Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los canales de la superfamilia TRP son canales catiónicos no selectivos que permean principalmente Ca2+ y Na+, y comparten una arquitectura molecular general. Las subunidades de un canal TRP ensamblan en homo o heterotrámeros entre miembros de una misma o una diferente subfamilia compartiendo mecanismos de regulación y tráfico, lo que resulta en una gran diversidad de conductancias cationicas, en términos de sus propiedades regulatorias y biofísicas, por lo que han sido descritos como sensores polimodales que responden a una gran variedad de estímulos intracelulares y externos, cumpliendo roles fisiológicos esenciales en las funciones sensoriales, homeostáticas e incluso diversas funciones motiles como la contracción muscular y la migración celular. TRPC3 es un miembro de la subfamilia TRPC que está involucrado en un amplio espectro de mecanismos de señalización de Ca2+, y presenta propiedades de activación y regulación únicas que le permiten el reconocimiento e integración de múltiples estímulos. Este canal se asocia con varias proteínas permitiendo la formación de canales catiónicos diferentes en diversos tipos de células, afectando su actividad y función, por lo que es considerado un sensor multifuncional y versátil de gran relevancia fisiológica y fisiopatológica. Se ha visto que TRPC3 interacciona físicamente con TRPM4 en sistemas de expresión heterólogos, un miembro de la subfamilia TRPM impermeable a calcio, pero activado por este catión, que está involucrado en diferentes procesos fisiológicos, y cuya ganancia de función está relacionada con gran variedad de eventos fisiopatológicos como cáncer, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. En nuestro laboratorio, se encontró que las proteínas End Binding (EBs) interaccionan con un motivo ‘SxIP’ ubicado en la región amino terminal de TRPM4, y que xiii esta interacción TRPM4-EB gobierna el tráfico anterógrado del canal y su actividad. De acuerdo a estos antecedentes, se propone validar la interacción física entre TRPC3 y TRPM4, y evaluar si es que comparten mecanismos de tráfico y exportación a la superficie celular. Para ello, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación y se evaluó el co-trafico de estos canales utilizando diferentes aproximaciones en modelos de expresión heteróloga que coexpresaban ambos canales. Se encontró que efectivamente TRPM4 interacciona con TRPC3, y además que la deleción del ‘motivo SWIP’ de TRPM4 afecta la localización y exportación de TRPC3 a la superficie celular. Debido a la creciente relevancia fisiológica de los eventos de heteroasociación y co-trafico relacionados a los canales TRP, estos datos sugieren que la interacción física entre estos miembros de diferentes sufamilias TRP involucra mecanismos de tráfico asociado a la interacción TRPM4-EBs y podría tener relevancia en tejidos que coexpresen ambos canales, como en tejido cardiovascular o neuronal. / TRP proteins are non-selective cationic channels that permeate mainly Ca2+ and Na+, and share a general molecular architecture. TRP channels subunits assemble as homo or heterotetramers between members of the same or different subfamily, sharing regulation and trafficking mechanisms which results in a great diversity of cationic conductances, in terms of their regulatory and biophysical properties, so they have been described as polymodal sensors that respond to a wide variety of intracellular and external stimuli, fulfilling essential physiological roles in sensory, homeostatic and even diverse motile functions such as muscle contraction and cell migration. TRPC3 is a member of the TRPC subfamily involved in a broad spectrum of Ca2+ signaling mechanisms, and has unique activation and regulation properties that allow recognition and integration of multiple stimuli. These channels are associated with several proteins that allow it to form different cation channels in different types of cells, affecting the activity and function of the channel, so it is considered a multifunctional and versatile sensor of great physiological and physiopathological relevance. TRPC3 physically interacts with TRPM4, a member of the TRPM subfamily impermeable by calcium, but activated by this cation, which is involved in different physiological processes, and whose gain of function is related to a great variety of pathophysiological events, such as cancer, cardiovascular and neurodegenerative diseases. In our laboratory, we found that End Binding proteins (EBs) interact with a 'SxIP' motif located in the amino terminal region of TRPM4, and this TRPM4-EB interaction governs the anterograde trafficking of the channel and its activity. Accordingly, we achieved to validate the physical interaction between TRPC3 and TRPM4, and to evaluate whether these channels share trafficking and exporting mechanisms to the cell surface. To do that, we performed immunoprecipitation assays and the co-trafficking assays in heterologous systems that coexpressed both channels. We found that TRPM4 interacts with TRPC3. Moreover, we observed that the deletion of the 'SWIP motif' of TRPM4 affects the localization and exporting of TRPC3 to the cell surface. Due to the increasing physiological relevance of hetero-association and co-trafficking events related to TRP channels, these data suggest that the physical interaction between these members of different TRP subfamilies involve trafficking mechanisms associated with TRPM4-EBs interaction. These data could have relevance in tissues that coexpress both channels, as in cardiovascular or neuronal tissues. / Este Seminario de Título fue financiado por el proyecto FONDECYT 1160518 y Núcleo Milenio de Enfermedades Asociadas a Canales Iónicos (IR: Oscar Cerda A.),

Magíster en fisiología / Introducción: La muerte de los cardiomiocitos induce la pérdida de función del corazón y el desarrollo de diferentes patologías, sin embargo, se desconoce a cabalidad los mecanismos implicados. La policistina-1 (PC1) es un mecanosensor presente en los cardiomiocitos, clave en la función cardiaca, por lo que su presencia en los cardiomiocitos podría implicar la protección de los mismos ante un estrés celular. La necrosis y la apoptosis son dos principales tipos de muerte celular. Durante la apoptosis diferentes vías de señalización son reguladas, donde BCL-2 es una proteína clave como anti-apoptótica mientras NIX es pro-apoptótica. Las variaciones entre ellas son importantes para determinar las vías implicadas en la apoptosis. Debido a que la PC1 es un mecanosensor, en este proyecto se propuso estudiar el papel de la PC1 en la protección de los cardiomiocitos ante procesos de muerte celular, especialmente el ligado a la apoptosis inducida por estrés hiposmótico. Hipótesis: La ausencia de la policistina-1 induce la muerte del tejido cardiaco en condiciones basales y predispone a la muerte de los cardiomiocitos en cultivo sometidos a estrés mecánico, asociado a una disminución de la relación BCL-2/NIX.Materiales y métodos: Se utilizaron cardiomiocitos de ventrículo de ratas neonatas en cultivo, silenciadas para la PC1 (siPC1), en condiciones basales y sometidas a estrés mecánico con un medio hipo-osmótico (HS) y muestras de tejido cardiaco de ratones jóvenes y seniles, controles y knockout para la PC1 (PC1 KO) en los cardiomiocitos. Resultados: La deficiencia de PC1 en los cardiomiocitos (siPC1) induce la muerte por apoptosis de los mismos mientras aumenta la muerte posterior a un estrés hiposmótico. La relación BCL-2/NIX disminuye en los cardiomiocitos siPC1 sometidos a estrés mecánico, debido principalmente a la disminución del contenido de BCL-2 en condiciones basales. Por otro lado, los animales PC1 KO no muestran diferencias en el contenido de BCL-2 o NIX, pero sí muestran un aumento del contenido de Bax, otra proteína pro-apoptótica. Conclusión: Nuestros datos indican que la PC1 tiene un papel regulador de la apoptosis en los cardiomiocitos, aún en condiciones basales y, al menos en parte, por evitar la disminución del contenido de proteínas pro-apoptóticas como BCL-2 y el aumento de NIX ante un estrés hiposmótico. / Background: Cardiomyocyte death leads to the loss of the heart function and the development of different pathologies; however, the implied mechanisms are poorly understood. Polycystin-1 (PC1) is a mechanosensor present in the cardiomyocytes, key in the heart function, so its presence in cardiomyocytes may involve the protection of them against a cellular stress. Necrosis and apoptosis are the two major classes of cellular death. During apoptosis, different signaling pathways are regulated, where BCL-2 is a key anti-apoptotic protein whereas NIX is pro-apoptotic. The variations between them are relevant to determinate the implied pathways in the apoptosis. Since PC1 is a mechanosensor, this project aims to study the role of PC1 in the protection of the cardiomyocytes against the processes of cellular death, especially the one linked to apoptosis induced by hiposmotic stress. Hypothesis: The absence of Polycystin-1 induces the death of the cardiac tissue in basal conditions and predisposes to the death the cardiomyocytes in culture subjected to mechanical stress, associated with a decrease in the BCL-2/NIX ratio.Materials and methods: Neonatal rat ventricular cardiomyocytes, PC-1 silenced (siPC1), where used, in basal conditions and subjected to mechanical stress with a hypo-osmotic medium (HS), and samples of young and senile rat cardiac tissue, control and knockout for PC1 (PC1 KO) in the cardiomyocyte. Results: PC1 deficiency in cardiomyocytes (siPC1) induces death by apoptosis of them while increasing death following hypo-osmotic stress. The BCL-2/NIX ratio decreases in siPC1 cardiomyocytes subjected to mechanical stress, mainly due to the decrease in BCL-2 content at baseline conditions. Conversely, PC1 KO animals do not show differences in BCL-2 or NIX content, but they do show an increase in the content of Bax, another pro-apoptotic protein. Conclusion: Our data suggest that PC1 has a regulatory role for apoptosis in the cardiomyocytes, even under basal conditions and, at least in part, to avoiding the reduction of the pro-apoptotic protein content as BCL-2, and the increase in NIX content to a hypo-osmotic stress.

Grado de magíster en fisiopatología / Las enfermedades cardiovasculares corresponden a una de las mayores causas de muerte en el mundo, donde el infarto agudo del miocardio es responsable de la mayoría de ellas. Diferentes vías confluyen en el daño y muerte del tejido cardiaco durante el infarto. Sin embargo las principales corresponden al aumento descontrolado tanto de especies reactivas de oxígeno (EROS), como de iones calcio (Ca2+) citoplasmáticos. A pesar de esto se desconoce la totalidad de mecanismos implicados durante este tipo de patología. La policistina-1 (PC1) es una proteína transmembrana, producto del gen PKD1, clave en la función cardiaca en condiciones fisiológicas, lo cual podría estar relacionado al hecho de que regula los niveles proteicos de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje tipo-L en la membrana de los cardiomiocitos. Además, se ha reportado que la PC1 regula las concentraciones de Ca2+ y de ROS citoplasmáticos y que su ausencia aumenta el daño posterior a la isquemia reperfusión renal. A pesar de lo anterior, se desconoce el papel de la PC1 en condiciones de isquemia-reperfusión (IR) cardiaca. En esta tesis se evaluó la hipótesis que la ausencia de la PC1 en los cardiomiocitos aumenta el estrés oxidativo y el daño producido por la IR cardiaca. Utilizamos un modelo ex vivo de IR en corazones de ratones controles (PC1F/F) y knockout para la PC1 en los cardiomiocitos (PC1 KO). Los resultados indican que los corazones de los ratones PC1 KO sometidos a IR, en comparación a los PC1F/F, presentan un mayor tamaño de infarto y cantidad de LDH, dando cuenta de una mayor muerte del miocardio posterior a una IR. Sin embargo, al comparar los parámetros hemodinámicos, no existieron diferencias entre ambos grupos. En cuanto a los EROS, los corazones PC1 KO sometidos a IR, presentaron niveles mayores de proteínas carboniladas y nitradas que los ratones PC1F/F. En su conjunto, nuestros resultados sugieren que la PC1 es una proteína que evita un mayor daño durante la IR cardiaca, lo cual podría estar asociado con su capacidad para evitar un aumento del estrés oxidativo durante la IR. / Cardiovascular diseases are one of the most important causes of death world wide, and acute myocardial infarction is responsible for the most of them. Different mechanisms are involved in the injury and death of the myocardium during an infarct. However, the main mechanisms are the uncontrolled increase of reactive oxygen species (ROS) and citoplasmatic calcium (Ca2+). Nevertheless, many of the mechanisms implicated in this pathology are still unknown. Polycistin-1 (PC1) is a transmembrane protein product of the translation of PKD1 gene, which plays a key role in the cardiac function in physiological conditions; this could be related to the fact that PC1 regulates the voltage-dependent Ca2+ channels in the membrane of the cardiomyocites. It has been reported that PC1 regulates the concentrations of Ca2+ and ROS in the cytoplasm, and that the absence of PC1 increases the damage after renal ischemia-reperfusion. In spite of this, the role of PC1 under myocardial ischemia reperfusion (IR) is uncleared. The hypothesis that the absence of PC1 in the cardiomyocites increases the oxidative stress and the damage produced by myocardial IR was evaluated in this thesis. An ex vivo model of myocardial IR, in control mouse hearts (PC1F/F) and knockout for PC1 mouse hearts (PC1 KO) was used for this purpose. The results show that the PC1 KO hearts submitted to IR presented bigger infarct size and higher amount of LDH in comparison with PC1F/F, indicating more death of the myocardium after IR, although they did not show differences in hemodynamic parameters. In relation to the levels of ROS after IR, PC1 KO hearts showed higher levels of protein carbonilation and nitrotyrosination in comparison with PCF/F. The results of this investigation suggest that PC1 is a protein that prevents the damage during myocardial IR, and this could be associated to its role in preventing the increase of ROS during IR.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.