As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes nas células em condições normais e supra-expressadas em condições de estresse e choque térmico. O laser de diodo tem sido utilizado em diversos tratamentos na odontologia, dentre eles na atenuação de sintomas e na aceleração do reparo de úlceras traumáticas. O objetivo deste estudo foi verificar, através de análise imunoistoquímica da expressão das HSPs (Hsp27 e Hsp 47) e da medição de temperatura por intermédio de câmera termográfica, se o laser de diodo modifica, (e quanto modifica) a temperatura local, bem como se há alteração no padrão de expressão das proteínas citadas em três regiões distintas do fragmento analisado. Para este estudo, foram feitos testes in vitro e in vivo. Para os testes in vivo, foram utilizados 56 ratos, nos quais foi induzida úlcera em ventre lingual. Os animais foram divididos em 4 grupos: GL - grupo ulcerado com posterior irradiação com laser (parâmetros: laser diodo, 0,5 W de potência, pulsado (10 Hz), por 40 segundos (método varredura), 80J/cm2 de energia total (área de 0,25cm2) Má, e a energia por ponto?); GN - grupo ulcerado sem nenhum tratamento posterior; CP - grupo controle sem úlcera e irradiado com laser (mesmos parâmetros de GL); e CN - grupo controle sem úlcera e sem nenhum tratamento posterior. O teste in vitro foi destinado à medição da temperatura durante a irradiação laser, quando utilizaram-se línguas de ratos previamente ulceradas e extirpadas, as quais foram irradiadas com os parâmetros para o teste in vivo. Na superfície irradiada, houve aumento médio de temperatura em torno de 6,7C e, na região mais distante dessa superfície, de 2,7C. Na análise semiquantitativa da expressão imunoistoquímica da Hsp27, observou-se padrão de marcação mais intenso em GL comparando-se a GN e aos demais grupos. Na análise quantitativa da Hsp47, houve maior quantidade de células positivas no GL em relação aos demais grupos, principalmente nas regiões mais próximas da superfície irradiada. Concluiu-se que a irradiação laser provocou aumento de temperatura local, bem como desencadeou padrões de intensidade maiores e diferentes da Hsp27 e da Hsp47 em relação aos demais grupos. Isso indica que o tecido irradiado sofreu maior estresse celular, com resposta tecidual de intensa migração e diferenciação celular, bem como de maior síntese colagênica. / Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in cells under normal conditions and over-expressed in terms of stress and thermal shock. The laser diode has been used in various treatments in dentistry, to reduce symptoms and accelerate the repair of traumatic ulcers. The aim of this study was to verify, by means of immunohistochemical expression analysis of HSPs (Hsp27 and Hsp 47) and temperature measurement using a thermographic camera, whether diode laser changes the local temperature (and how much the temperature changes), and whether there is a change in expression pattern of the above-mentioned protein in three distinct regions of the analyzed fragment. For this study, some of the tests were conducted in vitro and others in vivo. For the in vivo tests, 56 rats were used, in which ulcers were induced on the ventral surface of the tongue. The animals were divided into 4 groups: GL-group with ulcer and later laser irradiation (diode laser parameters: 0.5 W power, pulsed (10 Hz), for 40 seconds (defocused), 80J/cm2 total power in area (0.25cm2) GN- group with ulcer and without any further processing; CP- control group without ulcer and with laser irradiation (same parameters as in GL); and GN-control group without ulcer and without any further processing. The in vitro tests were conducted to measure temperature during laser irradiation, using the tongues that had previously been ulcerated in rats, and later removed and irradiated with the same parameters as those used for the in vivo test. In the irradiated surface, there was an increase in mean temperature of around 6.7oC, and in the region more distant from this surface, an increase of 2.7 oC. In the semi-quantitative analysis of immunohistochemical expression of Hsp27, greater expression of Hsp27 was shown in GL in comparison with the other groups in general. In quantitative analysis of Hsp47, there was a larger quantity of positive cells in GL, when compared with the other groups, particularly in the regions closest to irradiated surface. It was concluded that the irradiation laser caused local temperature increase, and also set off greater and different patterns of intensity of Hsp27 and Hsp47, in comparison with those of the other groups. This indicates that the irradiated tissue suffered higher cellular stress, with tissue response of intense migration and cell differentiation, as well as increased collagen synthesis.

Orientadores: Carlos Henrique Inácio Ramos, Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_YurideAbreu_D.pdf: 5998927 bytes, checksum: dad9a44995521aa0e68ad9507bd61765 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As bactérias patogênicas gram-negativas desenvolveram estratégias sofisticadas para infectar seus hospedeiros, utilizando sistemas de secreção especializados para translocar proteínas de virulência através da membrana das células eucarióticas para o citoplasma. Para que este processo seja eficiente, estas proteínas de virulência devem estar parcialmente enoveladas ou mesmo desenoveladas para que possam ser transportadas para o interior das células hospedeiras através desses sistemas de secreção. Uma vez dentro das células alvo, as proteínas de virulência são encaminhadas ao seu estado nativo e ativadas pela própria maquinaria de enovelamento da célula hospedeira. As proteínas responsáveis em auxiliar o enovelamento protéico nas células são as chaperonas, denominadas classicamente de proteínas de choque térmico (Hsps). Plantas, por serem organismos sésseis, são muito mais vulneráveis a fatores de estresse biótico e abiótico, tornando o papel das Hsps ainda mais relevante para a homeostase protéica e viabilidade celular. O estudo das proteínas da família Hsp90 é muito difundido devido ao seu papel fundamental desempenhado nas situações de infecção e em diferentes tipos de estresse. Neste trabalho, a proteína recombinante Hsp90 de laranja doce (Citrus sinesis) foi clonada e purificada com o objetivo de estudar o mecanismo geral de infecção do fitopatógeno bacteriano de espécies de citros Xanthomonas citri (Xac). Investigou-se a interação, combinando técnicas de western blot e ensaios de pull-down, entre a Hsp90 e todas as quatro variantes da PthA, principal fator de virulência de Xac, e as co-chaperonas da Hsp90 de laranja ciclofilina (Cyp) e uma proteína tiorredoxina-"like? (TDX). Estas proteínas já foram descritas por se apresentarem reguladas positivamente na laranja doce durante a infecção com Xac, apontando para um possível papel da Hsp90 na formação de um complexo de enovelamento capaz de ativar as proteínas de virulência de Xac no interior das células infectadas. Além disso, investigamos a estrutura e função da Hsp90 de laranja doce que apresentou-se enovelada e solúvel, como medido por dicroísmo circular (CD), espectroscopia de fluorescência intrínseca e espalhamento de luz dinâmico (DLS). A Hsp90 se apresentou como um dímero em solução com um raio de Stokes de 62 Å, e altamente resistente á desnaturação por temperatura, como medido por CD. A proteína mostrou-se funcional, como medido pela sua capacidade de proteger a agregação da citrato sintase in vitro em um ensaio de espalhamento de luz. O estudo do efeito de nucleotídeos na conformação e função da Hsp90 através de CD, fluorescência intrínseca e de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) mostram alterações na conformação da proteína na presença destes ligantes / Abstract: Gram-negative bacterial pathogens, which have developed sophisticated strategies to infect hosts, use specialized secretion systems to secrete and translocate virulence proteins across the eukaryotic cell membrane into the cytoplasm. The translocation process depends on unfolded or partially folded virulence proteins to be transportated through the secretion system into the target inner cell where they are folded by the host chaperone machinery. Auxiliary proteins are responsible to help folding in cells and are known as molecular chaperones, or heat shock proteins (HSPs). Plants, being sessile organisms, are much more vulnerable to biotic and abiotic stress factors, making the role of HSPs even more important for protein homeostasis and cell viability. The study of the Hsp90 family is widespread due to the key role played in situations of infection and under various types of stress. In this work, an Hsp90 sweet orange (Citrus sinesis) was cloned and purified in order to study the general mechanism of infection of the bacterial pathogen of citrus species, Xanthomonas citri (Xac). First, we investigated the interaction, by combining immunostaining and pull-down assays, between Hsp90 and all four variants of PthA, the major virulence factor of Xac, and the orange Hsp90 cochaperonas cyclophilin (Cyp) and a thioredoxin-like protein (TDX). These proteins have been described to be upregulated in sweet orange during infection with Xac, pointing to a possible role of Hsp90 in the formation of a folding complex able to activate the virulence proteins of Xac inside the infected cells. Furthermore, we took to investigate the structure and function of the Hsp90 from sweet orange, which was folded and soluble as measured by circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering (DLS). Hsp90 was a dimer in solution with a Stokes radius of about 62 Å, tolerating up to 90 °C without denaturation, as measured by CD. The protein was functional, as measured by its ability to protect the aggregation of citrate synthase in an light scattering assay. The study of the effect of nucleotides on the conformation and function of Hsp90 by CD, intrinsic fluorescence and small-angle X-ray scattering (SAXS) show evidence of conformation modulation by ATP and ADP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sergio_jorge.pdf: 2951290 bytes, checksum: 56f3ca5434b1ecaa09d8776156f09097 (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of enzootic pneumonia (EP), a contagious respiratory disease that affects swine production worldwide. M. hyopneumoniae colonizes the ciliated epithelial cells of the respiratory tract, damaging the cells and predisposing the infected animals to secondary infections, causing significant economic losses. The commonly used vaccines to control this disease consist of inactivated whole cells (bacterins). These bacterins provide only partial protection and do not prevent the colonization of M. hyopneumoniae on the epithelial cells. Efforts to develop a more effective vaccine against mycoplasmas have been proposed and vaccines developed using recombinant DNA technology represents a promissing alternative. Although the genomes of four strains of. M hyopneumoniae have been sequenced, few recombinant antigens have been evaluated as candidate vaccines. Our research group produced and evaluated the immunogenicity and antigenicity of 35 secreted recombinant proteins and 6 transmembrane recombinant proteins. Some of these proteins were identified as having the potential to be used as vaccine antigens, including the molecular chaperone DnaK (P42 heat shock protein). The aim of this study was to assess the potential of recombinant P42 in vaccine preparations against EP, using swine animal model housed under field condictions in a M. hyopneumoniae-positive farm. Both, humoral and cellular immune responses were elicited when rP42 was delivered in Phosphate buffer saline, when combined to an oil based adjuvant, and when added to a whole cell vaccine preparation. The results indicate that immunization with rP42 emulsified in oil based adjuvant is able to induce antibodies against M. hyopneumoniae as well as the expression and the anti-inflammatory cytokine IL-10 in pigs. These immunogenic properties make recombinant antigen P42 a promising candidate for a recombinant subunit vaccine against EP. / Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da Pneumonia Enzoótica Suína (PES). A bactéria coloniza e paralisa as células epiteliais do trato respiratório, predispondo o hospedeiro a infecções secundárias, causando significativas perdas econômicas. As vacinas atualmente disponíveis são compostas por células bacterianas inteiras inativadas (bacterinas), as quais proporcionam apenas uma proteção parcial aos suínos. Elas são capazes de reduzir as lesões pulmonares e os sinais clínicos, mas não impedem a colonização pelo agente. Com a finalidade de desenvolver uma vacina mais eficiente contra a PES, o uso da tecnologia do DNA recombinante representa uma estratégia promissora. Após o sequenciamento e análise proteômica de quatro cepas de M. hyopneumoniae, nosso grupo de pesquisa produziu e avaliou a imunogenicidade e antigenicidade de 35 proteínas recombinantes secretadas e 6 proteínas transmembrana. Algumas destas proteínas apresentaram potencial para serem usadas como antígenos vacinais, onde se destacou a chaperona molecular DnaK P42 (proteína de choque térmico). O objetivo deste estudo foi avaliar a proteina recombinante P42 em formulações vacinais contra a PES. Para tanto, foram realizados ensaios utilizando suínos mantidos em condições de campo numa granja com status de positiva para M. hyopneumonia. Foram avaliadas as respostas humoral e celular dos grupos de animais imunizados com a rP42 em tampão fosfato salina, com a rP42 emulsificada em adjuvante oleoso e com a rP42 associada à bacterina comercial. Os resultados mostraram que a imunização com rP42 emulsificada em adjuvante oleoso é capaz de induzir anticorpos contra M. hyopneumoniae além da expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Estas propriedades imunogênicas tornam o antigeno rP42 um candidato para o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante contra a PES.

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Resumo: A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The series of events triggered during the oocyte maturation is very susceptible to environmental stress. Adverse conditions such as pro-oxidant agents and environmental temperature compromise oocyte function, reducing fertilization capacity and subsequent embryonic development. The negative effect of heat stress on bovine fertility has been well characterized. Among the cellular effects of heat stress on bovine oocytes, one can highlight cytoskeletal disorganization, increased production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial damage, and activation of cell death by apoptosis. A conserved effect of heat shock on different cell types is protein denaturation, activating protection mechanisms in the cytoplasm and endoplasmic reticulum (ER) to maintain proteostasis. The ER acts as an environmental stress sensor activating Unfolded Protein Response (UPR), which can trigger autophagy and/or apoptosis, depending on the intensity of the stress. Despite the importance of ER for oocyte function, the effects of heat shock on this organelle have never been investigated. Therefore, the general objectives of this dissertation were to determine the role of ER stress on function of bovine oocytes submitted to heat shock (Chapter 2) and the role of autophagy on gene expression and developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock during in vitro maturation (IVM) (Chapter 3). For the ER studies, cumulus-oocyte complexes (COCs) were initially distributed in the followin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

INTRODUÇÃO: A deiscência das anastomoses colorretais continua uma grave complicação da cirurgia colorretal. Pouco se sabe sobre as alterações moleculares que podem influenciar esse processo, mas entende-se que a síntese do colágeno é fundamental para uma adequada cicatrização. As Heat Shock Proteins (HSP) estão expressas em situações de estresse, tais como a hipovolemia, além de participarem da síntese do colágeno. Além disso, há poucas informações sobre a expressão da HSP70 nos processos cicatriciais. OBJETIVOS: Determinar a expressão da HSP70 no intestino grosso e nas anastomoses intestinais de ratos normo e hipovolêmicos, bem como a quantidade do colágeno total e a qualidade das células inflamatórias envolvidas nesse processo, além de correlacioná-las. MÉTODOS: Utilizaram-se 40 ratos Wistar que foram divididos em seis grupos. Submeteram-se 24 animais a cateterização da artéria carótida, seguida de sangramento (20% da volemia); destes, 8 foram submetidos somente à hipovolemia e, os outros 16, à hipovolemia seguida de colectomia (direita e esquerda). Dividiram-se os outros 16 animais em dois grupos: em oito realizou-se colectomia direita e nos outros oito, esquerda. Os espécimes foram avaliados no 7º e no 14º dia de pósoperat ório (PO). Pela coloração de Hematoxilina-eosina, avaliaram-se as células inflamatórias e a presença de necrose nas anastomoses, pelo método de Picrossírius, a quantidade de colágeno e por imunohistoquímica, a expressão da HSP70. RESULTADOS: A expressão da HSP70 no intestino grosso diminuiu com a hipovolemia (p<0,05). Não houve diferença estatística entre as células inflamatórias encontradas nas anastomoses dos grupos estudados. A quantidade de colágeno foi menor no 7º que no 14º dia de pósoperat ório (p<0,05), diferentemente da expressão da HSP70, que foi maior no 14º que no 7º dia (p<0,05). No 7º dia, a quantidade de colágeno estava menor no grupo desafio que no grupo controle (p<0,05), fato que não se repetiu no 14º dia de pós-operatório. Em relação à expressão da HSP70 nas anastomoses intestinais, não houve diferença estatística entre o grupo desafio e o controle, mas no à direita, tanto no 7º quanto no 14º dia houve tendência à diferença significativa. CONCLUSÕES: A expressão da HSP70 no intestino grosso é afetada pela hipovolemia, aumenta na cicatrização das anastomoses e é mais evidente quando a quantidade de colágeno é menor. A expressão da HSP70 pode ser um potencial marcador biológico das complicações das anastomoses intestinais. / INTRODUCTION: The anastomotic leakage remains a serious complication in surgery of large bowel. The influence about the molecular mechanisms involved at this process is barely known, but its well known that collagen synthesis is essential for good healing. The Heat Shock Proteins (HSP) are expressed at stress situations, such as hypovolemia, also they are involved at the process of collagen synthesis. Besides, there are a few information about HSP70 expression at the healing process. OBJECTIVES: To determine the HSP70 expression at large bowel and intestinal anastomoses in normal and hypovolemic rats, as well as the amount of collagen and the quality of the inflammatory cells involved at this process, and correlate them. METHODS: It was used fourty Wistar rats divided into six groups. Twenty-four rats were submitted to catheterization of carotida artery followed by withdraw of 20% of their blood volume; eight of them were underwent just to hypovolemia and the others sixteen to hypovolemia followed by colectomy (right and left). The remaining sixteen rats were divided into two groups: eight of them were underwent to right colectomy and eight to the left. The specimens were analyzed at the seventh and fourteenth postoperative (PO) days. The inflammatory cells were assessed by Hematoxilin-eosin, the amount of collagen was stained by red Picrossirius and the HSP70 expression was determined by immunohistochemical study. RESULTS: The HSP70 expression at the large bowel gets lower when there is hypovolemia (p<0.05). There was no statistic difference on the inflammatory cells found in the groups. The amount of collagen was lower at the seventh than the fourteenth day (p<0.05), unlikely the HSP70 expression, which was the opposite (p<0.05). At the seventh day, the amount of collagen was lower at the study group than at the control group (p<0.05), otherwise at the fourteenth postoperative day. There was no statistic difference in HSP70 expression at the anastomoses of the groups, but at the right colon, there was disposition to significative difference at both days. CONCLUSION: The HSP70 expression at the large bowel is modified by hypovolemia, increases at the anastomoses healing and is more evident when the amount of collagen is lower. The HSP70 expression can be a potential biological marker of the complication of these anastomoses

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs

A diversidade de tripanossomas é atribuída a um arsenal gene vasto. HSP compreendem várias famílias que atuam como uma chaperona moleculares em condições de estresse e fisiológicas. A HSP70 em tripanossomas consiste em 9 genes: Canonical, HSP70.4, HSP70.c, GRP78, Lc2.2, HSP70.b, Grp170, HSP110 e HSP70.a. Análises filogenéticas indicam que a evolução de HSP70 segue um padrão de ramificação que coincide com a compartimentação celular. As inferências filogenéticas de Trypanosoma obtidas a partir de genes que codificam HSP70s foram compatíveis com os obtidos por gGAPDH indicando que as HSP70s são uteis como marcadores moleculares. Os genes que codificam proteínas possuindo domínio P3/alfa-cristalino (ACD) na sua estrutura atuam como chaperonas envolvidas na proliferação e migração celular, citoesqueleto, na resposta a agentes patogénicos e desenvolvimento. Nove chaperonas putativas com o ACD foram recuperadas em Trypanosoma: TryDYX1C1, TrySGT1, Tryp23A, Tryp23B, TryNudC1, TryNudC2, HSP20, TryACDP, TryACD-TPR. / The diversity of trypanosomes is attributed to a vast gene arsenal. HSP comprehends several families which acts as a molecular chaperone in stress and physiological conditions. The HSP70 in trypanosomes consists of nine genes: Canonical, HSP70.4, HSP70.c, Grp78, Lc2.2, HSP70.b, Grp170, HSP110 and HSP70.a. Phylogenetic analysis shows that the evolution of HSP70 from Trypanosoma follows branching pattern that coincides with the cellular compartmentation. Phylogenetic Inferences of Trypanosoma obtained from genes encoding HSP70s were compatible with those obtained by gGAPDH indicating that HSP70 gene is a useful molecular maker. Genes encoding proteins having p3/alpha-crystalline domain (ACD) in its structure act as chaperones and co-chaperones involved in cell proliferation and migration, cytoskeleton and in response to pathogens and development. Nine putative chaperones containing the ACD were recovered in Trypanosoma: TryDYX1C1, TrySGT1, Tryp23A, Tryp23B, TryNudC1, TryNudC2, HSP20, TryACDP, TryACD-TPR.

A leishmaniose tegumentar é uma zoonose que ocorre endemicamente em 88 países, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Estima-se que o número de pessoas infectadas por Leishmania seja de cerca de 12 milhões e que ocorram entre 700 mil a 1,2 milhões de novos casos anualmente. O Brasil apresenta a maior prevalência de leishmaniose tegumentar na América, sendo que já foram identificadas seis espécies como causadoras de leishmanise tegumentar: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi. Apesar de termos diferentes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar no Brasil e com diferentes formas clínicas, a discriminação das espécies de Leishmania responsáveis por determinada lesão ainda é um desafio. Utilizando as técnicas qPCR, HRM e PCR multiplex, com pares de oligonucleotídeos contruídos e direcionados para o gene alvo hsp70, propomos uma alternativa para os ensaios utilizados atualmente para a identificação de Leishmania e diferenciação dos subgêneros Leishmania e Viannia em cultura de promastigota. A identificação do subgênero Leishmania obtida nos nossos resultados em amostras de cepas referência e em amostras de isolados de pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas, correspondem ao obtido por PCR-RFLP direcionada para o alvo kDNA com a enzima de restrição HaeIII realizada num estudo anterior. No entanto, este estudo permitiu a identificação do subgênero em apenas um passo, o que contribui para a redução do tempo, custo e manuseio de amostras. Diante desses resultados, sugere-se a validação da técnica em DNA de amostras de amastigotas de lesões tegumentares de pacientes diagnosticados com esta doença / The cutaneous leishmaniasis is a zoonotic disease that is endemic in 88 countries, characterized as a serious public health problem in tropical and subtropical countries. It is estimated that the number of people infected by Leishmania to be about 12 million, occurring between 700 thousand to 1.2 million new cases annually. Brazil has the highest prevalence of cutaneous leishmaniasis in America and six species have been identified as causes of cutaneous leishmaniasis: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi. Although we have different species that cause cutaneous leishmaniasis in Brazil and with different clinical forms, discrimination against Leishmania species responsible for certain injury is still a challenge. Using the techniques qPCR, HRM and multiplex PCR with oligonucleotide engineer to the target gene hsp70, propose an alternative to the currently used assays for Leishmania identification and Leishmania and Viannia subgenus differentiation in parasite promastigote culture. The identification of Leishmania subgenus obtained in our results with parasite promastigote culture of reference strains samples and isolates in patients with suspected tegumentary leishmaniasis attended at the Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas, corresponded to that obtained by PCR-RFLP directed to the target kDNA with HaeIII restriction enzyme carried out in a previous study. However, this review allowed the identification of the subgenus in just one step, contributing to the reduction of time, cost and handling of samples. Given these results, we suggest the validation of this technique in DNA of amastigote samples from tegumentary lesions of patients diagnosed with this disease

A proteína Cpn60 faz parte de um grupo de proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em funções celulares essenciais. camundongos BALB\\c foram imunizados com 5 ou 10 µg da proteína recombinante (Cpn60r) sozinha ou adicionada à vacina DTP sem hidróxido de alumínio (NADTP). A vacina DTP do Instituto Butantan (DTP) foi usada como controle. Foi avaliada a produção de citocinas por células esplênicas após reestímulo in vitro com a Cpn60r. Os animais foram desafiados após o protocolo de imunização. A Cpn60r sozinha ou misturada à vacina NADTP foi capaz de induzir níveis de anticorpos contra pertussis mais altos do que os induzidos pela DTP. Os níveis de IgG1 e IgG2a foram similares para todos os grupos. Pôde-se observar a produção de de IL-6 e IFN-&#947 nos grupos imunizados com Cpn60r. Os grupos imunizados com Cpn60r+NADTP apresentaram um índice de proteção entre 60 e 80% contra o desafio pela bactéria virulenta, semelhante ao grupo imunizado com DTP. A proteína Cpn60r é bastante promissora não somente como imunógeno, mas também como adjuvante. / The Cpn60 protein is a member of a group of higly conserved proteins linked to essencial cell functions. The Cpn60 was cloned, expressed and its immune response has been evaluated. BALB\\c mice were immunized with 5 or 10 µg of the recombinant protein (Cpn60r) alone or mixed with DPT vaccine without aluminum hidroxyde (NADPT). The DPT vaccine from Instituto Butantan was used as control. We evaluated the cytokines production by spleen cells after they have been reestimulated in vitro with Cpn60r. The animals were challenged after the immunization protocol. The Cpn60r alone or mixed with NADPT vaccine was able to induce higher antibodies levels than DPT. IgG1 and IgG2a levels were similar in all groups. We could detect levels of IL-6 and IFN-&#947 on groups immunized with Cpn60r. The groups immunized with Cpn60r+NADTP showed a 60 and 80% protection rate against the challenge with the live bacteria, similar to the group immunized with DPT. These results show the immune response of the recombinant protein that could be included in immunization protocols for pertussis.

A proteína de choque térmico Hsp90 é uma chaperone molecular encontrada no citosol. O cDNA incompleto desta proteína foi isolado de uma biblioteca construída a partir de mRNA de células de esporulação de B. emersonii submetidas a choque térmico. Um clone genômico contendo a seqüência completa do gene hsp90 também foi isolado, seqüenciado e caracterizado. A região codificadora do gene hsp90 é interrompida por um único íntron de 184 nucleotídeos. A seqüência de aminoácidos deduzida indicou uma proteína de 71 O resíduos, com massa molecular calculada de 80.792 Da e um pl médio de 4,85. Experimentos de extensão de oligonucleotídeo e RACE-PCR demonstraram um sítio único de início de transcrição localizado a -65 e -70 nucleotídeos do ATG da metionina iniciadora, respectivamente. Motivos similares ao consenso do elemento de choque térmico eucariótico (HSE) e do elemento responsivo a estresse (STRE) foram encontrados na região promotora do gene a -395 e -98 nucleotídeos do ATG, respectivamente. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para a Hsp90 apresenta níveis máximos aos 90 minutos da fase de esporulação do fungo. Análise por \"western blot\" mostrou que a proteína Hsp90 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo e os níveis máximos de acúmulo foram observados aos 90 minutos da esporulação, indicando um controle transcricional do gene. Tanto a proteína quanto o mRNA são altamente induzidos quando as células são submetidas a choque térmico e a cádmio. As proteínas Hsp60 e Hsp10 são chaperones moleculares mitocondriais (chaperoninas). Os cDNAs completos destas proteínas foram isolados e totalmente seqüenciados. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp60 corresponde a uma proteína de 559 resíduos, com massa molecular calculada em 58.741 Da e um pl médio de 8, 7. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp60 tem níveis máximos de expressão aos 90 minutos da esporulação. Análise por \"western blot\" mostrou que a Hsp60 está presente durante todo o ciclo de vida do fungo, com níveis máximos da proteína 90 minutos após a indução da esporulação. Tanto a proteína quanto o mRNA são bastante induzidos quando as células são submetidas ao choque térmico. A seqüência de aminoácidos deduzida da Hsp10 corresponde um polipeptídeo de 101 resíduos com massa molecular calculada em 10.688 Da e um pl médio de 6,25. Experimentos de \"Northern blot\" revelaram que o mRNA para Hsp10 tem níveis máximos de expressão aos 120 minutos da germinação e é bastante induzido quando as células são submetidas ao choque térmico. / The heat shock protein 90 (Hsp90) is a cytosolic molecular chaperone. The incomplete cDNA of this protein was isolated by immunoblot screening of a heat shock cDNA expression library. The complete genomic clone was also isolated and completely sequenced and characterized. The coding sequence is interrupted by a single intron with 184 nucleotides. The deduced amino acid sequence corresponds to a 710-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 80,792 Da and an average pl of 4.85. Primer extension and RACE-PCR experiments demonstrated a single transcription start site localized -65 and -70 nucleotides from de ATG of the initiator methionine, respectively. Sequence motifs resembling the standard eukaryotic heat shock element (HSE) and the stress responsive element (STRE) were evident in the regulatory region -395 and -98 nucleotides from de ATG, respectively. Northern blot analysis revealed that the Hsp90 mRNA presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation stage. Immunoblot analysis indicated that the Hsp90 is present during the entire life cycle of the fungus and maximum levels were observed 90 minutes after the induction of sporulation, indicating a transcriptional control. During heat shock both the mRNA and the Hsp90 protein are highly induced. Proteins Hsp60 and Hsp10, are mitochondrial molecular chaperones (chaperonines). The complete cDNAs encoding these proteins were and completely sequenced. The deduced amino acid sequence for Hsp60 corresponds to a 559-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 58,741 Da and an average pl of 8.7. Immunoblot analysis showed that Hsp60 is present during the entire life cycle of the fungus and presents maximum levels by 90 minutes of the sporulation. Northern blot analysis indicated maximum levels of the Hsp60 mRNA by 90 minutes of sporulation too. Both mRNA and the protein are highly induced during heat shock. The deduced amino acid sequence for Hsp10 corresponds to a 101-residue polypeptide with a calculated molecular mass of 10,688 Da and an average pl of 6.25. Northern blot analysis indicated maximum mRNA levels by 120 minutes of germination and high levels of expression when the cells are exposed to heat shock.