Plants do not display an adaptive immune system but express an efficient innate immune system defending them by inducing sophisticated multilevel defense responses against different potential pathogens. Indeed, plant immune responses are triggered upon the detection of many common pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs) through specific pattern-recognition receptors (PRRs) and/or pathogen- or plant-derived signal molecules called elicitors. Cryptogein (Cry) and oligogalacturonides (OGs) are well known elicitors of defense reactions and their recognition induce a Ca2+-dependent signaling pathway: Ca2+ influx and subsequent free cytosolic [Ca2+] ([Ca2+]cyt) variations are earliest steps to trigger downstream plant defense signaling. Here we have demonstrated that elicitor-induced Ca2+ signaling in tobacco also takes place in mitochondria and chloroplasts. Pharmacological studies indicated that IP3-channels play an important role in the regulation of Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts. Mitochondrial respiration and energy dissipation mechanisms in chloroplasts are partly controlled by [Ca2+] in these organelles. Moreover, using pharmacological and genetic approaches, our data demonstrated that glutamate receptors homologs (GLRs) participate in OGs-mediated Ca2+ signaling in Arabidopsis. GLRs partly control OGs-induced nitric oxide (NO) production, reactive oxygen species (ROS) production and expression of defense-related genes. Importantly, plants treated with GLRs antagonists exhibited compromised resistance to necrotrophic fungal pathogen, Botrytis cinerea and biotrophic oomycete, Hyaloperonospora arabidopsidis. Analysis of Atglr single mutants revealed the important contribution of AtGLR3.3 in resistance against H. arabidopsidis. Moreover, striking similarities in gene expression levels were observed after OGs elicitation/H. arabidopsidis infection. Finally, transcriptomic analysis demonstrated that about 60 % of the total OGs-modulated genes modified their expression in GLRs-dependent manner. These GLRs-dependent genes belong to different functional categories including the category "responses to biotic stresses". Taken together, these data provide strong evidences of 1) elicitor-induced Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts in tobacco and 2) the regulation of elicitor/pathogen mediated plant defense signaling pathways through GLRs in Arabidopsis thaliana

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Les plantes présentent une forme d’immunité innée face à des agents potentiellement pathogènes qui se traduit par l’induction de réponses de défense. Les réponses immunes des plantes sont induites après détection de motifs moléculaires associés à des pathogènes ou à des micro-organismes par des récepteurs reconnaissant spécifiquement ces motifs et/ou des molécules dérivées des agents pathogènes ou de la plante, appelés éliciteurs de réaction de défense. La cryptogéine (Cry) et les oligogalacturonates (OGs) sont des éliciteurs établis de réactions de défense et leur reconnaissance induit une signalisation Ca2+-dépendante : un influx calcique et une variation de la concentration cytosolique en Ca2+ libre ([Ca]cyt) sont des événements précoces induisant une voie de signalisation de défense. Nous avons démontré que chez le tabac, les éliciteurs induisent une signalisation calcique dans les mitochondries et les chloroplastes. Des études pharmacologiques indiquent que des canaux IP3-dépendants régulent la signalisation calcique induite par la Cry dans les mitochondries et les chloroplastes. La respiration mitochondriale et les mécanismes de dissipation de l’énergie dans les chloroplastes sont régulés en partie par la [Ca2+] dans ces organites. De plus, nous montrons par des approches pharmacologiques et génétiques, que des homologues aux récepteurs du glutamate (GLRs) participent à la signalisation calcique induite par les OGs dans Arabidopsis. Les GLRs contrôlent en partie la production d’oxyde nitrique (NO) et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi que l’expression de gènes de défense. Par ailleurs, les plantes traitées par des antagonistes des GLRs, présentent une moindre résistance au pathogène fongique nécrotrophique, Botrytis cinerea et à l’oomycète biotrophique, Hyaloperonospora arabidopsidis. L’analyse de mutants Atglr révèle l’importante contribution de AtGLR3.3 dans la résistance envers H. arabidopsidis. De plus, de frappantes similarités dans l’expression de gènes sont observées après traitement par les OGs ou après infection par H. arabidopsidis. Enfin, une analyse transcriptomique montre qu’environ 60 % des gènes modulés par les OGs ont une expression qui dépend de GLRs. Ces gènes dépendants de GLRs appartiennent à diverses familles fonctionnelles dont celle répondant aux stress biotiques. En conclusion, ces études montrent 1) que les mitochondries et les chloroplastes présentent aussi une signalisation calcique induite par des éliciteurs de réaction de défense chez le tabac et 2) l’implication de GLRs dans la signalisation calcique induite par des éliciteurs ou des agents pathogènes et la résistance envers des agents pathogènes chez Arabidopsis / Plants do not display an adaptive immune system but express an efficient innate immune system defending them by inducing sophisticated multilevel defense responses against different potential pathogens. Indeed, plant immune responses are triggered upon the detection of many common pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs) through specific pattern-recognition receptors (PRRs) and/or pathogen- or plant-derived signal molecules called elicitors. Cryptogein (Cry) and oligogalacturonides (OGs) are well known elicitors of defense reactions and their recognition induce a Ca2+-dependent signaling pathway: Ca2+ influx and subsequent free cytosolic [Ca2+] ([Ca2+]cyt) variations are earliest steps to trigger downstream plant defense signaling. Here we have demonstrated that elicitor-induced Ca2+ signaling in tobacco also takes place in mitochondria and chloroplasts. Pharmacological studies indicated that IP3-channels play an important role in the regulation of Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts. Mitochondrial respiration and energy dissipation mechanisms in chloroplasts are partly controlled by [Ca2+] in these organelles. Moreover, using pharmacological and genetic approaches, our data demonstrated that glutamate receptors homologs (GLRs) participate in OGs-mediated Ca2+ signaling in Arabidopsis. GLRs partly control OGs-induced nitric oxide (NO) production, reactive oxygen species (ROS) production and expression of defense-related genes. Importantly, plants treated with GLRs antagonists exhibited compromised resistance to necrotrophic fungal pathogen, Botrytis cinerea and biotrophic oomycete, Hyaloperonospora arabidopsidis. Analysis of Atglr single mutants revealed the important contribution of AtGLR3.3 in resistance against H. arabidopsidis. Moreover, striking similarities in gene expression levels were observed after OGs elicitation/H. arabidopsidis infection. Finally, transcriptomic analysis demonstrated that about 60 % of the total OGs-modulated genes modified their expression in GLRs-dependent manner. These GLRs-dependent genes belong to different functional categories including the category “responses to biotic stresses”. Taken together, these data provide strong evidences of 1) elicitor-induced Ca2+ signaling in mitochondria and chloroplasts in tobacco and 2) the regulation of elicitor/pathogen mediated plant defense signaling pathways through GLRs in Arabidopsis thaliana

Conifers are important both ecologically and socioeconomically, however, same parts of their biology are not that well researched. This includes genetics and breeding and partly even physiology. Because quantitative genetic analyzes applied in breeding necessitate an analysis of a large number of samples, and conventional methods of analysis are quite time-consuming, certain parameters describing e.g. the activity of photosynthetic electron-transport chain (ETC) are considered for such use. Several methods of the measurement of the activity of photosynthetic ETC exist, but there are some problems with their usage in conifers. I studied this issue from different points of view in three parts of this thesis. 1) I compared the photosynthetic ETC activity in 8 species of conifers using chlorophyll (Chl) fluorescence measurements on intact needles and polarographic measurements in isolated chloroplasts. Each method brought different information. 2) I measured Chl fluorescence parameters, reflectance spectra and pigment content in 536 genetically defined trees of Pinus sylvestris L. Many parameters showed relatively high genetic variability and heritability. I have also determined the suitability of various reflectance indices to estimate pigment and water content of needles. 3) I have optimized the...

[ES] Los virus de plantas son los agentes causales de un gran número de enfermedades en plantas que ocasionan grandes pérdidas económicas. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV), es un pequeño virus de RNA monocatenario de polaridad positiva, perteneciente al género Gammacarmovirus, cuyo genoma codifica cinco proteínas. La proteína de cubierta (CP), está formada por tres dominios distintos. El descubrimiento de un péptido de transito dual en la región amino-terminal de la CP fue el punto de partida de esta tesis. Al inicio de una infección por MNSV, la CP nuevamente sintetizada es transportada al interior de cloroplastos y mitocondrias mientras que, una parte mucho menor se mantiene en el citoplasma aumentando a medida que avanza la infección. La inhibición de este transporte dual conlleva un aumento de la actividad supresora del silenciamiento del RNA de la CP. Sin embargo, la infección sistémica se ve particularmente afectada. Por tanto, la acumulación de la CP en el citoplasma puede provocar un aumento de la replicación viral pero a su vez una sobreexpresión de la p29, puede provocar una explosión oxidativa y una necrosis que restringe el movimiento viral. De este modo, el transporte de la CP a los orgánulos podría evitar una replicación viral excesiva mediante la modulación de la actividad supresora para gestionar el equilibrio entre la defensa de la planta y la contradefensa viral favoreciendo una interacción compatible entre ambos. Desafortunadamente, Arabidopsis thaliana no es huésped para el MNSV. Por tanto, para entender mejor el transporte de la CP a estos orgánulos, se identificaron los receptores y los poros de los translocones de las membranas externas de las mitocondrias y los cloroplastos en Nicotiana benthamiana. Esta caracterización funcional se realizó principalmente mediante VIGS y RT-qPCR, que mostró una redundancia funcional mayor que la observada entre los homólogos de Arabidopsis. Además, esta herramienta también se utilizó para evaluar la relevancia de cada componente bajo la infección por MNSV, y junto con los estudios de interacción CP-receptor realizados mediante BiFC y Y2H, nos permitió identificar NbToc159A para cloroplastos y NbOm64 para mitocondrias, como principales receptores. A su vez, el silenciamiento de NbToc34, NbToc75 o NbTom40 resultó en una resistencia generalizada no solo a MNSV sino también al virus del arrugamiento del nabo (TCV) y al virus del moteado del clavel (CarMV), lo que respalda la idea actualmente aceptada y que involucra el estado fisiológico del cloroplasto y la mitocondria en la señalización temprana de la respuesta defensiva. Finalmente, se realizó una búsqueda de factores del huésped que interaccionasen con la CP mediante con TurboID, una ligasa de biotina, que permite la detección de interacciones tanto directas e indirectas como transitorias y estables. Así, se obtuvo un gran número de proteínas candidatas utilizando la CP de MNSV y su mutante de localización citoplásmica, ∆NtCP. Tres de ellas, NbSIK1, NbSMU2 y NbMAP3K mostraron un efecto perjudicial constante y repetitivo sobre la acumulación del RNA viral. Después de la validación de las interacciones mediante otro método, y el análisis de la localización subcelular de la CP bajo el silenciamiento del interactor correspondiente, se establecieron dos hipótesis principales. En primer lugar, dado que la función principal de NbSMU2 está relacionada con el procesamiento y regulación del RNA mensajero, esta proteína podría ser secuestrada por la CP provocando la expresión de genes provirales. Por otro lado, NbSIK1 y NbMAP3K, actúan como reguladores positivo y negativo de la respuesta PTI a la infección, respectivamente. Además, ambas proteínas interaccionan entre sí y forman parte de la cascada de MAP quinasas, por lo que en nuestra segunda hipótesis, la CP interaccionaría con este complejo, promoviendo una regulación negativa de la PTI que facilitaría el desarrollo de la infección. / [CA] Els virus de plantes són els principals causants de la major part de malalties en plantes i les consegüents pèrdues econòmiques. El virus de les taques necròtiques del meló (MNSV) és un virus menut d'RNA monocatenari de polaritat positiva, pertanyent al gènere Gammacarmovirus, el genoma del qual codifica cinc proteïnes. La proteïna de coberta (CP) està formada per tres dominis diferents. El descobriment d'un pèptid de trànsit dual a la part aminoterminal de la CP va ser el punt de partida d'aquesta tesi. A l'inici d'una infecció per MNSV, la CP novament sintetitzada és transportada a l'interior dels cloroplasts i mitocondris mentre que, una part molt menor es manté al citoplasma augmentant a mesura que avança la infecció. La inhibició d'aquest transport dual comporta un augment de l'activitat supressora del silenciament de l'RNA de la CP. No obstant això, la infecció sistèmica es va frenar. Per tant, l'acumulació de la CP al citoplasma pot provocar un augment de la replicació viral però alhora una sobreexpressió de la p29, una replicasa auxiliar que ocasiona alteracions morfològiques als mitocondris, una explosió oxidativa i necrosi que restringeix el moviment viral. D'aquesta manera, el transport de la CP als orgànuls podria evitar una replicació viral excessiva mitjançant la modulació de l'activitat supressora per gestionar l'equilibri entre defensa de la planta i contradefensa viral que condueixen a una interacció compatible entre tots dos. Per entendre millor el mecanisme molecular que regeix el transport de la CP a aquests orgànuls, es van identificar els receptors i els porus dels translocon de les membranes externes dels mitocondris i els cloroplasts a Nicotiana benthamiana. Aquesta caracterització funcional es va realitzar principalment mitjançant VIGS i RT-qPCR, que va mostrar una redundància funcional més gran que l'observada entre els homòlegs d'Arabidopsis. A més, aquesta eina també es va utilitzar per avaluar la rellevància de cada component sota la infecció per MNSV, i juntament amb els estudis d'interacció CP-receptor realitzats mitjançant BiFC i Y2H, ens va permetre identificar a NbToc159A per a cloroplasts i NbOm64 per a mitocondris, com els principals receptors implicats en el transport de la CP a aquests orgànuls. Alhora, el silenciament de NbToc34, NbToc75 o NbTom40 va resultar en una resistència generalitzada a MNSV, TCV i CarMV, la qual cosa recolza la idea que circula actualment i que involucra l'estat fisiològic del cloroplast i el mitocondri en la senyalització primerenca de la resposta defensiva. Finalment, es va fer una cerca de factors de l'hoste que interaccionessin amb la CP mitjançant la innovadora tècnica de marcatge de proximitat amb TurboID, una lligasa de biotina, que permet la detecció d'interaccions tant directes i indirectes com transitòries i estables. Així, es va obtenir un gran nombre de proteïnes candidates utilitzant la CP de MNSV i el seu mutant de localització citoplàsmica, ∆NtCP. Tres de elles, NbSIK1, NbSMU2 i NbMAP3K van mostrar un efecte perjudicial constant i repetitiu sobre l'acumulació de l'RNA viral. Després de la validació de les interaccions mitjançant un altre mètode, i l'examen de la localització subcel·lular de la CP sota el silenciament de cada interactor, es van establir dues hipòtesis principals. En primer lloc, atès que la funció principal de NbSMU2 està relacionada amb el processament i la regulació de l'RNA missatger, aquesta proteïna podria ser segrestada per la CP provocant l'expressió de gens provirals. D'altra banda, NbSIK1 i NbMAP3K actuen com a reguladors positiu i negatiu de la resposta PTI a la infecció, respectivament. A més, les dos proteïnes interaccionen entre si i formen part de la cascada de MAP quinases, per la qual cosa en la nostra segona hipòtesi, la CP interaccionaria amb aquest complex, promovent una regulació negativa de la PTI que facilitaria el desenvolupament de la infecció. / [EN] Plant viruses are the causal agents of many plant diseases and the subsequent economic losses, estimated to be US$60 billion worldwide each year. The melon necrotic spot virus (MNSV) is a small, single-stranded, positive-sense RNA virus that belongs to the genus Gammacarmovirus and encodes five proteins. The coat protein (CP) is composed of three distinct domains. The discovery of a dual transit peptide in the amino-terminal part of the CP was the starting point of this thesis. Early in MNSV infection, the new synthesized CP is imported into chloroplasts and mitochondria, while the cytoplasmic pool increases as the infection progresses. Inhibiting this dual transport leads to an increase in the RNA silencing suppressor activity of the CP. However, far from resulting in an enhanced infection development, systemic spread was impaired. Therefore, the accumulation of cytoplasmic CP may cause an increase in viral replication and overexpression of p29, an auxiliary replicase that causes morphological alterations, ROS, and necrosis that may restrict viral movement. Thus, a new role for CP targeting would be to avoid excessive viral replication by modulating the suppressor activity to manage the balance between plant defense and viral counter-defense, leading to a compatible interaction. Unfortunately, Arabidopsis thaliana is not a host for MNSV. Thus, to better understand the molecular mechanism behind the CP dual targeting, the receptors and pores of the Nicotiana benthamiana mitochondrial and chloroplast outer membrane translocons were genome identified, and some functional characterization was carried out. We assigned the following names NbToc75-III, NbToc34, NbToc90, NbToc120, NbToc159A, NbToc159B, NbTic22-III for chloroplast translocon components, and NbTom40, NbTom20-1, NbTom20-2, NbOm64 for mitochondrion translocon components. The functional characterization was mainly carried out by virus-induced gene silencing (VIGS) and RT-qPCR, revealing a functional redundancy higher than that reported for Arabidopsis homologs. Additionally, VIGS was also used to evaluate the relevance of each translocon component in MNSV infection, and together with CP-receptor interaction studies performed by BiFC and Y2H, allowed us to identify NbToc159A for chloroplasts and NbOm64 for mitochondria as the main receptors involved in the CP organelle import. Moreover, silencing of NbToc34, NbToc75, or NbTom40 resulted in a generalized resistance not only to MNSV but also to turnip crinkle virus (TCV), and carnation mottle virus (CarMV), supporting the current idea that involves the chloroplast and mitochondrion physiological state in early defense response signaling. Finally, a search for host factors interacting with the CP was performed by the innovative TurboID proximity labeling tool, which allows the detection of both direct/indirect and transient/stable interactions. Thus, a large number of candidate proteins were obtained that interacted either with the MNSV CP or with ∆NtCP, a cytoplasm-localized mutant. Three of them, NbSIK1, NbSMU2, and NbMAP3K, showed a consistent and repetitive detrimental effect on MNSV RNA accumulation. After the validation of the interactions using another method and the analysis of the subcellular localization of the MNSV CP under each interactor silencing, two main hypotheses were proposed. Firstly, since the main function of NbSMU2 is related to messenger RNA regulation by splicing, this protein could be sequestered by the CP, causing the expression of proviral genes. On the other hand, NbSIK1 and NbMAP3K act as positive and negative regulators of the PTI response to infection, respectively. Moreover, both proteins interact with each other and are part of the MAP kinase cascade, so in our second hypothesis, CP would interact with this complex, promoting a negative regulation of PTI that would facilitate viral infection. / La autora ha disfrutado de un contrato predoctoral de formación de personal investigador (FPI) (PRE-2018-84130) otorgado por el Ministerio de Ciencia e Innovación asociado al proyecto BIO2017-88321-R. Este trabajo de tesis doctoral ha sido realizado con el apoyo económico de los proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia e Innovación, BIO2017-88321-R y PID2020-115571RB- I00. / Sáiz Bonilla, M. (2023). Deciphering the intracellular dual targeting of the melon necrotic spot virus coat protein, its interaction with host factors and their roles in plant defense [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/195836