O presente trabalho teve como objetivo determinar, por meio da Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-MS), produtos oriundos da degradação do digluconato de clorexidina (CHX) 2 % em gel. Foram selecionados três géis: comercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), CHX gel UNIARARAS (Manipulado pela Farmácia Ensino Uniararas) e gel CHX 2 % preparado a partir de uma uma solução comercial de CHX 20 % Sigma® no laboratório. Para que fosse possível comparar os resultados, foi preparada uma solução de CHX 2 % partindo da mesma solução comercial de CHX Sigma®. Para a avaliação dos produtos de degradação da CHX 2 %, os géis e a solução foram pesados (1 g / gel 1 mL /solução) e acondicionados em tubos plásticos (Eppendorf®). Os tubos foram subdivididos em quatro diferentes situações de armazenamento (sobre a bancada de trabalho com e sem a presença de luz, em forno de Pasteur a 36,5 °C sem luz e em geladeira a 8 °C sem luz) e quatro diferentes períodos de análise (inicial, após 1 mês, 3 meses e 6 meses de armazenamento) resultando em 52 análises cromatográficas. Após o período determinado, as amostras foram extraídas, filtradas e analisadas por meio de CG-MS. Os resultados mostraram, na análise inicial, que todos os géis e a solução já continham produtos de degradação da CHX (espécies de oxigênios reativos - ROS). Um dos ROS era a pCA. Além da pCA, outros ROS foram observados, oCA e/ou mCA (isômeros da pCA) e os organoclorados orto-isocianato clorofenil e 2-amino-5-clorobenzonitrila. A porcentagem de pCA calculada nas amostras dos géis não foi gradual nem uniforme, levantando a hipótese de falta de homogeneidade da CHX na formulação do gel. A não homogeneidade foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Uma sugestão de manipulação dos géis de CHX foi então sugerida e a homogeneidade da CHX nos géis manipulados desta maneira foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Concluiu-se que os géis e a solução de CHX a 2 % analisados neste trabalho, apresentaram produtos oriundos da degradação da CHX em todas as situações de armazenamento e tempo de análises propostas, essa degradação é um problema intrínseco da CHX. Os produtos formados a partir da oxidação da CHX são tóxicos e possuem características genotóxicas, podendo trazer riscos ao seres humanos com danos celulares e no DNA. Mais estudos são necessários para verificar o potencial carcinogênico da CHX, de seus produtos de degradação e se o uso de produtos contendo CHX é seguro em seres humanos. / The aim of this study was to determine, by means of gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), products originated from the degradation of 2 % chlorhexidine digluconate (CHX) gel. Three gels were selected: commercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), 2 % CHX gel UNIARARAS (handled at the Pharmacy Education UNIARARAS) and 2% CHX gel prepared in laboratory from a commercial 20% CHX solution (Sigma®). For comparison of the results, a 2% CHX solution was also prepared from the same commercial 20 % CHX solution (Sigma®). For assessment of the products of 2 % CHX degradation, the gels and the solution were weighed (1 g / gel - 1 mL / solution) and placed in plastic tubes (Eppendorf®). The tubes were divided into four different storage conditions (on the workbench with and without the presence of light, Pasteur oven at 36.5 °C without light and in a refrigerator at 8 °C without light) and four different evaluation periods (initial and after 1 month, 3 months and 6 months of storage), resulting in 52 chromatographic analyses. After the specified evaluation periods, the samples were extracted, filtered and analyzed by GC-MS. The results showed that, in the initial analysis, all gels and the solution already contained CHX degradation products (reactive oxygen species - ROS). One of the ROS was para-chloroaniline (pCA). In addition to pCA, other ROS were observed, oCA and/or mCA (pCA isomers) as well as the organochlorines ortho-chlorophenyl isocyanate and 2-amino-5-chloro-benzonitrile. The percentage of pCA calculated in the CHX gel samples was neither gradual nor uniform, raising the possibility of lack of homogeneity in gel formulation. The lack of homogeneity was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. Changes in the preparation of the CHX gels were suggested, and the homogeneity of the CHX gels prepared following the suggestions was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. It was concluded that the 2% CHX gels and solution evaluated in this study presented products from CHX degradation in all storage conditions and evaluation periods, and this degradation is an intrinsic problem of CHX. The products formed from the oxidation of CHX are toxic and have genotoxic characteristics, and may pose risks for humans such as damage to cells and DNA. Further studies are required to determine the carcinogenic potential of CHX and its degradation products and whether the use of products containing CHX in humans is safe.

O presente trabalho teve como objetivo determinar, por meio da Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-MS), produtos oriundos da degradação do digluconato de clorexidina (CHX) 2 % em gel. Foram selecionados três géis: comercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), CHX gel UNIARARAS (Manipulado pela Farmácia Ensino Uniararas) e gel CHX 2 % preparado a partir de uma uma solução comercial de CHX 20 % Sigma® no laboratório. Para que fosse possível comparar os resultados, foi preparada uma solução de CHX 2 % partindo da mesma solução comercial de CHX Sigma®. Para a avaliação dos produtos de degradação da CHX 2 %, os géis e a solução foram pesados (1 g / gel 1 mL /solução) e acondicionados em tubos plásticos (Eppendorf®). Os tubos foram subdivididos em quatro diferentes situações de armazenamento (sobre a bancada de trabalho com e sem a presença de luz, em forno de Pasteur a 36,5 °C sem luz e em geladeira a 8 °C sem luz) e quatro diferentes períodos de análise (inicial, após 1 mês, 3 meses e 6 meses de armazenamento) resultando em 52 análises cromatográficas. Após o período determinado, as amostras foram extraídas, filtradas e analisadas por meio de CG-MS. Os resultados mostraram, na análise inicial, que todos os géis e a solução já continham produtos de degradação da CHX (espécies de oxigênios reativos - ROS). Um dos ROS era a pCA. Além da pCA, outros ROS foram observados, oCA e/ou mCA (isômeros da pCA) e os organoclorados orto-isocianato clorofenil e 2-amino-5-clorobenzonitrila. A porcentagem de pCA calculada nas amostras dos géis não foi gradual nem uniforme, levantando a hipótese de falta de homogeneidade da CHX na formulação do gel. A não homogeneidade foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Uma sugestão de manipulação dos géis de CHX foi então sugerida e a homogeneidade da CHX nos géis manipulados desta maneira foi comprovada através de análise em espectrofotometria UV/Vis. Concluiu-se que os géis e a solução de CHX a 2 % analisados neste trabalho, apresentaram produtos oriundos da degradação da CHX em todas as situações de armazenamento e tempo de análises propostas, essa degradação é um problema intrínseco da CHX. Os produtos formados a partir da oxidação da CHX são tóxicos e possuem características genotóxicas, podendo trazer riscos ao seres humanos com danos celulares e no DNA. Mais estudos são necessários para verificar o potencial carcinogênico da CHX, de seus produtos de degradação e se o uso de produtos contendo CHX é seguro em seres humanos. / The aim of this study was to determine, by means of gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), products originated from the degradation of 2 % chlorhexidine digluconate (CHX) gel. Three gels were selected: commercial Gel_Chlorhexidina® (Maquira), 2 % CHX gel UNIARARAS (handled at the Pharmacy Education UNIARARAS) and 2% CHX gel prepared in laboratory from a commercial 20% CHX solution (Sigma®). For comparison of the results, a 2% CHX solution was also prepared from the same commercial 20 % CHX solution (Sigma®). For assessment of the products of 2 % CHX degradation, the gels and the solution were weighed (1 g / gel - 1 mL / solution) and placed in plastic tubes (Eppendorf®). The tubes were divided into four different storage conditions (on the workbench with and without the presence of light, Pasteur oven at 36.5 °C without light and in a refrigerator at 8 °C without light) and four different evaluation periods (initial and after 1 month, 3 months and 6 months of storage), resulting in 52 chromatographic analyses. After the specified evaluation periods, the samples were extracted, filtered and analyzed by GC-MS. The results showed that, in the initial analysis, all gels and the solution already contained CHX degradation products (reactive oxygen species - ROS). One of the ROS was para-chloroaniline (pCA). In addition to pCA, other ROS were observed, oCA and/or mCA (pCA isomers) as well as the organochlorines ortho-chlorophenyl isocyanate and 2-amino-5-chloro-benzonitrile. The percentage of pCA calculated in the CHX gel samples was neither gradual nor uniform, raising the possibility of lack of homogeneity in gel formulation. The lack of homogeneity was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. Changes in the preparation of the CHX gels were suggested, and the homogeneity of the CHX gels prepared following the suggestions was confirmed by UV/Vis spectrophotometry. It was concluded that the 2% CHX gels and solution evaluated in this study presented products from CHX degradation in all storage conditions and evaluation periods, and this degradation is an intrinsic problem of CHX. The products formed from the oxidation of CHX are toxic and have genotoxic characteristics, and may pose risks for humans such as damage to cells and DNA. Further studies are required to determine the carcinogenic potential of CHX and its degradation products and whether the use of products containing CHX in humans is safe.

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:38:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantzger_DarleneDenise_M.pdf: 2112371 bytes, checksum: 028650c262ae910dc42abf89039ad4e4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O uso de produtos agrícolas vem sendo a principal forma de combater parasitas na aquicultura, sendo que o Diflubenzuron, (DFB) é o mais utilizado. Este composto inibe a síntese de quitina, componente do exoesqueleto dos parasitas, e apresenta baixa toxicidade aos peixes. Porém, no ambiente aquático, o DFB pode ser tóxico às espécies não-alvo e, quando degradado, gera p-cloroanilina, (PCA), metabólito potencialmente cancerígeno e mutagênico para o ser humano. Tendo em vista a necessidade de se obter mais informações sobre a toxicidade destes compostos nos organismos aquáticos não-alvo, a proposta deste trabalho foi analisar a atividade enzimática de fosfatases ácida (FAT) e alcalina (Falc), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) de microalga Pseudokirchneriella subcapitata, microcrustáceo Daphnia similis e o peixe Oreochromis niloticus com base na concentração efetiva 50% (CE50) para os testes in vivo, e na concentração de inibição 50% (CI50) para os testes in vitro, do DFB e de seu metabólito PCA. Como resultado do teste de toxicidade aguda a CE50 do DFB foi 0,00096 mg.L-1, 0,009 mg.L-1 e >100 mg.L-1 para algas, daphnias e peixes respectivamente. A CE50 do PCA para as daphnias e os peixes foi de 0,27 mg.L-1 e 24 mg.L-1 , respectivamente. Por sua vez, as algas não sofreram alteração no seu crescimento durante a exposição ao PCA. Nos testes bioquímicos in vivo o DFB e o PCA provocou alterações na atividade das enzimas fosfatases ácida, alcalina, catalase e superóxido dismutase dos organismos-teste. Assim, as enzimas estudadas mostraram-se sensíveis à exposição aos compostos nos estudos in vivo podendo ser utilizadas como indicadoras de poluição dos recursos hídricos por DFB e PCA. Nos ensaios in vitro onde as enzimas foram incubadas com os compostos DFB e PCA em diferentes concentrações, apenas as FAT e CAT do fígado dos peixes sofreram diminuição da sua atividade mediante a exposição a diferentes concentrações de PCA, e foram, portanto, utilizadas para a determinação das constantes cinéticas: Michaelis-Mentem (Km), inibição (Ki), e da velocidade máxima (Vmax), e concentração de inibição média (CI50). A FAT sofreu uma inibição do tipo competitiva (Ki 8,2 mM - Km 0,21 mM - Vmax 0,01211 e CI50 3,2 mM), já a CAT apresentou uma inibição não competitiva (Ki 0,030 mM - Km 56,3 mM - Vmax 0,001198 e CI50 0,20 mM) conforme foi aumentando a concentração de PCA. O teste in vitro foi importante, pois permitiu elucidar o mecanismo de ação do PCA sobre as enzimas FAT e CAT dos peixes. Os resultados desta pesquisa mostraram que ambos os compostos foram tóxicos aos organismos-teste e causaram alterações significativas nos biomarcadores avaliados. Portanto, a utilização do DFB deve ser realizada de forma criteriosa / Abstract: The use of agricultural products has been the main way to combat parasites in aquaculture, and the diflubenzuron (DFB) is the most used for that. This compound inhibits the chitin synthesis of the parasites exoskeleton, and has low toxicity to fishes. However, in the aquatic environment, the DFB can be toxic to non-target species and, when degraded, generate p-chloroaniline (PCA), a metabolite potentially carcinogenic and mutagenic to humans. According to requirement for more information about the toxicity of these compounds on aquatic organisms, the purpose of this study was to analyze the enzymatic activity of acid and alkaline phosphatases, catalase and superoxide dismutase for microalgae Pseudokirchneriella subcapitata, microcrustacean Daphnia similis and fish Oreochromis niloticus based on 50% effective concentration (EC50) for in vivo tests, and 50% inhibiting concentration (IC50) for in vitro tests, for the DFB and its metabolite PCA. The DFB EC50 was 0.00096 mg.L-1, 0.009 mg.L-1 and > 100 mg L-1 for algae, daphnia and fish in acute test. The PCA EC50 for daphnia and fish was 0.27 mg.L-1 and 24 mg.L-1, respectively. In turn, the algae had no change in their growth during exposure to PCA. In biochemical in vivo assays the DFB and PCA caused alterations in the activities of acid and alkaline phosphatases, catalase and superoxide dismutase for test organisms. Thus, the enzymes studied were sensitive to the exposure of these compounds in vivo studies and may be used as biomarkers of water pollution resources by DFB and PCA. On the in vitro test, the enzymes were incubated with the compounds DFB and PCA at different concentrations, only the FAT and CAT of fish liver had decreased activity with exposure to different concentrations of PCA, therefore, were used for determination of kinetic constants Km, Ki and Vmax, and IC50. The FAT had a competitive inhibition (Ki 8,2 mM - Km 0,21 mM - Vmax 0.01211 and IC50 3.2 mM), the CAT had a non-competitive inhibition (Ki 0,030 mM - Km 56,3 - Vmax 0.001198 and IC50 0.20 mM) when the concentration of PCA was increased. The in vitro test was important because has clarified the mechanism of action of PCA on FAT and CAT fish enzymes. The results of this study showed that both compounds were toxic to test organisms and caused significant changes in biomarkers evaluated. Therefore, the use of DFB must be done carefully / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular