No description available.

No description available.

Les virus influenza aviaires faiblement pathogènes (IAFP) ciblent principalement les épithéliums des voies respiratoires et intestinales chez les poulets (Gallus gallus) infectés. Cependant, les virus influenza aviaires hautement pathogènes (IAHP) mènent à une maladie systémique fatale avec une localisation particulière aux endothéliums. L’objectif de cette thèse a été d’explorer les relations entre la réplication des virus influenza aviaires (IA) et la réponse antivirale de l’hôte dans deux modèles cellulaires originaux obtenus chez le poulet : des cellules épithéliales pulmonaires (CLEC213) et des cellules endothéliales d’aortes (chAEC). Les résultats clés sont les suivants : (i) la réplication productive des virus IA dans les chAEC dépend du clivage de l’hémagglutinine et de l’échappement viral à la réponse immunitaire innée ; (ii) les CLEC213 sont très permissives aux virus IA et présentent une faible réponse antivirale médiée par la signalisation TLR3 et MDA5 ; (iii) les fonctions régulatrices de SOCS1 et SOCS3, sur le signal des interférons et des cytokines, sont conservées chez le poulet. Nous proposons que certains virus IA peuvent exploiter les fonctions pro-virales de SOCS1 et SOCS3 à leur avantage de manière spécifique au type cellulaire. / Low pathogenic avian influenza (LPAI) viruses essentially target the epithelia of the respiratory and intestinal tract in the infected chicken host (Gallus gallus). However, highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses induce a peracute fatal systemic disease and exhibit a striking endothelial cell tropism. The objective of the present thesis was to explore the interdependencies of AI virus replication and the antiviral host response in two novel avian cell culture models: chicken lung epithelial cells (CLEC213) and chicken aortic endothelial cells (chAEC). The salient findings from this study are that (i) productive AI virus replication in chAEC is dependent on hemagglutinin cleavability and appears to be related to innate immune escape; (ii) CLEC213 are highly permissive to AI virus infection, due to a cell type-specific diminished TLR3- and/or MDA5-mediated antiviral signaling response; (iii) the interferon and cytokine regulatory functions of SOCS1 and SOCS3 are conserved in the chicken. Based on our data, we propose a model that predicts that certain AI viruses may exploit the proviral functions of SOCS1 and SOCS3 in a cell type-specific manner.

Cardiovascular diseases are considered the first cause of death in westernized societies. They are directly linked to atherosclerosis, a clinical condition characterized by a thickening of the arterial wall. Atherosclerosis is in his turn linked to various genetic and environmental factors; among those factors are high oxidized LDL levels and endothelial dysfunction. In the present study, we have analyzed in vitro the effect of myeloperoxidase oxidized LDL on endothelial cells at the level of fibrinolysis and cell motility.<p>In the first part of the work, we measured fibrinolysis in real time at the surface of endothelial cells. Our results suggest that myeloperoxidase oxidized LDL interferes with the regulation of fibrinolysis by endothelial cells by decreasing their pro-fibrinolytic activity. This effect was not related to a modification in expression of major regulators of fibrinolysis such as PAI-1 and t-PA. Our data link the current favorite hypothesis that oxidized LDL has a causal role in atheroma plaque formation with an old suggestion that fibrin may also play a causal role. A model that best explains our results would be as follows: oxidized LDL increases fibrin deposition on endothelial cells which will increase their permeability resulting in more oxidized LDL infiltration into the subendothelial space of the arterial wall initiating atherogenesis. <p>In the second part of the work, we investigated the effect of myeloperoxidase oxidized LDL at the level of endothelial cell motility. We have shown that oxidized LDL is able to decrease cell migration, wound healing and tubulogenesis in endothelial cells. Those effects were not associated with any alteration at the level of neither cell viability nor proliferation. Subsequent gene expression analyses enabled us to link the oxidized LDL induced phenotypical changes in the cells to a change in expression of both microRNA-22 and Heme Oxygenase 1 genes. Our observations suggest a novel role of oxidized LDL not only as an important factor in the initiation of atheromatous lesions, but also as a potential player in the progression of the atherosclerosis disease by impeding blood vessel repair and wound healing at the sites of lesions.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La leptospirose est une zoonose causée par les bactéries du genre Leptospira. Elle touche près de 1 million d'individus par an dans le monde entier et sévit à l'état endémique dans les pays au climat tropical tel que La Réunion. Les manifestations habituelles sont variables d'un individu à l'autre et englobent une simple fièvre jusqu'aux défaillances poly-viscérales avec mortalité dans 5 à 10% des cas. Sa physiopathologie est encore mal comprise, en particulier la part que joue une réponse immunitaire inappropriée dans la genèse des manifestations graves qui surviennent en quelques heures, et avant la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative propre à éliminer le microorganisme. Si l'échappement de la bactérie au système du complément est bien documenté, le rôle des acteurs cellulaires du système immunitaire inné reste à étayer. Notre étude avait donc pour objectif d'explorer l'immunopathologie de la leptospirose humaine dans la phase initiale de l’infection. Notre méthodologie s'est appuyée principalement sur des analyses quantitatives et qualitatives des acteurs cellulaires du système immunitaire inné à partir de prélèvements sanguins en phase précoce de la maladie, et comparaison avec la phase de convalescence et des sujets contrôles. Dans un premier temps nous avons montré qu'une population particulière de lymphocytes T impliquée dans la réponse immune innée, les lymphocytes Tγδ, avaient un taux abaissé et que cette baisse était corrélée à la charge bactérienne ainsi qu'à l’intensité de l'atteinte hépatique classiquement retrouvée lors de la leptospirose. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les polynucléaires neutrophiles circulants dont le taux augmente d’autant plus que la maladie est sévère, mais sans pour autant présenter de modification de certains marqueurs d’activation ou de recrutement tissulaire (CD15, CD11b, CD182). Une des principales chimiokines des neutrophiles, l'interleukine 8, était à taux peu élevés. Les derniers travaux concernent les principales formes solubles issues des molécules membranaires impliquées dans le processus de recrutement/diapédèse leucocytaire. Nous retrouvons de manière isolée une forte élévation des formes solubles d'E-sélectine et ICAM-1 qui sont notamment exprimées par les cellules endothéliales. Ces augmentations n'étaient pas corrélées aux marqueurs de gravité de la maladie. La signification biologique de cette élévation n’est pas encore connue lors de la leptospirose. L'ensemble de nos données permet d’apporter des informations nouvelles sur des acteurs du système immunitaire inné présents dans le compartiment vasculaire lors de la leptospirose humaine. Cette réponse immunitaire semble inadaptée pour permettre une clairance du pathogène au stade de dissémination hématogène. / Leptospirosis is a bacterial zoonosis caused by Leptospira and affecting 1 million people each year worldwide and mainly in tropical areas such as Reunion Island. Usual presentations encompass flu-like syndrome to multiorgan failure with mortality rate between 5 to 10%. To date, pathophysiology in humans is poorly understood, notably the capacity of innateimmunity to mount a robust response to clear pathogen or to induce tissue damages and contributing to disease severity. Our study aimed at assessing the role of innate immune cells and molecules within the first days of leptospiral infection.Using blood samples, we performed quantitative and qualitative assessment of circulating innate immune cells from leptospirosis cases and healthy controls. The first study explored the levels of gamma-delta T-cells (γδT-cells), a subset of unconventional T cells with innate immune functions. Gamma-delta T cells were found deeply decreased and levels wereinversely correlated to bacterial burden and liver damage. The second study focused on membrane bound receptors indicative of activation and tissue migration ability of neutrophil polymorphonuclear cells: CD15, CD11b, and CD182. Although neutrophil rates were high in leptospirosis cases, the levels of studied receptors were either lower (CD15) or identical to healthy controls (CD11b, CD182). In addition, only low levels of interleukin-8, a key chemokine for neutrophils, was detected in patients. Lastly, we ascertained the plasmatic levels of several shed cell adhesion molecules notably expressed by endothelial cells. The levels of soluble E-selectin and ICAM-1 were significantly increased compared to controls, while P-selectin level was lower. We did not find any correlation with disease severity or organ failure. This finding indicates that endothelial cell may be activated but further experiments are warranted to explain the functional impact of our findings. Altogether, our results add to the field of knowledge of leptospirosis pathophysiology, and in particular the implication of key innate immune cells at the stage of plasmatic bacterial dissemination. Our findings will support the view that there is an inappropriate immune response to Leptospira.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est la structure formant les capillaires du système nerveux central (SNC). La BHE est responsable de maintenir l’homéostasie du cerveau en régulant précisé- ment les échanges entre le sang et le tissu cérébral. Elle est composée de trois types cellulaires : les cellules endothéliales (ECs), les péricytes (PCs) et les astrocytes (ACs). Du fait de ses propriétés très sélectives, la BHE est une des causes majeures des échecs observés dans le développement des médicaments destinés au SNC. En effet, ces médicaments en développement sont souvent in- capables de franchir la BHE pour atteindre leurs cibles thérapeutiques. C’est pour cette raison que la mise au point et l’utilisation de modèles de BHE sont cruciaux pour étudier la capacité de nou- veaux agents thérapeutiques à traverser la BHE mais également les mécanismes sous-jacents à leurs passages. Utilisé très tôt dans le développement pharmaceutique, un modèle de BHE infor- matif permettrait de réduire les échecs dans des phases de R&D plus avancées. Nous reportons dans cette thèse le développement et la validation d’un modèle de BHE réalisé sur un Transwell®, composé d’ECs extraites chez la souris. Les travaux ont été réalisés avec la perspective de fournir le plus d’informations possibles quant à la réalisation, l’utilisation et l’interprétation du modèle de BHE dans l’étude de la perméabilité de petites molécules en conditions saines et pathologiques. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole permettant l’isolation chez la souris des trois types cellulaires composant la BHE, soit les ECs chez la souris adulte, et les PCs et les ACs chez les nouveau-nés. Les méthodes décrites sont efficaces pour obtenir rapidement un grand nombre de cellules pures à moindre coût. De plus, les essais préliminaires démontrent que les cellules endo- théliales isolées sont pertinentes pour la création d’un modèle de la BHE. Dans un deuxième temps, nous avons entrepris de valider un modèle sain de BHE. Pour ce faire, nous avons comparé les résultats de la perméabilité in vivo de 7 molécules à trois modèles de BHE composés respectivement d’ECs primaires, d’ECs immortalisées ou de lipides extraits du cerveau porcin. Le modèle de BHE composé des ECs primaires corrèle le mieux avec les résultats obtenus in vivo chez la souris. Dans un troisième temps, nous avons exploré la possibilité d’utiliser ce modèle de BHE validé comme modèle dans l’étude de la perméabilité lors d’une inflammation aiguë. Les résultats obtenus nous permettent de décrire les possibles voies empruntées par les molécules dont la perméabilité est augmentée lors de l’inflammation. Néanmoins, cette étude met aussi en lumière l’absence de généralisation possible quant à l’impact de l’inflammation aiguë sur le passage des petites molé- cules à travers la BHE. À l’issue de cette thèse, un modèle de BHE composé d’ECs primaire a été développé et validé. Ce modèle permettra l’étude systématique des nombreux paramètres impliqués dans le passage des molécules à travers la BHE très tôt dans le développement du médicament. / The blood-brain barrier (BBB) is the structure that forms the capillaries of the central nervous system (CNS). BBB major role is to maintain brain homoeostasis by precisely regulating exchange between blood and brain tissues. Three cellular types constitute the BBB, namely: endothelial cells (ECs), perycites (PCs) and astrocytes (ACs). Due to the BBB selectivity, this barrier is the major cause of failing in the drug development of molecules targeting the CNS. Indeed, drugs developed for CNS pathologies are often unable to cross the BBB to reach their therapeutic targets. The use of a relevant BBB model is therefore critical to study drug permeability when developing new drugs. Used earlier in drug development, this kind of BBB model could allow reducing failure rates in more advanced R&D phases. In this thesis, we report the development and validation of a BBB model made from ECs extracted from mouse and seeded in a Transwell®. This work aimed at providing as much information as possible regarding the production, use and interpretation of the BBB model in the study of small molecule permeability under healthy and pathological conditions. First, we established a protocol allowing the isolation of the three cell types from mice : endothelial cells from adult mice, and pericytes and astrocytes from newborns. The methods described herein are effective to quickly obtain a large number of pure cells at a low cost. Furthermore, preliminary tests show that isolated endothelial cells are relevant for the creation of a BBB model. Next, we focused on validating a healthy BBB model. We have compared the results of the in vivo permeability of 7 molecules with three models of BBB composed respectively of primary ECs, immortalized ECs or extracted porcine brain lipids. The BBB model composed of primary ECs best correlates with the results obtained in vivo in mice. Finally, we studied the possibility of using our BBB model as a model of permeability under acute inflammation. Our results allowed describing the possible routes used by the molecules whose permeability was increased during inflammation. The inflamed BBB model is relevant for studying the permeability of small molecules; however, this work also shows that one cannot generalize the impact of inflammation on the passage of small molecules through the BBB. Overall, we have developed and validated a BBB model composed of primary endothelial cells. This model allows studying drug permeability and provides a better understanding of the mechanisms involved in the permeability. This model could be used to study many parameters involved in the passage of molecules through the BBB at very early stages of drug development.

No description available.

L’hyperglycémie associée au diabète de type 2 induit des complications vasculaires menant à des désordres cérébrovasculaires, comme l’accident vasculaire cérébral. En effet, l’hyperglycémie altère l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, et les cellules endothéliales cérébrales qui la composent sont particulièrement affectées. Le stress oxydant et l’état pro-inflammatoire engendrés par l’hyperglycémie jouent un rôle causal. Dans ce contexte, un intérêt croissant est accordé aux polyphénols d’origine végétale qui pourraient exercer une action antioxydante et anti-inflammatoire protectrice. L’objectif du travail de thèse était d’évaluer l’impact de l’hyperglycémie sur des marqueurs redox, inflammatoires et vasoactifs des cellules endothéliales cérébrales. L’action protectrice de l’insuline en tant qu’hormone hypoglycémiante clé a été explorée. De plus, nous avons étudié le rôle protecteur de polyphénols antioxydants extraits de la plante médicinale Antirhea borbonica de La Réunion. Pour ce faire, un modèle de cellules endothéliales cérébrales murines ainsi qu’un modèle animal d’ischémie cérébrale en condition d’hyperglycémie ont été utilisés. Nos résultats ont montré que l’hyperglycémie a induit un stress oxydant et une réponse pro-inflammatoire contribuant à une altération de la fonction endothéliale. Plusieurs cibles moléculaires ont été identifiées dont les protéines redox Nox4, Cu/ZnSOD, MnSOD, catalase et HO-1 ainsi que les facteurs vasoactifs ET-1, eNOS et NO. L’implication des médiateurs de signalisation Nrf2, AMPK, PI3K, JNK, ERK, p38 MAPK, NFκB et de la cytokine pro-inflammatoire IL-6 a été mise en évidence. L’insuline et les polyphénols ont exercé des effets antioxydants et anti- inflammatoires protégeant la fonction endothéliale. En situation d’ischémie cérébrale, l’hyperglycémie a exacerbé la dérégulation de l’état redox et pro-inflammatoire cérébral, associée à une altération de la barrière hémato-encéphalique. De plus, l’hyperglycémie a aggravé le déficit neurologique, le volume de l’infarctus cérébral et la transformation hémorragique. Les polyphénols ont exercé un rôle protecteur. L’acide caféique et son métabolite circulant, l’acide férulique, détectés au niveau cérébral, pourraient rendre compte de cette action protectrice. Des travaux complémentaires ont montré que les polyphénols protègent également contre l’altération de la fonction de cellules endothéliales aortiques humaines et la perte de vasorelaxation d’anneaux aortiques isolés de souris exposés à une hyperglycémie associée aux lipopolysaccharides de la bactérie Escherichia coli, qui sont des endotoxines liées de manière causale au contexte diabétique. En conclusion, ce travail de thèse a mis en évidence l’effet délétère de l’hyperglycémie sur la fonction endothéliale et le rôle protecteur de polyphénols antioxydants. L’utilisation des modèles expérimentaux développés permettra d’approfondir l’exploration des voies moléculaires impliquées et d’identifier de possibles cibles thérapeutiques innovantes. / Type 2 diabetes promotes vascular complications, leading to cerebrovascular disorders such as stroke. Indeed, hyperglycemia alters the blood-brain barrier integrity by deregulating the cerebral endothelial cell function. Oxidative stress and pro-inflammatory response may play a causal role. Thus, the biological effect of plant polyphenols known to exert antioxidant and anti-inflammatory capacities is of high interest. We evaluated the impact of hyperglycemia on the production of redox, inflammatory and vasoactive markers of cerebral endothelial cells, and the protective effect of polyphenols from the medicinal plant Antirhea borbonica from Reunion island. The murine bEnd.3 cerebral endothelial cells and an ischemia-reperfusion mouse model exposed to hyperglycemia were used. Our results demonstrated that hyperglycemia induced an oxidative stress and a pro-inflammatory state, leading to cerebral endothelial dysfunction through the activation of specific signaling molecules. Importantly, polyphenols extracted from Antirhea borbonica counteracted hyperglycemia deleterious effects and protected cerebral endothelial cells. Moreover, hyperglycemia exacerbated oxidative stress and pro-inflammatory state promoting cerebrovascular damages and loss of endothelial barrier integrity in ischemia-reperfusion mice model. Polyphenols exerted antioxidant and anti-inflammatory activities, attenuating cerebrovascular damages. These findings suggest that polyphenols extracted from Antirhea borbonica exerted protective effects on cerebral endothelial cells and an ischemia-reperfusion mouse model against deleterious effects of hyperglycemia.

No description available.

Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.