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Caractérisation des complexes cycline-Cdc28 impliqués dans la résection des télomères déprotégés chez Saccharomyces cerevisiaeKorei, Maesumeh January 2015 (has links)
Dans les cellules eucaryotes, les extrémités des chromosomes linéaires sont protégées par une structure nucléoprotéique, appelée télomère. Un télomère non fonctionnel peut induire des réarrangements de chromosomes et d’instabilité génomique, et ainsi, contribuer au vieillissement ou au développement de cancers. L’instabilité génomique est initiée par une réparation nuisible des extrémités chromosomiques, dont certains aspects sont régulés par la principale kinase du cycle cellulaire, Cdc28 (ou Cdk1 pour Cyclin dependant kinase 1), chez Saccharomyces cerevisiae. Par exemple, la déstabilisation des télomères induite par l’inactivation de la protéine Cdc13, une des protéines de la coiffe protectrice du télomère, conduit à la résection extensive et non contrôlée des extrémités des chromosomes, promue par la kinase Cdc28.
La kinase Cdc28 n’est pas en mesure d’accomplir ses fonctions par elle-même; elle est activée à l’aide d’une de ses neuf différentes sous-unités auxiliaires, appelées cyclines. Les cyclines sont non seulement responsables pour activer, mais aussi pour guider la kinase vers de substrats spécifiques lors l’exécution de ses nombreuses tâches. Alors, l’objectif des travaux de maîtrise fut de définir la contribution des sous-unités individuelles de cyclines, dans la dégradation des télomères non fonctionnels. Suite à la déprotection contrôlée des télomères par l’inactivation de la protéine Cdc13, l’effet des délétions de trois groupes de cyclines, cyclines précoces de la phase S, de la phase S ou de la phase M sur la croissance et sur la structure des télomères ont été déterminés.
En fonction des résultats obtenus, aucune simple délétion de cyclines de la phase S ne semble avoir un effet sur la dégradation des télomères. En général, les résultats pour les doubles délétions sont cohérents avec les observations faites avec les simples délétions, sauf que certaines doubles délétions de cyclines de la phase S combinée avec l’allèle cdc13-1 ont montrées une croissance détériorée et une accumulation plus élevée d’ADN sb aux télomères que les contrôles pertinents. Pourtant, aucune de ces doubles délétions ne supprime le phénotype de thermosensibilité d’allèle cdc13-1. Cependant, la viabilité des cellules cdc13-1 contenant de triples délétions de S cyclines est gravement compromise par rapport au contrôle, les cellules cdc13-1, à une température semi-permissive, malgré que les niveaux de l’AND sb aux télomères et l’activation de la DDR sont comparables à ceux du contrôle. Il est proposé que ceci pourrait refléter un effet combiné des délétions de cyclines et de Cdc13 sur la réplication ou, encore, une limitation de la technique utilisée pour la détection de l’ADN sb. À l’aide de l’expression contrôlée de Clb5, l’effet d’élimination de toutes les cyclines de la phase S a pu être étudié. Les résultats démontrent que la résection aux télomères et l’activation de la DDR suite à la déprotection ne sont pas réprimées en absence de toutes les cyclines de la phase S. Ces résultats suggèrent que les cyclines mitotiques sont probablement responsables pour l’accumulation d’ADN simple brin observée aux télomères déprotégés, mais l’expérimentation pour confirmer ou écarter cette possibilité n’était pas réalisée durant le terme de cette maîtrise.
Un deuxième objectif de mes travaux de maîtrise fut la mise au point dans notre laboratoire d’une technique basée sur la PCR quantitative qui permet de quantifier l’ADN simple brin et de suivre la dynamique de la résection aux télomères non fonctionnels, appelée QAOS (d’anglais Quantitative Amplification of Single-stranded DNA). La technique QAOS qui a été mise au point lors de ma maîtrise nous a permis de confirmer les résultats obtenus par la technique de l’hybridation non dénaturante.
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