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Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A / Investigating functions of CENP-A N-tail in mitosisGoutte-Gattat, Damien 16 December 2011 (has links)
Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation. / The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event.
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Identification et caractérisation de HIRIP3 comme nouveau chaperon d'histone H2A / Identification and characterization of HIRIP3 as a novel histone H2A chaperoneIgnatyeva, Maria 31 May 2017 (has links)
Le génome des cellules eucaryotes est empaqueté dans la chromatine, dont l’établissement et la maintenance nécessitent des processus d’assemblage et de remodelage. Ce travail de thèse a été consacré à la caractérisation de deux facteurs de la machinerie d’assemblage de la chromatine. Le premier facteur étudié dans ce travail était HIRIP3, un homologue mammifère de la levure H2A.Z chaperon Chz1. Nous voulions vérifier si HIRIP3 est une chaperon d'histone par elle-même. Pour commencer, nous avons décrit l'interaction de HIRIP3 avec les histones in vivo. Ensuite, nous avons étudié la spécificité structurale de cette interaction in vitro. Nous avons caractérisé HIRIP3 comme une nouvelle chaperon d'histone H2A qui utilise le motif CHZ pour sa fonction. La deuxième partie de ce travail a été axée sur le complexe de remodelage de la chromatine SRCAP. Nous avons cherché à décoder son réseau d'interaction et à décrire ses sous-complexes. Nous avons reconstitué le complexe de base YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B et H2A.Z / H2B en utilisant le système d'expression chez baculovirus. Notre protocole nous a permis de purifier un complexe de base adapté aux futures études structurelles par microscopie cryo-électronique. / The genome of eukaryotic cells is packaged into chromatin, which establishment and maintenance require mechanisms of assembly and remodelling. This thesis work was dedicated to the characterization of two factors of chromatin assembly machinery. The first factor studied in this work was HIRIP3, a mammalian homologue of yeast H2A.Z chaperone Chz1. We aimed to test whether HIRIP3 is a histone chaperone by itself. At first, we established HIRIP3 interaction with histones in vivo. After then, we studied the structural specificity of this interaction in vitro. We have characterized HIRIP3 as a novel H2A histone chaperone that utilizes the CHZ motif for its function. The second part of this work was focused on SRCAP chromatin remodelling complex. We aimed to decipher its interaction network and to describe its sub-complexes. We have reconstituted YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B and H2A.Z/H2B core complex using baculovirus expression system. Our protocol allowed us to purify core complex suitable for future structural studies by cryo-electron microscopy.
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Caractérisation fonctionnelle de JMJ24, une déméthylase d’histone de la famille JUMONJI, chez Arabidopsis thaliana / Functional characterization of JMJ24, a histone demethylase of the JUMONJI family, in Arabidopsis thalianaAudonnet, Laure 26 February 2014 (has links)
Cette dernière décennie a vu augmenter le nombre d’études portant sur la caractérisation des protéines JUMONJI (JMJ) et montrant leur rôle prépondérant dans la régulation des gènes et le développement des organismes. Ces protéines sont capables de déméthyler certains résidus des queues des histones et ont été organisées en groupes phylogénétiques en fonction de la conservation de leur domaine catalytique. Pour chaque clade entre un et trois substrats spécifiques ont pu être identifiés. De la sous famille KDM3, dont le résidu cible est H3K9, seul un membre, IBM1, a été caractérisé chez Arabidopsis. Cette étude montre que la mutation de JMJ24, un autre membre de ce groupe, entraine une augmentation de la taille des racines, cotylédons et organes floraux, suggérant un rôle dans le contrôle du développement à différents stades. De plus, l’analyse de l’expression tissulaire indique que JMJ24 est exprimé dans le phloème, en cohérence avec l’effet pléiotropique de sa mutation. Enfin, nos données suggèrent une interaction entre JMJ24 et d’autres protéines JMJ, telles JMJ14 et IBM1, mais aussi une interaction avec les protéines DCL, impliquées dans la régulation des gènes et des éléments transposables. / Numerous studies over the last decade have reported the characterization of the JUMONJI (JMJ) proteins, showing their critical importance in regulating genes and organism’s development. These proteins are able to demethylate a subset of histone tail residues and were clustered into distinct groups using a phylogenetic analysis based on their catalytic domain conservation. Furthermore, modification of one to three specific residues has been attributed to each JMJ group. Within the KDM3 subfamily, of which target is the H3K9 residue, only one member, IBM1, was first characterized in Arabidopsis. In this report, we showed that the mutation of JMJ24, another member of this subfamily, resulted in an increase of the root length, cotyledon and floral organ size, suggesting that JMJ24 functions is needed at different developmental stage. In addition, the analysis of the tissue-specific expression of JMJ24 indicated that the gene is expressed within the phloem of all organs, correlating with the pleiotropic effect of the gene mutation. Last, our data also suggested that JMJ24 interacts with other JMJ protein like JMJ14 and IBM1, but also with the DCL proteins knowing to be involved in genes and transposable elements regulation.
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Modifications de la chromatine associ��es �� la s��nescence cellulaireContrepois, K��vin 03 July 2012 (has links) (PDF)
La s��nescence cellulaire est une r��ponse �� un stress des cellules de mammif��re caract��ris��e par un arr��t durable du cycle cellulaire. Celle-ci peut ��tre d��clench��e par un dysfonctionnement des t��lom��res, des stress g��notoxiques et l'activation d'oncog��nes. La s��nescence constitue une puissante ligne de d��fense contre le d��veloppement de cancers et intervient aussi dans le vieillissement. Les cellules en s��nescence r��organisent leur g��nome par l'assemblage en h��t��rochromatine sous forme de SAHFs (senescence-associated heterochromatin foci). Nous avons mis en ��vidence que la d��sac��tylation globale de H4-K16Ac par la d��sac��tylase SIRT2 est impliqu��e dans l'assemblage de l'h��t��rochromatine en s��nescence. De plus, nous avons identifi�� une accumulation de variants d'histones H2A et H2B sp��cifiquement dans des cellules en s��nescence pr��sentant des dommages persistants �� l'ADN. Ces variants d'histone pourraient avoir des fonctions sp��cifiques dans ces cellules et pourraient repr��senter un biomarqueur du vieillissement in vivo.Mes travaux apportent des ��l��ments pour la compr��hension des r��les de l'information ��pig��n��tique dans la s��nescence cellulaire.
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Etude structurale et fonctionnelle de la variante d'histone H2AZObri, Arnaud 20 September 2012 (has links) (PDF)
La variante d'histone H2AZ joue un rôle important dans l'activation de la transcription, la prolifération cellulaire, le développement et la différentiation. H2AZ orne les promoteurs de la majorité des gènes, mais les mécanismes de bases de cette localisation sont inconnus. La compréhension de l'assemblage et du désassemblage du nucléosome passe par la caractérisation de la dynamique du nucléosome et des chaperonnes d'histones. L'objectif de ma thèse était d'identifier des chaperonnes spécifiques impliqués dans la dynamique de H2AZ en utilisant une approche de protéomique. Pour élucider les mécanismes de déposition/éviction de H2AZ, j'ai purifié le complexe prénucléosomale de H2AZ et j'ai caractérisé toutes les protéines associées. J'ai trouvé que Anp32e fait partie du complexe p400/TIP60 qui est présumée pour être responsable de l'échange d'H2AZ sur la chromatine. Anp32e présente une spécificité pour le dimère H2AZ-H2B, car il n'interagit pas avec le dimère H2A-H2B. L'interaction est accomplie au niveau d'une petite région dans le domaine d'ancrage sur H2AZ et au niveau d'un nouveau domaine ZID sur Anp32e. Finalement, j'ai montré que la suppression d'Anp32e entraine : un défaut dans la dé-répression des gènes dont l'expression est contrôlée par une hormone et une accumulation sur les promoteurs de ces derniers. Dans l'ensemble ces résultats identifient Anp32e comme une nouvelle chaperonne de la variante d'histoneH2AZ impliquée dans l'éviction de H2AZ chez les mammifères.
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Dynamique à l'équilibre et hors d'équilibre de la chromatine visualisée par microscopie de force atomique : effet des variants d'histones et des facteurs de remodelageMontel, Fabien 24 October 2008 (has links) (PDF)
L'organisation de l'ADN sous forme de nucléosome interfère avec différents processus cellulaires. La cellule recrute des facteurs de remodelage et des variants d'histones pour surmonter cette barrière physique. Dans ce travail, nous utilisons la Microscopie à Force Atomique pour visualiser des mono- et des oligo- nucléosomes à l'équilibre et hors-équilibre.<br />Nous montrons que le variant H2A.Bbd modifie la structure et la dynamique du mono-nucléosome et que sa présence altère la faculté de la chromatine à former une structure d'ordre supérieur. En utilisant un modèle physique nous expliquons quantitativement ce comportement par la flexibilité du mono-nucléosome.<br />Nous étudions ensuite le mécanisme du remodelage de mono-nucléosomes par SWI/SNF et RSC. Nous mettons en évidence un intermédiaire réactionnel sous la forme d'un nucléosome sur-complexé apparaissant avant le nucléosome glissé. Enfin au niveau des di-nucléosomes nous montrons que RSC est un ‘randomiseur' processif et séquentiel.
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Variants d'histones H2BFWT et macroH2A1: de la structure à la fonction épigénétiqueBoulard, Matthieu 26 October 2007 (has links) (PDF)
Les eucaryotes expriment des variants d'histones non-alléliques en faible quantité en plus des histones conventionnels. De récentes données ont montré que ces variants d'histones sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires dont la réparation de l'ADN, la ségrégation des chromosomes ou encore le contrôle de la transcription. L'objectif de cette étude est d'améliorer la compréhension du rôle biologique des variants d'histones. Les travaux rapportés dans ce manuscrit abordent plus spécifiquement la fonction de deux variants: H2BFWT, qui joue un rôle dans la spermatogenèse chez l'homme; et macroH2A1 qui semble impliqué dans la répression transcriptionnelle.<br />Nous avons montré que malgré sa grande divergence avec H2B, l'incorporation de H2BFWT ne modifie pas la structure globale du nucléosome. Néanmoins, contrairement à l'histone somatique H2B, H2BFWT n'a pas la capacité de recruter les facteurs d'assemblage du chromosome et n'est pas requis pour la condensation du chromosome mitotique. Cette différence de comportement vis-à-vis de l'assemblage des chromosomes suggère que H2BFWT pourrait être impliqué dans l'architecture de structure d'ordre supérieur de la chromatine.<br />Dans le but d'élucider le rôle biologique de macroH2A1 in vivo, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour macroH2A1.<br />Malgré l'abondance des investigations portant sur macroH2A1, sa fonction reste inconnue. MacroH2A1 a la particularité d'être trois fois plus grand que H2A, il comporte ainsi une extension C-terminale de fonction inconnue. Initialement macroH2A1 avait été décrit comme principalement localisé sur le chromosome X inactif. La signification biologique de cet enrichissement n'est pas comprise. In vitro, la présence de macroH2A1 interfère avec la transcription. De récentes études ont montré que certaines séquences d'ADN méthylées, incluant les gènes soumis à l'empreinte et les rétrotransposons sont enrichies en nucléosomes contenant macroH2A1. Il a également été démontré que c'est la méthylation de l'ADN, nécessaire pour la répression transcriptionnelle, qui permet le recrutement de macroH2A1 sur les rétrotransposons. Nous émettons l'hypothèse que la méthylation de l'ADN aboutirait à la répression des rétrotransposons via le recrutement de macroH2A1.<br />L'étude du phénotype des souris déficientes en macroH2A1 permet de conclure que contrairement au consensus actuel, macroH2A1 n'est pas nécessaire pour réprimer la transcription des séquences répétées incluant les rétrotransposons.<br />Les examens anatomopathologiques suggèrent que macroH2A1 pourrait être impliqué dans la régulation du métabolisme des acides gras.
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Caractérisation fonctionnelle de JMJ24, une déméthylase d'histone de la famille JUMONJI, chez Arabidopsis thalianaAudonnet, Laure 26 February 2014 (has links) (PDF)
Cette dernière décennie a vu augmenter le nombre d'études portant sur la caractérisation des protéines JUMONJI (JMJ) et montrant leur rôle prépondérant dans la régulation des gènes et le développement des organismes. Ces protéines sont capables de déméthyler certains résidus des queues des histones et ont été organisées en groupes phylogénétiques en fonction de la conservation de leur domaine catalytique. Pour chaque clade entre un et trois substrats spécifiques ont pu être identifiés. De la sous famille KDM3, dont le résidu cible est H3K9, seul un membre, IBM1, a été caractérisé chez Arabidopsis. Cette étude montre que la mutation de JMJ24, un autre membre de ce groupe, entraine une augmentation de la taille des racines, cotylédons et organes floraux, suggérant un rôle dans le contrôle du développement à différents stades. De plus, l'analyse de l'expression tissulaire indique que JMJ24 est exprimé dans le phloème, en cohérence avec l'effet pléiotropique de sa mutation. Enfin, nos données suggèrent une interaction entre JMJ24 et d'autres protéines JMJ, telles JMJ14 et IBM1, mais aussi une interaction avec les protéines DCL, impliquées dans la régulation des gènes et des éléments transposables.
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Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-AGoutte-gattat, Damien 16 December 2011 (has links) (PDF)
Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation.
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Fonctions des extrémités flexibles de l’ADN du nucléosome CENP-A dans l'organisation de la chromatine centromérique / Function of the flexible DNA ends of CENP-A nucleosome in the organisation of centromeric chromatinRoulland, Yohan 01 March 2016 (has links)
CENP-A est le variant d’histone qui remplace spécifiquement l’histone H3 au niveau des centromères et confère ses propriétés uniques à la chromatine centromérique. La cristallographie aux rayon X, ainsi que la digestion à la MNase des nucléosomes contenant CENP-A suggèrent une flexibilité de l’ADN entrant et sortant de ce nucléosome. Néanmoins ces déductions restent aujourd’hui au stade hypothétique, en particulier, rien n’est connu sur le rôle éventuelle de cette particularité dans la fonction du nucléosome CENP-A. L’utilisation de la cryo-électromicroscopie nous a permis de déterminer les caractéristiques de la dynamique de l’ADN sortant du nucléosome CENP-A. Nos analyses biochimiques, de protéomiques et de pseudo-génétiques révèlent que la flexibilité élevée de l’ADN du nucléosome CENP-A ne permet pas l’interaction avec l’histone de liaison H1. In vitro, remplacer les 2 tours de l’hélice aN de CENP-A avec les 3 tours de l’hélice aN de H3 permet de restaurer l’interaction de l’histone H1. In vivo, le replacement des nucléosomes CENP-A par des nucléosomes contenant ce même nucléosome hybride aN-CENP-A permet également le recrutement de H1, mais cela conduit également à la délocalisation d’un certain nombre de protéines du kinétochore. Ce kinétochore ne permet pas une ségrégation correcte des chromosomes et il conduit à des phases de mitose et de cytokinèse défectueuses. L’ensemble de ces données montre que la conservation au cours de l’évolution de la flexibilité de l’ADN dans le nucléosome CENP-A est essentielle pour l’accomplissement de la division cellulaire. / CENP-A is a histone variant, which replaces histone H3 at centromeres and confers unique properties to centromeric chromatin. The crystal structure and MNase digestion of CENP-A nucleosome suggests flexible nucleosomal DNA ends but their dynamics in solution remains elusive and their implication in centromere function is unknown. Using electron cryo-microscopy we determined the dynamic solution properties of the CENP-A nucleosome. Our biochemical, proteomic and genetic data reveal that the high flexibility of the DNA ends impairs histone H1 binding to the CENP-A nucleosome. Substituting the 2-turn aN-helix of CENP-A with the 3-turn N-helix of H3 results in particles able to bind histone H1. In vivo replacement of CENP-A nucleosomes with the same NH3-CENP-A hybrid nucleosomes leads to H1 recruitment, delocalization of kinetochore proteins and significant mitotic and cytokinesis defects. Put together, ourdata reveal that the evolutionarily conserved flexible ends of the CENP-A nucleosomes are essential to ensure the fidelity of the mitotic pathway.
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