Nous présentons dans ce manuscrit le travail visant à faire croitre des nanofils de silicium dans une matrice d'alumine nanoporeuse par la méthode VLS.<br />Nous avons développé un procédé de réalisation d'alumine nanoporeuse sur silicium. Celui-ci permet maintenant de contrôler les propriétés géométriques de l'alumine fabriquée (diamètre des pores, période, épaisseur de la couche). L'organisation latérale est très bonne même s'il est envisageable de l'améliorer.<br />Nous avons aussi étudié différentes méthodes pour déposer de l'or au fond des pores ainsi obtenus. Les avantages et les inconvénients de chacune des méthodes ont été détaillés et nous avons pu ainsi répondre au besoin de départ (l'obtention de catalyseurs d'or). Ces méthodes de dépôt sont utilisables sur substrat massif et présentent des avantages intéressants en termes de souplesse et de simplicité d'utilisation notamment.<br />Enfin, nous avons fait croitre avec succès des nanofils sur substrat massif et dans les pores de l'alumine. Nous avons pu en étudier quelques caractéristiques, notamment structurales. L'utilisation de l'alumine pour positionner les nanofils est donc envisageable et l'effet de guidage des nanofils par les pores pendant la croissance a été démontré. De plus, cet environnement confiné ne fait pas augmenter significativement le nombre de défauts structuraux observés dans les nanofils comparé à des nanofils crûs sur substrat massif. Nous avons réalisé quelques mesures préliminaires des tendances que suit la conduction électrique dans les nanofils. La prise de contacts s'est révélée très facile grâce à la géométrie d'encapsulation des nanofils dans les pores.

Les Adénovirus sont des virus non enveloppés à symétrie icosaédrique et constituent la famille des Adenoviridae. Ils existent une grande variété de souches pouvant infecter des hôtes allant de l'homme jusqu'au poisson. L'étude de l'Adénovirus a été stimulée par la découverte en 1962 par Trentin et collaborateurs de leur capacité à induire des tumeurs chez les bébés hamsters. Sur le plan structural, de nombreuses études en Microscopie Electronique ont été menées pour comprendre l'assemblage et la formation de la capside. Depuis les années 90, avec la progression de l'informatique et des techniques liées à l'analyse d'images, la structure de la capside des Adénovirus humains est de mieux en mieux comprise mais la localisation de certaines protéines mineures restaient encore incertaine ou inconnue. Nous avons, à travers l'utilisation de la Microscopie Electronique associée à l'analyse d'images, obtenu des reconstructions 3D pour plusieurs souches d'Adénovirus humains, canins et aviaires. L'obtention d'un modèle 3D à haute résolution pour l'Adénovirus humain de type 5 nous a permis de reconstituer un modèle quasiatomique par la méthode de « fitting » et de déterminer avec plus de précisions la position de certaines protéines mineures comme la protéine IX, IIIa et VIII. L'étude d'une souche mutante d'Adénovirus de type 5 en complexe avec un Fab ainsi que d'une souche canine nous a permis de localiser précisément l'extrémité C terminale de la protéine IX. Enfin l'obtention d'une structure à haute résolution d'un virus immature dérivé de l'Adénovirus humain de type 2 a ouvert la voie sur l'étude et la compréhension de la maturation et de la phase précoce de son cycle cellulaire.

La résistance aux antibiotiques apparaît aujourd'hui comme un problème majeur de santé publique, en particulier à cause de l'apparition de souches de bactéries multirésistantes par production d'enzymes de modification de ces antibiotiques. Nous avons étudié une de ces enzymes de résistance, l'AAC(6')-Ib conférant la résistance aux aminoglycosides, antibiotiques à large spectre utilisés principalement en milieu hospitalier pour lutter contre des infections sévères. Deux variants de cette enzyme se sont répandus dans les souches cliniques résistantes : le premier confère une résistance élargie à tous les aminoglycosides, le second confère une résistance élargie à une autre classe d'antibiotiques, les fluoroquinolones. Nous avons résolu la structure de l'enzyme sauvage et du premier variant par cristallographie aux rayons X. Nous avons également modélisé la structure du deuxième variant. Ces structures nous ont permis d'apporter une explication possible sur l'adaptation de cette enzyme aux différents antibiotiques. En parallèle, nous avons réalisé un criblage de ligands de cette enzyme par RMN à flux continu robotisé. Nous avons pu isoler plusieurs motifs se fixant dans le site actif de l'enzyme constituant des pistes intéressantes dans la conception d'inhibiteurs de l'activité enzymatique.

Les systèmes de défense bactériens face à un stress oxydant reposent essentiellement sur l'expression d'enzymes capables de dégrader les espèces réactives de l'oxygène telles que le peroxyde d'hydrogène, le radical anion superoxyde et le radical hydroxyle. La protéine PerR a été identifiée chez Bacillus subtilis comme senseur de H2O2 appartenant à la famille des métallo-régulateurs Fur. La protéine PerR est un homodimère contenant deux sites métalliques par sous unité : un site à zinc structural et un site de régulation pouvant coordiner un ion Fe2+ ou Mn2+. La protéine PerR se fixe à l'ADN en présence de ses deux métaux pour réprimer la transcription de certains gènes. Contrairement à d'autres senseurs du peroxyde d'hydrogène comme la protéine OxyR chez Escherichia coli et le complexe Orp1-Yap1 chez Saccharomyces cerevisiaie, la caractérisation structurale et biochimique de la protéine PerR n'était pas aussi avancée.<br /> Les travaux présentés dans ce manuscrit rapportent les études structurales menées sur la protéine PerR par cristallographie aux rayons X et par spectroscopie d'absorption des rayons X (SAX). Les différentes structures résolues au cours de ce travail (l'apoprotéine, les formes active et inactive de la protéine) permettent de mieux caractériser la protéine PerR. Le mode de fixation à l'ADN de la protéine PerR est également discuté.<br /> De façon intéressante, tandis que les protéines OxyR et Orp1-Yap1 utilisent des résidus cystéine pour détecter le peroxyde, le mécanisme d'activation de PerR fait intervenir un résidu histidine qui est oxydé en 2-oxo-histidine. Cette oxydation est catalysée par le métal de régulation (Fe2+). Les quatre cystéines de la protéine coordinent l'ion zinc et ne participent pas à la détection du peroxyde. La structure de la forme oxydée de la protéine est également présentée : cette structure met en évidence, pour la première fois dans la PDB, une 2-oxo-histidine dans une structure cristallographique.

Le nickel est un cofacteur essentiel à l'activité de certaines protéines bactériennes, mais il est également toxique à forte concentration. De ce fait, il est indispensable aux bactéries de posséder un système d'import du Ni2+ spécifique et hautement régulé. Dans le cas d'Escherichia coli, il s'agit d'un système ABC composé des cinq protéines de l'opéron nikabcde : NikA, une protéine périplasmique, NikB et NikC, deux protéines formant un pore à travers la membrane interne, et les protéines NikD et NikE, deux protéines cytoplasmiques hydrolysant l'ATP. La régulation de l'expression de cet opéron est assurée par FNR, l'activateur, et de NikR, le répresseur. Dans un premier temps, nous avons travaillé sur une structure de la protéine NikA, résolue à partir de cristaux appartenant au système orthorhombique. Elle nous a permis de montrer que NikA ne fixait pas le nickel sous une forme pentahydratée comme cela était décrit dans la littérature, mais sous la forme d'un complexe FeEDTA(H2O)-, ce qui suggère que le nickel ne se fixe pas directement à la protéine, mais par l'intermédiaire d'un métallophore de structure proche de celle de l'EDTA. En remplaçant l'étape d'extraction périplasmique à l'EDTA par une étape utilisant le chloroforme, nous avons résolu, une seconde structure de NikA à partir de cristaux appartenant au système cristallin hexagonal. Dans ce cas, on observe, dans le site de fixation de la protéine, un nickel en complexe avec une molécule similaire à l'EDTA, laquelle a de fortes chances d'être le métallophore physiologique, que nous avons tenté de caractériser. Nous abordons aussi des études cristallographiques préliminaires concernant NikR.

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc.

Aujourd'hui, la cristallographie de macromolécules produit couramment des modèles moléculaires à résolution atomique. Cependant, cette technique est particulièrement difficile à mettre en œuvre, dans le cas de complexes de taille importante. La microscopie électronique permet, elle, de visualiser des particules de grande taille, dans des conditions proches de celles in vivo. Cependant, la résolution des reconstructions tridimensionnelles obtenues exclut, en général, leur interprétation directe en termes de structures moléculaires, étape nécessaire à la compréhension des problèmes biologiques. Il est donc naturel d'essayer de combiner les informations fournies par ces deux techniques pour caractériser la structure des assemblages macromoléculaires. L'idée est de positionner les modèles moléculaires déterminés par cristallographie à l'intérieur de reconstructions 3D issues de la microscopie électronique, et de comparer la densité électronique associée à la reconstruction 3D avec une densité électronique calculée à partir des modèles. Le problème numérique réside dans la détermination et l'optimisation des variables qui spécifient les positions des modèles, considérés comme des corps rigides, à l'intérieur de l'assemblage. Cette idée simple a donné lieu au développement d'une méthode appelée recalage. Ce travail de thèse a eu pour but de fournir aux biologistes un outil, basé sur la méthode du recalage, qui leurs permette de construire des modèles pseudo-moléculaires associés aux assemblages produits par microscopie électronique. Le logiciel issu de ce travail, nommé VEDA est un environnement graphique convivial, intégrant la possibilité de recalage flexible, et un moteur de calcul performant (calcul rapide, traitement de symétries complexes, utilisation de grands volumes, ...). Testé sur des dizaines de cas réels, VEDA est aujourd'hui pleinement fonctionnel et est utilisé par un nombre croissant de chercheurs, en France et à l'étranger qui lui reconnaissent tous facilité d'utilisation, stabilité, rapidité et qualité des résultats.

Les premiers travaux relatifs aux combinaisons des métaux alcalins avec le silicium ou le germanium datent du milieu du siècle dernier. Sainte-Claire Delville (1857) (1), Winkler (1864) (2) puis Vigouroux (1869) (3) (4), qui entreprirent les premières recherches dans cette voie ne décelèrent en fait aucune réaction entre le silicium et le sodium. Moissan (1902) (5) (6), après avoir réalisé la synthèse d'un siliciure de lithium auquel il attribua la formule Li₆Si₂, montra que le silicium réagissait sous vide avec le sodium ou le potassium pour former de petites quantités de siliciures difficiles à séparer des produits de départ, et qu'il ne put identifier. Les premiers essais concernant les germaniures alcalins donnèrent en revanche des résultats beaucoup plus concluants. En 1930 Dennis et Skow (7) après avoir porté à 1000°C un mélange équimoléculaire de germanium et de sodium dans un creuset de fer isolèrent un germaniure de sodium correspondant à la formule NaGe...

Les cytochromes P450 (P450) et la NADPH-cytochrome P450 réductase (CPR) sont les principaux acteurs du métabolisme des xénobiotiques chez les mammifères. La CPR est une protéine multidomaine formée de deux domaines catalytiques comprenant les cofacteurs FAD et FMN et reliés par un domaine de connexion. Grâce aux propriétés rédox de ses deux flavines, la CPR est capable de scinder le flux diélectronique du NADPH en deux transferts monoélectroniques vers les P450. Jusqu'alors, la CPR avait toujours cristallisé dans une conformation dite fermée, compatible avec un transfert interne du FAD au FMN, mais dans laquelle le FMN était tellement enfouie au cœur de la protéine qu'un transfert externe vers les P450 était inenvisageable. Le projet de cette thèse consistait à construire et analyser les caractéristiques structurales et biochimiques de CPR chimères constituées de domaines issues des CPR humaine et de levure. Ces chimères sont toujours fonctionnelles vis-à-vis d'accepteurs artificiels et naturels. Leurss constantes catalytiques, la vitesse des différents transferts d'électrons internes et externes, les potentiels standards de leurs cofacteurs ou encore leur stabilité vis-à-vis d'agents dénturants ou de la température ont été mesurés et comparés aux caractéristiques des CPR parentales. De plus, la structure cristallographique de l'une d'elle a pu être déterminée à 2,5 Å de résolution et dans une nouvelle conformation dite ouverte. Celle-ci prouve le caractère dynamique de cette protéine multidomaine, et pourrait correspondre à la conformation de la CPR au sein du complexe bimoléculaire CPR-P450 lors du transfert externe entre le FMN et le cytochrome. Les facteurs pouvant influencer ou dicter ces changements conformationnels ont été appréhendés grâce à des analyses d'enzymologie, de cinétiques rapides, de potentiométrie ou encore de dénaturation.

Helicobacter pylori est une bactérie qui infecte l'estomac de la moitié de la population mondiale et est impliquée dans la plupart des maladies gastriques, dont les ulcères et le cancer de l'estomac. La bactérie produit deux toxines, CagA et Tipα, qui sont associées avec le développement du cancer. CagA est injectée dans les cellules et interagit avec de nombreuses protéines des voies de signalisation cellulaire. Tipα est secrétée et internalisée dans les cellules gastriques où elle induit la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans ce travail de thèse, nous avons tout d'abord étudié les interactions entre un domaine central de CagA et des protéines de H. pylori. Nous avons ensuite identifié de nouveaux fragments solubles de CagA par une méthodologie à ‘'haut-débit''. L'un d'eux, correspondant à l'extrémité C-terminale de la protéine de 33kDa, CagAC33, a été caractérisé par différentes techniques de biochimie et de biophysique. CagAC33 forme des dimères de dimères en solution et des particules en microscopie électronique. De plus, CagAC33 peut être phosphorylé in vitro par les kinases c-Src et c-Abl mais l'efficacité de la phosphorylation dépend de la kinase utilisée. L'étude de l'interaction entre la phosphatase SHP-2 et CagAC33 montre que CagA est dephosphorylée in vitro. Par ailleurs, les structures de deux formes cristallines de Tipα ont été déterminées par cristallographie aux rayons X. La structure du monomère de Tipα adopte un nouveau repliement, et la protéine forme des dimères différents dans les deux formes cristallines. L'étude de la protéine en solution indique qu'un des dimères est sans doute favorisé et suggère que les ponts disulfures identifiés en N-terminal ont un rôle durant la sécrétion de la protéine.