Orientadora : Profª. Drª. Chirlei Glienke / Coorientador : Prof. Dr. Fabricio Packer Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 / Inclui referências : f. 42-44;61-63;67-71 / Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que ameaça a Citricultura brasileira, causando lesões em frutos e sua queda prematura em estágios mais severos, levando a prejuízos de produção e rejeição no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, presente em folhas caídas em decomposição na forma sexuada (ascósporos) e nas lesões dos frutos, em folhas aderidas à planta e ramos secos na forma assexuada (picnidiósporos). O uso de fungicidas sistêmicos ainda é a principal alternativa de controle, mas se depara com os principais problemas do seu uso excessivo como toxicidade ambiental, acúmulo de resíduos nos frutos e seleção de patógenos resistentes. A busca por um controle alternativo pode envolver microrganismos endofíticos de plantas medicinais, uma vez que é conhecido seu potencial biotecnológico e poder protetor da planta hospedeira, mas depende do conhecimento do ciclo infeccioso do patógeno sob vários aspectos. Sabe-se da importância do manejo de ramos secos no controle da doença mas pouco se conhece sobre a participação dos ramos na epidemiologia da MPC. Técnicas tradicionais de isolamento em meio de cultura juntamente com ensaios moleculares têm agilizado o diagnóstico de doenças, oferecendo dados importantes sobre vários patosistemas. Adicionalmente, o uso de microrganismos transformados geneticamente para expressão de uma proteína repórter, como a green fluorescente protein (gfp), trazem uma nova ferramenta para o monitoramento desses microrganismos e entendimento do seu ciclo infeccioso. No presente estudo foram avaliados 128 ramos de área de alta incidência da MPC, pertencentes a quatro estados fenológicos: novo, jovem, velho e seco. O isolamento destes tecidos revelou 1,6% de amostras positivas para P. citricarpa, apenas em tecidos de estado fenológico velho, enquanto a extração de DNA direto dos tecidos seguido de PCR espécie específico não revelou a presença do patógeno. Foi avaliada a sobrevivência do fungo patogênico em ramos de citros destacados, pela inoculação de suspensão conidial da linhagem transformante LGMF06-T2 (gfp) de P. citricarpa. Foi possível recuperar o fungo inoculado dos tecidos após 45 dias da sua inoculação, não sendo recuperado após 90 e 135 dias. A espécie inoculada foi confirmada por microscopia de fluorescência, e este resultado sugere a sobrevivência do patógeno nos ramos por pelo menos 45 dias. Adicionalmente, foi avaliado o efeito do extrato metabólico do fungo endofítico Diaporthe terebinthifolii sobre a formação de picnídios de P. citricarpa em ramos autoclavados. Fragmentos de 1 cm de ramos autoclavados foram depositados sobre meio ágar-agua e em suas laterais foram inoculados fragmentos miceliais do patógeno. Comparou-se o crescimento micelial e formação de picnídios nos ramos tratados com o extrato do fungo endofítico com relação aos ramos não tratados e ramos tratados com fungicida comercial. Observou-se que o extrato reduz a formação de picnídios comparativamente ao controle negativo, apresentando efeito similar ao promovido pelo fungicida. Tais resultados confirmam o potencial do extrato do fungo D. terebinthifolii no controle do patógeno P. citricarpa. Palavras-chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, endófitos, controle alternativo / Abstract: The Citrus Black Spot (CBS) is a threat to the Brazilian Citrus, causing fruit lesions and premature fruit drop in more severe cases, leading to yield losses and fruit rejection in the consumer market. CBS is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, which ascospores are the sexual stage, found in decomposing fallen leaves, and picnidiospores are the asexual stage, present in fruit lesions, attached leaves and dried branches. Systemic fungicides are the main control alternative, but its overuse causes problems like the environmental toxicity, residues accumulation in fruits and also the selection of resistant pathogens. The search of an alternative disease control method may involve endophytic microorganisms of medicinal plants, due to their biotechnological potential and protective power of the host plant, but it is important to know about the infectious cycle of the pathogen. We know the importance of handling dry branches for CBS control but there is a lack of information about this pathosystem, mainly about the influence of branches in the disease epidemiology. The use of traditional isolation techniques coupled with molecular techniques have enhanced the diagnosis of diseases, providing important data on the interaction between the plant and the pathogen. Additionally, the use of genetically transformed microorganisms for the expression of a reporter protein, such as green fluorescent protein (GFP) brings a new tool to understand the pathogen infectious cycle. In the present study, we evaluated 128 branches in area of high incidence of CBS, belonging to four growth stages: new, young, old and dried. The isolation of these tissues showed 1.6% of samples with the presence of P. citricarpa, only in branches in old growth stages, while the method used for DNA extraction and PCR directly from the branches tissue did not reveal the pathogen. We also evaluated the fungus survival in detached citrus branches by inoculating a conidial solution of the LGMF06-T2 transformed strain expressing the green fluorescent protein (GFP). The pathogen was reisolated from the branches after 45 days of inoculation, with the gfp strain confirmed by fluorescence microscopy. These findings suggests that the pathogen can survive in branches for at least 45 days. Additionally, we evaluated the control effect of metabolic extract of the endophytic fungus Diaporthe terebinthifolii over micelial growth and pycnidia formation of P. citricarpa in autoclaved branches. Branches fragments (1 cm) were placed on water agar media and mycelium fragments of the pathogen were inoculated on its sides. It was evaluated the micelial growth and pycnidia formation on the branches treated with the the endophytic fungus extract, compared with non-treated branches and branches treated with commercial fungicide. The extract treatment reduced the formation of pycnidia compared to the non-treated branches, and its inhibition was similar to the fungicide treatment. These findings confirm the potential of D. terebinthifolii extract in the control of P. citricarpa. Keywords: Citrus Black Spot, Phyllosticta citricarpa, epidemiology, disease control, endophytes, alternative control

Orientadora : Profª Drª Vanessa Kava / Coorientadora : Profª Drª Chirlei Glienke / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/11/2014 / Inclui referências : f.65-69;85-90;113-115;118-122 / Área de concentração : Genética / Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que causa lesões nas principais variedades de frutos cítricos e, em casos mais severos, causa sua queda prematura, levando a prejuízos de produção e perdas no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, cujos esporos são encontrados em folhas aderidas à planta e em lesões nos frutos na forma assexuada (picnidiósporos), e na forma sexuada (ascósporos) em folhas em decomposição no solo. Neste trabalho foram investigados os mecanismos que desencadeiam o ciclo sexual em diferentes isolados de Phyllosticta citricarpa, obtidos de diferentes regiões geográficas e de diferentes hospedeiros, buscando reconhecer sistemas de compatibilidade existentes. Testes de compatibilidade em variadas condições descritas na literatura e em outras condições propostas neste estudo foram realizados com 165 isolados de Phyllosticta. Algumas condições ensaiadas, previamente descritas na literatura, mostraram-se inadequadas para ensaios de compatibilidade entre diferentes isolados de P. citricarpa. Estruturas semelhantes a corpos de frutificação imaturos foram observadas na zona de encontro entre os isolados LGMF 76 e 114, porém não foram obtidos ascósporos. Na produção de ascósporos estão envolvidos os genes mating type (MAT) que regulam o desenvolvimento da reação sexual. Estes genes foram identificados após o desenho de primers específicos para esta espécie, com o objetivo de caracterizar este importante fitopatógeno quanto à dinâmica de recombinação possível em campo. Dos 148 isolados investigados, 21,62% apresentaram o gene MAT 1-1-1, 78,38% o gene MAT1-2-1. Considerando que os ascósporos, desempenham um papel importante no ciclo da Mancha Preta dos Citros, condições de produção e liberação destes esporos foram recriadas em laboratório com o desenvolvimento de caixas com temperatura, ventilação e umidade controlada, onde plantas axênicas desenvolvidas a partir do embrião de sementes de citros e livres de microrganismos foram utilizadas. Ainda, aspectos da colonização dos frutos pelo fitopatógeno foram investigados, avaliando-se a relação entre o crescimento, colonização de folhas e produção de picnídios frente aos principais terpenos produzidos na casca dos frutos cítricos e que comprovadamente exercem um papel no processo de atração de pragas e patógenos. Em todos os testes realizados foi possível detectar que os terpenos influenciam de diferentes formas o crescimento e a produção de picnídios de P. citricarpa. Este pode ser mais um passo no entendimento do mecanismo de interação entre planta-patógeno, podendo se tornar uma futura forma de controle dessa doença. Palavras - chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenos, interação planta-patógeno / Abstract: The citrus black spot (CBS) is a disease that causes lesions on the main varieties of citrus fruits and, in more severe cases, causes its premature drop, leading to production and consumer market losses. It is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, whose spores are found over leafs attached to the plant and in the lesions of fruits in the asexual form (pycnidiospores), and in the sexual form (ascospores) in decomposing leafs in the soil. The present study investigated the mechanisms that trigger the sexual cycle in different isolates of Phyllosticta citricarpa, obtained from different geographic regions and different hosts, seeking to recognize existing compatibility systems. Compatibility tests on various conditions described in the literature and in other conditions proposed in this study were performed with 165 Phyllosticta isolates. Some conditions tested, previously described in the literature, have proved inadequate for testing compatibility between different isolates of P. citricicarpa. Structures similar to immature fruiting bodies were observed in the area of contact between the isolates LGMF 76 and 114, however ascospores were not obtained. The production of ascospores involves the mating type (MAT) genes which regulate the development of sexual response. These genes were identified after drawing primers specific for this species, with the objective of characterizing this important phytopathogen regarding the dynamics of possible field recombination. Of the 148 isolates investigated, 21.62% presented the MAT 1-1-1 gene and 78.38% the MAT1-2-1 gene. Considering that the ascospores play an important role in the citrus black spot cycle, production conditions and release of these spores were recreated in the laboratory with the development of boxes with controlled temperature, ventilation and humidity, where axenic plants grown from the embryo of citrus seeds and free from microorganisms were utilized. Still, aspects of colonization of the fruit by the phytopathogen were investigated by evaluating the relationship among growth, leaf colonization and production of pycnidia front of the main terpenes produced in the peel of citrus fruits and proven to play a role in the process of attraction of pests and pathogens. In all tests conducted it was possible to detect that the terpenes influence in different ways the growth and production of P. citricarpa pycnidia. This can be another step in the understanding of the mechanism of interaction between plant-pathogen, and may become a future way of controlling this disease. Key - words: citrus black spot, Phyllosticta citricarpa, mating type, terpenes, plant-pathogen interaction