (18,18%) amostras de hemolinfa foram observados organismos morfologicamente compatíveis com riquétsias, 452 foram negativas (53,74%) e 236 (28,06%) amostras de carrapatos foram inconclusivas. Todas as 78 amostras de carrapatos da espécie A. triste provenientes do Uruguai foram negativas no teste de hemolinfa. Dos 841 A. dubitatum, um total de 378 (44,94%) amostras foram positivas para o gene gltA e, posteriormente, foram testadas para o gene ompA, sendo que nenhuma das amostras foi positiva. Dos 378 A. dubitatum positivos na PCR, o produto amplificado de 93 foi seqüenciado, sendo todos identificados como Rickettsia bellii de acordo com seqüências disponíveis no GenBank. Das 78 amostras de carrapatos da espécie A. triste, provenientes do Uruguai, duas amostras, denominadas de carrapatos #5 e #35, foram positivas na PCR e, submetidas à tentativa de isolamento em células Vero, pela técnica de \"shell vial\". O estabelecimento do isolado de riquétsia somente foi obtido com sucesso do carrapato #5, sendo este isolado designado de At#5-URG, o qual foi depositado como amostra de referência em nosso laboratório. Amostras de DNA do isolado At#5-URG foram testadas para uma bateria de oligonucleotídeos iniciadores objetivando a amplificação de fragmentos de mais três genes de riquétsias: gltA, ompB e omp, os quais foram, posteriormente seqüenciados e os fragmentos de 1.084, 775 e 491 nucleotídeos dos genes gltA, ompB e ompA, respectivamente, foram obtidos e mostraram 100% de identidade com as seqüências correspondentes disponíveis no GenBank para a cepa Maculatum de Rickettsia parkeri dos EUA. / Owing to the potential role of the tick Amblyomma dubitatum and Amblyomma triste in the transmission of the Spotted Fever Group (SFG) Rickettsia, this study evaluated infection by Rickettsia in ticks collected in Brazil and Uruguay, where rickettsial infection is endemic. A total of 841 (367 males e 474 females) A. dubitatum adult ticks were collected in Pedreira, an area of Brazilian Spotted Fever (BSF) endemicity in the state of São Paulo, and 78 adult ticks (25 males, 53 females) identified as A. triste were collected from vegetation in the suburban area of Toledo Chico, southern Uruguay. At the laboratory, all samples were individually processed by the hemolymph test with Gimenez staining and PCR targeting a fragment of the rickettsial gene gltA, present in all Rickettsia species. From 841 A. dubitatum ticks tested by the hemolymph test, 153 (18.18%) samples were positive, 452 (53.74%) were negative, and 236 (28.06%) were inconclusive. All 78 samples of A. triste ticks from Uruguay were negative by the hemolymph test. All 841 samples of A. dubitatum were submitted to PCR, being 378 (44.94%) positive and afterwards tested by PCR targeting a 150-bp fragment of the ompA (a major outer membrane protein A present only in SFG Rickettsia), being all samples negative. From the 378 PCR-positive samples of A. dubitatum, DNA sequence was determined for 93 samples, being all identified as Rickettsia bellii according to GenBank available sequences. For the A. triste samples, only 2 ticks (1 male, 1 female) yielded expected amplicons by PCR. Rickettsia isolation in cell culture was attempted by using the shell vial technique from these two PCR-positive ticks. Rickettsiae were successfully isolated and established in Vero cell culture from the female tick. This isolate, designated as At#5-URG, has been deposited as a reference strain in the Rickettsial Collection of Faculty of Veterinary Medicine in the University of São Paulo. DNA extracted from infected cells of the third passage was tested by a battery of PCRs that used primer pairs targeting fragments of 3 rickettsial genes: gltA, ompB (a major outer membrane protein B), and ompA. PCR products of expected size were obtained in all reactions and subjected to DNA sequencing. Fragments of 1,084, 775, and 491 bp of the gltA, ompB, and ompA genes, respectively, were obtained and showed 100% identity to the corresponding sequences available in GenBank for the Maculatum strain of Rickettsia parkeri from United States.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) são essenciais na resposta imune dos artrópodes aos microrganismos. Este estudo teve como objetivo a caracterização do estresse oxidativo das células embrionárias BME26 do carrapato R. microplus em resposta à infecção por A. marginale. Mostrou-se que A. marginale invade as células BME26 durante a primeira hora. No perfil de expressão de diversos genes codificadores de proteínas que estão envolvidas na produção e destoxificação de ERO e ERN após desafios com A. marginale e R. rickettsii, foi observado que A. marginale inibiu os transcritos das enzimas oxidantes 72 horas após a infecção. Em contrapartida os genes codificadores das enzimas antioxidantes foram todos induzidos. O perfil de expressão gênica pela infecção por R. rickettsii foi diferente do obtido com A. marginale uma vez que se detectou uma maior indução dos genes oxidantes e repressão dos antioxidantes. O silenciamento de quatro genes antioxidantes por RNAi indicaram o envolvimento da resposta redox no controle da infecção por A. marginale. Com isto se demonstra que o estresse oxidativo é importante no controle da infecção pela bactéria nas células BME26 podendo afetar a capacidade vetorial do carrapato na transmissão desse patógeno. / The production of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (ERN) is essential in the immune response of the arthropods. The aim of this study was the characterization of the oxidative stress of the embryonic cell line BME26 from the cattle tick R. microplus in response to A. marginale infection. It was shown that A. marginale invade BME26 cells during the first 1 hour. The expression profile of sixteen genes encoding proteins involved in either production or detoxification of ROS and RNS in response to A. marginale e R. rickettsii, was shown A. marginale caused a down-regulation of the genes encoding the oxidant enzymes in 72 hours after infection. In contrast the genes encoding the antioxidant were induced. The gene expression pattern in response to R. rickettsii was different from that triggered by A. marginale challenge, with induction of oxidant genes and down-regulation of antioxidant genes. The knockdown of four genes encoding the antioxidant enzymes by RNAi suggests that redox response play a role in the control of infection by A. marginale. Our dataset have shown the importance of the oxidative stress to control A. marginale infection by BME26 cells and might have implications on the vectorial capacity of R. microplus in transmission of this pathogen.

Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da febre maculosa das Montanhas Rochosas, a mais letal dentre as riquetsioses que acometem o homem. A principal espécie de carrapato-vetor de R. rickettsii na área metropolitana da cidade de São Paulo é Amblyomma aureolatum. Quando um carrapato em jejum no solo encontra um hospedeiro vertebrado e inicia a alimentação sanguínea, R. rickettsii é exposta a uma elevação da temperatura e aos componentes da refeição sanguínea. Ambos os estímulos foram previamente associados à reativação da virulência da bactéria em carrapatos, porém, os fatores responsáveis por essa conversão do fenótipo avirulento em virulento não foram completamente elucidados até o momento. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar os efeitos desses dois estímulos ambientais sobre o perfil de expressão gênica dessa bactéria durante a infecção de A. aureolatum. Inicialmente, estabelecemos um sistema de propagação de riquétsias para obter material genético suficiente para a padronização dos procedimentos de preparação de amostras para os experimentos de microarranjos. Para tal, estabelecemos, pela primeira vez, a infecção de uma cepa patogênica brasileira de R. rickettsii em células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (BME26). Através da utilização de microarranjos de oligonucleotídeos customizados, analisamos os efeitos da elevação da temperatura em 10°C e da alimentação sanguínea sobre o perfil transcricional da bactéria infectando o conjunto de órgãos de fêmeas de A. aureolatum. Esse é o primeiro estudo da expressão gênica global de uma bactéria do gênero Rickettsia infectando um carrapato-vetor natural. Apesar de ambos os estímulos terem promovido um aumento da carga bacteriana, a alimentação sanguínea teve um efeito maior, também modulando cinco vezes mais genes que a elevação da temperatura. Dentre os genes induzidos, alguns codificam fatores de virulência, tais como componentes do sistema de secreção do tipo IV (T4SS), sugerindo que esse importante sistema de secreção bacteriano seja utilizado para secretar efetores durante a ingestão de sangue pelo carrapato. Através de análises in silico de domínios conservados das proteínas hipotéticas, identificamos outros componentes do T4SS de R. rickettsii ainda não descritos na literatura. A alimentação sanguínea também induziu a expressão de genes codificadores de enzimas antioxidantes, o que pode corresponder a uma tentativa de R. rickettsii de se proteger contra os efeitos deletérios de radicais livres produzidos pelos carrapatos alimentados. Por fim, analisamos a transcrição de uma seleção de genes de R. rickettsii em glândulas salivares e intestinos de carrapatos machos e fêmeas através de RT-qPCR microfluídica. Os resultados mostraram que a elevação da temperatura e a alimentação modulam um conjunto específico de genes em cada tecido analisado, tendo sido possível definirem-se assinaturas transcricionais tecido-específicas. Os genes diferencialmente expressos identificados neste estudo devem ser caracterizados funcionalmente, podendo ser considerados como futuros alvos para o desenvolvimento de vacinas. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of Rocky Mountain Spotted Fever, which is the most lethal spotted fever rickettsiosis that affects humans. The main tick species that transmits R. rickettsii in the metropolitan area of São Paulos city is Amblyomma aureolatum. When an infected and starving tick begins blood feeding from a vertebrate host, R. rickettsii is exposed to a temperature elevation and to components in the blood meal. These two environmental stimuli have been previously associated with the reactivation of rickettsial virulence in ticks, but the factors responsible for this phenotype conversion have not been completely elucidated. The main aim of the present work was to determine the effects of these two environmental stimuli on the R. rickettsii transcriptional profile during A. aureolatum infection. We initially established an effective system for rickettsia propagation to generate a substantial quantity of genetic material for microarray standardization. For that, for the first time, we established an in vitro infection of the virulent Brazilian R. rickettsii strain in the BME26 tick embryonic cell line from Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Using customized oligonucleotide microarrays, we analyzed the effects of a 10°C temperature elevation and a blood meal on the transcriptional profile of R. rickettsii infecting whole organs of Amblyomma aureolatum female ticks. This is the first bacterial transcriptome study of the Rickettsia genus when infecting a natural tick vector. Although both stimuli significantly increased the bacterial load, blood feeding had a greater effect, also modulating five-fold more genes than the temperature upshift. Among the genes induced by blood-feeding, some encode virulence factors, such as Type IV Secretion System (T4SS) components, suggesting that this important bacterial transport system is used to secrete effectors during the acquisition of the blood meal by the tick. Using an in silico conserved domain analysis of hypothetical proteins, we identified additional T4SS components of R. rickettsii that were never previously described. Blood-feeding also up-regulated the expression of antioxidant enzymes, which might correspond to an attempt by R. rickettsii to protect itself against the deleterious effects of free radicals produced by fed ticks. Finally, we studied the transcriptional profile of selected genes of R. rickettsii on the salivary glands and midguts of male and female ticks by microfluidic RT-qPCR. Results showed that temperature upshift and blood feeding modulate specific sets of genes in each tissue, allowing for the establishment of a tissue-specific transcriptional signature. The modulated genes identified in this study require further functional analysis and may have potential as future targets for vaccine development.

Este estudo teve por objetivo analisar e comparar metodologias estatísticas para fins de mapeamento de QTL associados à resistência a ectoparasitas em bovinos. Os animais, submetidos à infestação artificial, foram periodicamente avaliados por contagens, como número de carrapatos. Estes dados se caracterizam como medidas repetidas e, via de regra, não atendem ou atendem parcialmente as exigências usuais da análise, para mapeamento de QTL, dentre elas a de apresentar distribuição normal e independência dos erros. Ainda não está bem definido qual seria a melhor estratégia para analisar dados com o perfil descrito. Algumas alternativas seriam transformações de dados que permitam o uso dos programas já disponíveis, ou o desenvolvimento de programas que utilizem outras distribuições como Poisson ou Poisson inflada de zeros (ZIP). Esta proposta está inserida na parceria entre EMBRAPA - Gado de Leite e a ESALQ/USP, para desenvolvimento do projeto de mapeamento de QTL em bovinos mestiços (Gir x Holandês), para várias características incluindo a resistência a parasitas. Foram utilizados 263 animais F2, genotipados com 5 marcadores moleculares no cromossomo 23, na tentativa de mapear QTL para característica de resistência a carrapatos. Dados coletados naquela população F2 e dados simulados em diferentes cenários, serão a base para a comparação de estratégias de análise e mapeamento de QTL. Os modelos de mapeamento clássico, assim como a utilização de transformações dos dados originais foram comparados a modelos de regressão Poisson e modelo ZIP. Os modelos Poisson e ZIP apresentaram os melhores resultados quando trabalhamos com dados de contagem inflacionados de zeros, porém em outros cenários a transformação dos dados originais se mostrou igualmente eficiente. Dependendo do propósito do mapeamento (seja ele localizar ou estimar o efeito), cada modelo possui suas vantagens e suas limitações. Assim, sempre é recomendável uma prévia análise descritiva dos dados para que o melhor modelo seja utilizado. / This study has as main objective to analyze and compare statistical approaches to QTL mapping for parasites resistance in bovines. The animals, under artificial infestation, were periodically evaluated by counting, as ticks count. These data are characterized as repeated measures and, usually, dont follow or partially follow the usual requirements for the analysis, for QTL mapping, that is to present normal distribution and error independence. It is not clear yet which will be the best strategy to analyze this kind of data. Some alternatives could be data transformation that allows the use of software available on the web, or the development of specific programs that use other types of distribution like Poisson or Zero Inflated Poisson (ZIP).This work is an association between EMBRAPA Gado de Leite and ESALQ/USP, to the development of the QTL mapping project for crossbred bovines (Gyr x Holstein), for different characteristics including the parasite resistance. Were used 263 animals F2, genotyped for 5 molecular markers on the chromosome 23, aiming to map QTL for characteristics of parasite resistance. Data collected on this F2 population and simulated data in different scenarios will be the base for the strategies of the QTL mapping approaches comparison. The classical mapping models and the use of data transformation of the original data were compared to Poisson regression and ZIP models. The Poisson and ZIP models presented the best results when working with zero inflated count data however in some other scenarios the data transformation showed similar efficiency. Depending on the purpose of the mapping (this meaning locate or estimate the QTL effect) each model has its vantages and its limitations. This way, it is always advisable to make a previous descriptive analysis of the data to better choose the model.

Carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus causam enormes prejuízos à saúde e à produção animal. Sendo um ectoparasita hematófago, o carrapato espolia seu hospedeiro e transmite doenças. Seu parasitismo é mediado por sua saliva, que inibe as reações homeostáticas do hospedeiro à injúria local causada por sua picada. Seus hospedeiros montam respostas imunes contra esse parasita, incluindo a resposta imune mediada por anticorpos, indicando que o controle imunobiológico é possível. Contudo, o complexo farmacológico da saliva do parasita é composto por proteínas solúveis que são sabidamente pouco ou nada imunogênicos se não forem introduzidos no hospedeiro com adjuvante ou na foram agregada. Assim, dificilmente induziriam imunidade nos hospedeiros. Bovinos apresentam fenótipos contrastantes e herdáveis quanto à intensidade de infestações com carrapatos. Carrapatos alimentados em bovinos resistentes não completam a refeição de sangue, apresentando menor eficiência reprodutiva. É possível que esse desfecho seja devido à capacidade do hospedeiro resistente, mas não do suscetível, de produzir anticorpos que neutralizam componentes salivares do carrapato cruciais para realize a hematofagia. É necessário, portanto, examinar essa possibilidade. Os resultados obtidos também podem ajudar a identificar antígenos úteis para formular uma vacina anti-carrapato. Para estabelecer quais componentes salivares são reconhecidos pelos dois fenótipos de hospedeiros empregamos uma soroteca composta por soros obtidos de bovinos resistentes e suscetíveis ao carrapato em diferentes estágios do ciclo do parasito (larva, ninfa e adulto) e após uma, duas ou três ciclos de infestações. Os soros foram empregados individualmente e em forma de pools para imunodetecção por western blot de proteínas presentes em extrato de larvas não-alimentadas, saliva e glândulas salivares de fêmeas de R. microplus e separadas em uma e duas dimensões. Os resultados obtidos nos western blots 1D de saliva e de extrato de larvas não alimentadas mostraram que houve um reconhecimento diferencial dos antígenos parasitários pelos soros dos animais resistentes e suscetíveis. Os soros dos animais resistentes quando ainda eram livres de infestações (i.e., naïve) ou quando infestados com a forma larval reconheceram com maior freqüência e/ou exclusivamente certas bandas de proteínas. Resultados semelhantes foram vistos nos western blots de géis 2D de saliva e glândulas salivares de fêmeas, onde os soros dos animais resistentes ainda não infestados (i.e., naïve) reconheceram vários spots presentes nessas amostras e soros de animais resistentes infestados reconhecerem spots de forma exclusiva. Também foi observado que, apesar dos hospedeiros suscetíveis estarem expostos a grande quantidade de saliva, os soros desses animais não reconhecem um número maior de spots que os hospedeiros infestados resistentes. Por outro lado, a maioria das proteínas salivares não é reconhecida pelos hospedeiros infestados, sejam resistentes ou suscetíveis. Esses resultados indicam que os hospedeiros bovinos resistentes reconhecem de forma mais precoce que os bovinos suscetíveis certos componentes parasitários. Essa capacidade pode estar relacionada ao fenótipo de resistência ao carrapato / The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, causes enormous losses to animal health and production. Since it is a hematophagous parasite the tick expoliates its hosts and transmits diseases. Parasitism by the tick is mediated by its saliva, which inhibits the hosts local homeostatic reactions to its bite. Hosts mount immune responses against this parasite, including antibody-mediated responses, indicating that the immunobiological control of ticks is possible. However, the pharmacological complex of saliva is composed of soluble proteins, which are known to be incapable of eliciting antibody responses if they are not introduced into the host with adjuvant or in aggregated form. Thus, salivary proteins may not be able to induce immunity in hosts. Bovines present contrasting, heritable phenotypes for tick infestations. Ticks fed on resistant hosts are unable to complete a blood meal and present a decrease in reproductive immunity. It is possible that this outcome is caused by an ability of the resistant host to produce antibodies that neutralize salivary components that are crucial to blood feeding. It is necessary, therefore, to examine this possibility. The results will also assist in the identification of protective antigens to formulate an anti-tick vaccine. In order to establish which salivary components are recognized by the two types of host phenotypes, a collection of sera derived from resistant and susceptible bovines infested one, two and three times with different developmental stages of the parasite (larvae, nymphs and adults) was employed to detect which proteins were recognized in western blots of saliva and extracts of salivary glands and unfed larvae. Western blots of tick proteins (saliva and extracts of unfed larvae) separated in one dimension showed that antigens were differentially recognized by resistant and susceptible bovines. Sera from resistant bovines still naïve or infested with larvae recognized certain protein bands exclusively or more frequently than similar sera from susceptible bovines. Similar results were seen in western blots of proteins from saliva and extracts of salivary glands separated in two dimensions, where sera from naïve, resistant bovines recognized several spots and sera from infested, resistant bovines recognized several spots exclusively. In spite of the fac that susceptible hosts are exposed to greater amounts of tick saliva, sera from these animals did not recognize a greater amount of spots than those from resistant bovines. On the other hand, the great majority of spots is not recognized by any of the different sera, be they from resistant or susceptible hosts. These results indicate that resistant bovines are able to recognize parasitic proteins earlier than susceptible bovines. This ability may, in turn, affect expression of salivary components that are crucial for the tick and may explain the phenotypes of tick infestations in bovines.

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture