Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Grundlagenuntersuchungen zum Aufbau von nanoskopischen Netzwerken aus DNA. Dabei werden zwei Wege verfolgt: Das Stempeln von DNA-Molekülen auf ein Substrat und die Herstellung von Verknüpfungen aus DNA mit Hilfe von Bindeproteinen. Stempeln von DNA-Molekülen In dieser Arbeit wurde ein Beitrag zu den materialwissenschaftlichen Grundlagen des Übertragens von DNA mit der Stempel-Technik erbracht. Hierbei wurden sowohl das Beladen des Stempels durch Molecular Combing als auch die Übertragung der Moleküle durch Transfer Printing unter den speziellen Bedingungen der Verwendung von DNA-Molekülen vertieft untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, gestreckte DNA-Moleküle zielgerichtet in eine mikroelektronische Struktur mit Goldkontakten zu übertragen. Dazu wurde ein Verfahren erarbeitet, bei dem die Kontaktstruktur und ein dazu passender, strukturierter PDMS (Polydimethylsiloxan)-Stempel exakt positioniert werden können. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit vom pH-Wert des Puffers untersucht. Im gesamten pH-Bereich von 4 bis 10 wurde Adsorption mit hoher Belegungsdichte und vollständiger Streckung der Moleküle beobachtet. Diese Beobachtung kann im Rahmen eines phänomenologischen Modells erklärt werden, das auf einer Bilanz der Adsorptionskraft und der für die Streckung der DNA notwendigen Kraft beruht. In der Literatur wird hingegen berichtet, dass bisher nur in einem kleinen pH-Bereich um 5,5 diese hohe Adsorptionsrate gestreckter Moleküle auf einer hydrophoben Oberfläche erreicht werden konnte. Das Adsorptionsverhalten von DNA auf PDMS wurde in Abhängigkeit von der NaCl-Molarität des Puffers untersucht. Es wurde festgestellt, dass mit steigender Salzkonzentration die Belegungsdichte an Molekülen zunimmt und bei ca. 100 mM ein Maximum aufweist. Aus dem Gang der Anzahl der adsorbierten Moleküle mit der Salzkonzentration ist erkennbar, dass dieser Prozess zumindest durch zwei konkurrierende Mechanismen bestimmt ist: der Zunahme der Bindungen zwischen DNA und Substrat aufgrund steigender Adsorption von Na+- Ionen auf der DNA bzw. dem Substrat und von Cl-- Ionen auf dem Substrat (dies führt zu einer Zunahme der Adsorptionsrate) und der Stabilisierung des Doppelstranges (dies führt zu einer Abnahme der Adsorptionsrate). Die hohe Adsorptionsrate geschlossener Plasmide zeigte, dass die Adsorption auf PDMS auch bei DNA-Molekülen möglich ist, die keinen bevorzugten Ort für das Aufschmelzen des Doppelstranges haben. Experimentell konnten die Ergebnisse einer Modellrechnung bestätigt werden, wonach bei doppelsträngiger DNA bereits zwei aufgeschmolzene Basenpaare ausreichen, damit die Adsorption über hydrophobe Wechselwirkungen beginnen kann. Der Nachweis der vollständigen Übertragung der DNA-Moleküle während des Transfers vom Stempel auf das Substrat wurde rasterkraftmikroskopisch geführt. Der Transferprozess wurde experimentell untersucht und daraus resultierend seine Darstellung als zweistufiger Mechanismus vorgeschlagen. Es wurde gezeigt, dass Wassermolekülen beim Übertragungsprozess die entscheidende Rolle zukommt: Wassermoleküle, die sich entlang der DNA befinden, müssen den Kontakt zum Wasserlayer auf dem Glas vermitteln, so dass die DNA nach dem Prinzip des kapillaren Greifens übertragen werden kann. DNA-Verknüpfungen mittels Tet-Repressor-Protein Die aus der bakteriellen Genregulation bekannte sequenzspezifische Bindung zwischen der tetO-Sequenz auf der DNA und dem TetR-Protein wurde genutzt, um definierte Konstrukte aus DNA und Bindeproteinen herzustellen. Mit dem modifizierten Protein scTetRtDL, das zwei Bindedomänen für tetO besitzt, konnten jeweils zwei DNA-Moleküle verknüpft werden. Aus 568 bp-Fragmenten, die leicht außermittig die tetO-Sequenz tragen, wurden durch die Bindung mit scTetRtDL kreuzförmige DNA-Strukturen hergestellt. Das ca. 1 µm lange, linearisierte und tetO-tragende Plasmid pUC19/AV16 wurde verwendet, um größere Strukturen herzustellen. Durch Schneiden des Plasmides mit verschiedenen Restriktionsenzymen und der daraus resultierenden Variation der Position von tetO ist die Konstruktion von unterschiedlichen Strukturen möglich. Mittels Proteinbindung wurden Kreuzungen und aneinander gekettete Moleküle (so genannte Verlängerungen) erzeugt. Die konstruierten DNA-Protein-Komplexe wurden mit dem Rasterkraftmikroskop abgebildet. Mittels Gelelektrophorese wurde der Einfluss der sequenzinduzierten Biegungen im Plasmid pUC19/AV16 auf das Laufverhalten im Gel untersucht.

Topoisomerase 2α (Topo2α) is an essential protein with DNA decatenating enzymatic properties, indispensable for chromosome decatenation and segregation. It is a target for a plethora of antitumour drugs and Topo2α protein levels have been associated with the success of treatment, but also drug resistance and secondary malignancies. Although unique in its ability to resolve catenated chromosomes, the role of Topo2α in other steps of DNA metabolism, such as DNA replication elongation and termination have been elusive. A thorough understanding of the role of Topo2α in the cell will not only allow for increased insight into the mechanisms it is involved in, but it will also shed light on proteins and pathways that can act as back-up in its absence, and therefore hopefully expand the basis on which to improve treatment options. Through a synthetic lethal interaction (SLI) screen with an siRNA library targeting 200 DNA repair and signalling genes, Topo2α emerged as being synthetic lethal to Werner protein (WRN), a RecQ helicase involved in maintaining genome integrity mainly in S phase, and the loss of which leads to Werner Syndrome (WS), a segmental progeroid syndrome. The screen was performed in WRN deficient cells, with the initial aim to find proteins that act to buffer against loss of viability, which is the central idea in the concept of synthetic lethality in the absence of WRN. The screen revealed an SLI between WRN and Topo2α and although we were unable to fully validate this, it spurred the question of Topo2α’s role in DNA replication. The findings in this thesis suggest that Topo2α is not required for DNA elongation and timely completion of S phase, and that simultaneous loss of the closely related isoform Topo2β does not affect replication, suggesting that these proteins do not act in parallel back-up pathways during replication. Interestingly, cells accumulate in the polyploid fraction after both depletion and inhibition of Topo2α, albeit with different kinetics. The mechanistic basis of this phenotype remains to be understood through further research, but it is highly interesting as aneuplidity and polyploidy are implicated in the initial stages of tumour development.

Parmi les cancers du sein, 5 à 10% serait associé à une prédisposition génétique familiale. La prise en charge des patients prédisposés nécessite une bonne définition des risques de cancer. L’identification de l’altération moléculaire causale dans chacune de ces familles est donc un enjeu essentiel dans la prise en charge médicale. Deux gènes, BRCA1 et BRCA2, sont associés à une prédisposition majeure au cancer du sein et de l’ovaire depuis le milieu des années 1990, expliquant environ 15% des formes héréditaires. L’analyse moléculaire de ces deux gènes est désormais réalisée en routine pour la recherche de variations nucléotidiques et plus récemment de remaniements géniques ce qui a permis d’améliorer le taux de détection de mutations délétères. Cependant, pour près de 85% des familles avec une agrégation familiale ou un âge anormalement jeune de cancer du sein, aucune mutation délétère n’a pu être mise en évidence. Dans ce contexte, mon travail de thèse a eu pour objectif de tester plusieurs hypothèses permettant d’expliquer les risques de cancer du sein observés chez des familles montrant l’absence de mutation des gènes BRCA1 et BRCA2. Nous avons ainsi recherché des mécanismes d’altération rarement explorés pour les gènes BRCA1 et BRCA2, et enfin analysé d’autres gènes candidats dont le gène CDH1 et huit autres gènes impliqués dans la réparation de l’ADN. Nous avons pu mieux caractériser des remaniements sur les gènes BRCA1 et BRCA2. Enfin, nous avons pu évaluer l’impact de variants de signification inconnue et des réarrangements détectés par l’étude de leurs transcrits. Dans un premier temps, nous avons mis en place et validé de nouvelles approches techniques de détection et de caractérisation : la CGH-array dédiée, la qPCR-HRM et le peignage moléculaire. Ces techniques ont ensuite été utilisées pour étudier les remaniements géniques et leur fréquence pour onze gènes candidats à la prédisposition au cancer du sein à partir de 472 familles négatives aux mutations délétères BRCA1 et BRCA2. Parmi ces 11 gènes, nous pouvons conclure que les remaniements géniques détectés concernent principalement les gènes BRCA1 et BRCA2, et à un moindre degré le gène CHEK2. En appliquant ces techniques, nous avons pu décrire de nouveaux événements, deux larges délétions et une duplication intronique, pour les gènes CDH1 et BARD1, ouvrant de nouvelles perspectives sur l’étude des transcrits alternatifs. Nous avons en particulier pu décrire la grande diversité des réarrangements délétères en 5’ du gène BRCA1. L’enjeu est ensuite l’interprétation de ces événements. Notre étude des transcrits a permis de décrire un variant exonique d’épissage entraînant une délétion de l’exon 23 au niveau du transcrit BRCA1. Nous avons aussi validé la pathogénicité d’un réarrangement en phase de l’exon 3 de BRCA2 par une étude quantitative du transcrit et une évaluation de la coségrégation. Au final, moins de 1% de nouveaux remaniements ont été mis en évidence. Ce travail est riche d’enseignement pour les nouvelles investigations à mettre en place pour les familles prédisposées. En dehors de la technique d’identification, il est nécessaire de développer des stratégies de validation basées principalement sur la quantification des effets de ces altérations au niveau de l’ARN et des protéines. Cependant, il manque encore de nombreux chaînons pour expliquer l’héritabilité des cancers du sein. Les études sur les nouveaux gènes candidats et l’avènement des techniques de séquençage pangénome à haut débit, devraient permettre d’avoir une meilleure vision des phénomènes pathobiologiques liés à la prédisposition au cancer du sein. / Five to 10% of breast cancers are linked to a genetic predisposition. The management of patients at risk requires a good definition in the risk of cancer. The identification of causal molecular alterations in each of these families is a key issue in medical care. Two genes, BRCA1 and BRCA2, are related with the greatest susceptibility to breast cancer and ovarian cancer since the mid-1990s, accounting for about 15% of hereditary forms. Molecular analysis of these two genes is now routinely performed for the detection of nucleotide variations and more recently large rearrangements which have improved the detection rate of deleterious mutations. However, for more than 85% of families, no mutation explains familial aggregation or unusual young age of breast cancer onset. In this context, my thesis aimed at testing several hypotheses to explain the risks of breast cancer observed in families without any identified mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes. We investigated some mechanisms of genic rearrangements rarely explored for BRCA1 and BRCA2 genes, and finally investigated other candidate genes, especially CDH1 gene and eight other genes involved in double-strand DNA repair. We have better characterized some rearrangements in the BRCA1 and BRCA2 genes. Finally, we applied RNA quantitative approaches to better assess the impact from variants of unknown significance and detected rearrangements. Initially, we developed and validated new technical approaches for detection and characterization such as dedicated CGH-array, qPCR-HRM and molecular combing. Rare large germline rearrangements and their frequency in eleven candidate genes for susceptibility to breast cancer were studied among 472 families negative by routine testing for BRCA1 and BRCA2 genes. Of these 11 genes, we conclude that genic rearrangements are found then mainly in the BRCA1 and BRCA2 genes, and to a lesser extent in the CHEK2 gene. We were able to describe two large intronic deletions and one duplication for the CDH1 and BARD1 genes, opening new perspectives on the regulation of their alternative transcript. In particular, we described the wide diversity of new rearrangements involving the 5' region of the BRCA1 gene. Then, it is necessary to validate and interpret those new events. Our transcript analysis described a new exonic variant causing the splice deletion of exon 23 in BRCA1 gene. We have developed tools to validate an in-frame large rearrangement of BRCA2 exon 3 with some transcript quantitative approaches and disease cosegregation.Finally, less than 1% of new rearrangements have been identified. This work is instructive for further investigations to establish molecular etiology in those families with breast cancer predisposition. Not only by applying new technologies, it is necessary to develop other strategies based primarily on quantifying effects of these alterations on transcription and traduction. However, it still lacks many links to explain the heritability of breast cancer. The combination of new candidate genes studies and the advent of high-throughput sequencing are expected to give a better vision of pathobiological phenomena related to the breast cancer predisposition.

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