Les maladies infectieuses dues aux bactéries Gram + sont causes de mortalité importante à travers le monde, et de récentes études ont mis en évidence le rôle pathologique de l’interféron de type I (I IFN) dans ces maladies. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) produisent des quantités importantes d’IFN de type I suite à la détection de virus. Des données récentes suggèrent que les pDC humaines pourraient également détecter des bactéries, mais les récepteurs impliqués restent inconnus. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé l’expression des récepteurs TLR2 / 1 par les pDC. Ces deux récepteurs permettent aux pDC de détecter les lipoprotéines bactériennes. Je montre que les pDC répondent aux bactéries Gram + (M. tuberculosis, S. aureus et L. monocytogenes) par la voie TLR2 / 1. Mon travail a montré que les pDC primaires humaines expriment TLR1 et TLR2 à la fois au niveau de l'ARNm et au niveau protéique. En réponse aux lipoprotéines bactériennes, la régulation des molécules costimulatrices par les pDCs est TLR1-dépendante tandis que la sécrétion d’I-IFN est TLR2-dépendante. De plus, TLR2 et TLR1 jouent des rôles distincts au cours du priming des cellules T CD4+ naïves par les pDCs, induisant une prolifération et différentiation en sous-populations Th1 / Th2 / Treg. Je démontre en outre que ces différences reposent sur les voies de signalisation distinctes de ces deux TLR. Ce travail de thèse pose ainsi les bases pour l’exploration du rôle des pDC dans les infections bactériennes humaines. / Infections by Gram+ bacteria are worldwide life-threatening diseases where new studies are highlighting the pathological role of Type I interferon (I IFN). Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are the main source of Type I IFN following viral sensing. Recent evidence suggests that human pDCs might sense bacteria. The receptors mediating bacterial sensing in pDCs are not known. During my thesis, I focused on the characterization of pDCs TLR2/1 receptors expression. These two receptors allow pDCs to sense Gram+ bacterial lipoproteins. My work showed that human primary pDCs express TLR1 and TLR2 at the mRNA and protein level. I show that pDCs respond to the Gram+ bacteria M. tuberculosis, S. aureus and L. monocytogenes through TLR2/1 pathway. In human primary pDC, I found that in response to bacterial lipoproteins up-regulation of costimulatory molecules is TLR1-dependent while IFN-I secretion is TLR2-dependent. TLR2 and TLR1 signalling play a different role in the pDCs priming of naïve CD4+ T-cells, inducing proliferation and differentiation to TH1/TH2/Treg subsets. I further demonstrate that these differences rely on the diverse signaling pathway activated by the two TLRs. This work provides the rationale to explore pDCs activity in human bacterial infection.

La modélisation multi-échelle des procédés de solidification présente un grand intérêt pour les industries. Toutefois, il est difficile de coupler les phénomènes prenant place à de multiples échelles pour obtenir des simulations quantitatives à grande échelle. Ceci est réalisé en combinant trois méthodes : les éléments finis (FE), un automate cellulaire (CA) et la méthode Parabolic Thick Needle(PTN). La méthode FE permet une résolution des équations de conservation écrites pour des quantités moyennées, ce qui est adapté aux calculs de grands domaines. Elle permet la description macroscopique des transferts de chaleur et de masse. De plus, la méthode CA permet de suivre le développement de l’enveloppe de chaque grain dendritique à une échelle mésoscopique. Le couplage de ces deux méthodes est le modèle CAFE et il a démontré son efficacité pour simuler quantitativement la solidification et notamment la transition colonnaire - équiaxe. Le Dendritic Needle Network (DNN) est une méthode mésoscopique introduite récemment. Celle-ci s’appuie sur la conservation de la masse de soluté à proximité des pointes dendritiques pour calculer avec précision leur cinétique de croissance. Comme cette méthode repose sur l’estimation directe du gradient de composition à l’interface solide/liquide, le régime de croissance n’est plus supposé stationnaire. Nous introduisons la méthode Parabolic Thick Needle PTN reprenant la méthode de croissance du DNN pour une pointe. Elle est implémentée avec une méthode des éléments finis pour résoudre le flux de soluté est largement validé par rapport aux résultats analytiques provenant de la solution d’Ivantsov. Le couplage du CAFE avec la cinétique de croissance provenant du PTN permet d’obtenir un modèle unique de solidification s’appuyant sur 3 échelles. La grille CA gère à la fois la forme des enveloppes des grains et les mécanismes de ramification. Le maillage FE est utilisé pour résoudre les problèmes de flux et de conservation de masse et d’énergie à la fois à l’échelle de la couche de soluté de la pointe et à l’échelle du domaine simulé. Ceci est rendu possible grâce à une stratégie de remaillage anisotrope multi-critères. Diverses simulations démontrent les capacités du modèle. Les pistes d’amélioration sont développées pour espérer, à terme, une simulation 3D d’expériences de laboratoire. / Multiscale modelling of solidification processes is of great interest for industries. However coupling the multiple scale phenomena to reach quantitative large simulations is challenging. This is achieved using a combination of three methods : the Finite Element (FE), the Cellular Automaton (CA) and the Parabolic Thick Needle (PTN). The FE method provides a solution of the conservation equations, written for volume average quantities, that is suitable for large domain size computations. It serves for macroscopic description of heat and mass transfers. Additionally, the CA method tracks the development of the envelope of each individual dendritic grain at a mesoscopic scale. The coupling of these two methods is the CAFE model and was demonstrated to provide efficient and quantitative simulations of the columnar-to-equiaxed transition for instance. The Dendritic Needle Network (DNN) is another mesoscopic method recently introduced. It uses solute mass balance considerations in the vicinity of the tip of the dendrites to compute accurately the growth kinetics. Because it relies on adirect estimation of the composition gradient at the solid-liquid interface, steady state growth regime is no longer assumed. We introduce the Parabolic Thick Needle (PTN) method inspired from the DNN’s computed growth idea for one dendritetip. Its implementation with a FE method to solve the solute flow is extensively validated against analytical results given by the Ivantsov solution. Coupling CAFE with PTN computed growth kinetics provides a unique solidification model. The CA grid handles both the shape of the grain envelopes and branching mechanisms. The FE mesh is used to solve flux and conservation of mass and energy at both the scale of the dendrite tip solute layer and the domain dimensions. It is possible thanks to adaptive remeshing strategies. Various simulations demonstrate the capabilities of the model. The improvement areas are being developed in order to hope, in the long term, for 3D simulation laboratory experiments.

Les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle prépondérant dans le contrôle de l’infection par le VIH suggérant ainsi qu’un vaccin efficace doit induire une réponse cellulaire T CD8+ robuste et durable.En fournissant une source antigénique importante qui fait défaut chez les patients répondeurs aux poly-chimiothérapies antirétrovirales, la vaccination thérapeutique pourrait favoriser ce type de réponse cellulaire, non restaurée par les seuls traitements antirétroviraux. Les cellules dendritiques (DC) autologues, qu’elles soient chargées en virus inactivé, en peptides viraux ou en ARN messagers (ARNm) sont capables d’induire des réponses robustes des cellules T CD8+ contre les antigènes du VIH, faisant de bons candidats vaccins thérapeutiques.Dans ce projet, nous avons étudié l’efficacité d’une vaccination thérapeutique basée sur l’injection de DC autologues transfectées ex vivo avec des ARNm codant les protéines du VIH (projet initié en collaboration avec Guido Vanham, Institute of Tropical Medicine, Anvers). La composante antigénique du vaccin est fournie par les séquences virales endogènes du patient; ainsi nous espérons adapter la spécificité de la réponse immunitaire aux virus autologues. Nous travaillons avec le Macaque cynomolgus comme modèle animal d’infection par les virus d’immunodéficience (SIV), modèle pertinent dans l’approfondissement des connaissances en pathogénèse et en développement vaccinal, notamment pour tester l’innocuité et l’efficacité des vaccins basés sur l’utilisation des DC. La mise au point un système de culture de DC basé sur la prolifération puis la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques CD34+, qui nous a permis de générer in vitro des DC matures en nombre suffisant pour la vaccination (au moins 10.106).Nous avons caractérisé ces DC phénotypiquement, avec une attention particulière vis-à-vis de l’expression de lectines de type C et d’autres récepteurs DC-spécifiques. Nous avons mis en évidence que l’état d’activation des DC définit le niveau d’expression de ces molécules. Ces récepteurs membranaires sont impliqués dans la capture et la présentation des antigènes aux effecteurs, ainsi que dans l’orientation de la réponse immune. Le phénotype des DC générées in vitro a été comparé au phénotype de plusieurs population de cellules présentatrices d’antigène présentes in vivo chez le macaque.La transfection avec des ARNm par électroporation est un moyen sûr et efficace de charger les DC en antigènes. Nous avons étudié dans un premier temps l’immunogénicité du vaccin chez des macaques sains. Les résultats montrent qu’une réponse cellulaire de type Th1 (IFN-gamma et interleukine-2) spécifique à Gag est induite dès la première injection et peut être renforcée après les injections suivantes. Nous avons également mis en évidence l’induction de lymphocytes T CD8+ capables de sécréter en réponse à Gag plusieurs de ces cytokines, IFNg, IL2, TNFa, la chimiokine MIP1b, ou encore le marqueur de dégranulation cytotoxique CD107a. En revanche, aucune sécrétion de cytokine de type 2 ni de réponse anticorps spécifique de Gag n'a pu être mise en évidence.La seconde partie de notre projet a consisté en l’étude d’une stratégie de vaccination par ciblage des DC in vivo avec des protéines de fusion DC-spécifiques associées à des antigènes. Ce travail a été mené en collaboration avec le Baylor Insitute for Immunology Research (BIIR) à Dallas. Nous avons tout d’abord sélectionné les meilleurs clones d’Ac spécifiques de molécules humaines pour leur réactivité croisée avec les molécules du macaque cynomolgus. L’immunogénicité de protéines de fusion (dirigées contre LOX-1 et DC-ASGPR couplées à Gag du VIH ou HA1 de Influenza), a ensuite été évaluée in vivo chez le macaque. Ces travaux ont confirmé in vivo que l’induction de différents profils de réponses immunitaires Ag-spécifiques (Th1 et IL10) est possible par ciblage in vivo des DC avec des protéines de fusion dirigées contre différentes molécules (LOX-1 et DC-ASGPR). / Current treatments against HIV infection would benefit from the development of complementary immunotherapeutic strategies. Dendritic cells (DC) play a major role in the induction of immune responses. In this thesis, we examine the use of the DC in therapeutic vaccination. Ex vivo loading of DC with messenger RNA encoding viral proteins and in vivo loading of DC by targeting antigen to DC-specific endocytic receptors are two strategies evaluated in healthy macaque.

La compréhension des mécanismes immunologiques précoces mis en place suite à l’administration de vaccins est encore de nos jours largement méconnue. Pourtant de plus en plus d’études démontrent l’importance de ces mécanismes très précoces faisant intervenir les acteurs de l’immunité innée dans la génération d’une réponse spécifique efficace après vaccination. La peau est un organe intéressant pour l'administration de vaccins du fait de sa richesse en cellules présentatrices d'antigènes (APC), qui sont des cellules essentielles dans la mise en place de la réponse immunitaire. L'administration par voie intradermique du vaccin ADN de type auxoGTU induit des réponses immunitaires fortes et persistantes, en particulier en association avec une électroporation (EP) locale chez le macaque cynomolgus. Le but de ce travail de thèse fut de caractériser les réponses immunitaires locales précocement mises en place suite à l’administration par voie intradermique du vaccin ADN auxo-GTU en association avec une EP. Dans un premier temps, nous avons décrit les populations de cellules immunitaires présentes dans la peau normale chez le macaque cynomolgus.L'épiderme contient des cellules de Langerhans (LC) qui sont : CD1a+ CD1c- et des lymphocytes T caractérisés par l’expression du CD3. Le derme contient des cellules CD1a+CD1c-, qui présentent des similitudes avec les LC et correspondent donc probablement à des LC en migration à travers le derme. Il contient également des cellules dendritiques dermales (DDC) CD1a+CD1c+, des macrophages résidants CD163highCD11b+ et les lymphocytes T CD3+. Chez certains animaux, nous avons mis en évidence la présence de granulocytes CD66+ dans le derme sain. Les populations de cellules immunitaires identifiées chez le macaque sont similaires à celles identifiées chez l’homme malgré de légères différences phénotypiques. Cette caractérisation nous a ensuite permis d'étudier l’impact de la vaccination sur les populations immunitaires de la peau.Nous avons démontré que la vaccination induit le recrutement de granulocytes et de monocytes/macrophages inflammatoires dans l'épiderme et dans le derme, ainsi qu’un recrutement plus tardif de cellules dendritiques inflammatoires épithéliales (IDEC) dans l'épiderme. Dans l'épiderme, 24h après immunisation, nous avons observé une augmentation transitoire des LC accompagnée d’une surexpression de HLA-DR, de CD86 et de CD83, ce qui démontre leur maturation. Entre 24h et 72h, le nombre de LC diminue, ce qui suggère que les LC matures quittent l’épiderme pour migrer vers les nœuds lymphatiques. Ces événements cellulaires sont majoritairement dus à l’EP, indépendamment de la présence du vaccin à ADN. L’analyse du microenvironnement mis en place dans la peau suite à la vaccination révèle une libération de facteurs solubles pro-inflammatoires, comme MCP-1, IL-18 , IL-15, IL-8 et de facteurs solubles anti- inflammatoires comme IL-1RA et sCD40L dès 24h, dont certains sont considérablement augmentés par la présence de l’ADN vaccinal. Nos résultats suggèrent que l’EP, indépendamment de la présence de l'ADN, est suffisante pour induire la mobilisation des cellules et la maturation des DC au niveau du site de vaccination, ce qui montre un important rôle adjuvant de l’EP. Cependant, il semble que l'ADN soit nécessaire pour générer un microenvironnement favorable à l'activation optimale des APC. Ce travail fournit des éléments importants sur les mécanismes de l'inflammation locale et ouvre de nouvelles possibilités pour les stratégies vaccinales. / Mechanisms involved in early vaccine response are poorly understood. However, more and more studies show the importance of innate immunity in the very early times following vaccine administration in the generation of an optimal specific immune response. Skin is an interesting target for vaccine delivery because of its richness in antigen presenting cells (APC) which are essential cells in immune responses. The intradermal delivery of auxoGTU DNA vaccine was shown to induce strong and persistent immune responses, especially in association with electroporation in cynomolgus macaque. The aim of this work was to characterize the early local immune responses followed intradermal auxoGTU DNA vaccination in association with EP in cynomolgus macaque. In a first step, we have described immune cell populations present in the normal skin in the cynomolgus macaques. The epidermis contains CD1a+CD1c- Langerhans cells (LCs), and CD3+ T cells. The dermis contains CD1a+CD1c- cells, which present similarities with LCs and probably correspond to LC in migration through dermis. It also contains CD1a+CD1c+ dermal dendritic cells (DDCs), CD163highCD11b+ resident macrophages, and CD3+ T cells. We found CD66+ polymorphonuclear cells in healthy dermis in some of the animals. Immune cell populations in the macaque are similar to those in humans despite moderate differences in phenotype. This characterization has allowed us to study the impact of vaccination on immune populations of the skin. We have demonstrated a recruitment of granulocytes and inflammatory monocytes/macrophages in epidermis and dermis, as well as a population of inflammatory dendritic epithelial cell (IDEC) in epidermis after vaccination. In epidermis, 24h after treatment, we have observed an initial increase of LC with an up-regulation of HLA-DR, CD86 and CD83, demonstrating their maturation. Between 24h and 72h, LC number decreased, suggesting that mature LC has leaved epidermis to migrate to skin draining lymph node. All these cellular events were almost due to EP process, independently of DNA vaccine presence. The skin microenvironment reveals a release of pro-inflammatory soluble factors, as MCP-1, IL-18, IL-15, IL-8 and anti-inflammatory mediators as IL-1RA and sCD40L by 24h, all considerably enhanced in the presence of DNA.Our results suggest that EP, independently of the presence of DNA, is sufficient to induce cells mobilization and DC maturation at the vaccinated site, suggesting an important adjuvant effect of EP. However, it seems that DNA is required to generate a favorable microenvironment essential for correct APC activation. This work provides important clues to local inflammation mechanisms and opens up new possibilities for vaccine strategies.

L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase qui est synthétisée principalementpar les cellules endothéliales des vaisseaux. Initialement découvert dans le compartiment vasculaire où sa fonctionprincipale est de participer à la fibrinolyse, le tPA est aussi exprimé dans le parenchyme cérébral par plusieurstypes cellulaires comme les neurones ou les oligodendrocytes. Le tPA est impliqué dans de nombreuses fonctionscérébrales comme la plasticité synaptique ou encore la potentialisation glutamatergique. Le tPA est aussi un acteurclé de la neuroinflammation. Il active la microglie et participe à l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique pardes effets de type cytokine et via son domaine protéase en générant de la plasmine à partir du plasminogène. Uneactivité plus importante du tPA est retrouvée dans le liquide céphalorachidien des patients atteints de sclérose enplaques (SEP). De plus, le tPA possède des aspects délétères dans son modèle murin, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Dans le but de mieux comprendre le rôle du tPA dans la physiopathologie de l’EAE,nous nous sommes intéressés à son implication dans la réponse immunitaire pendant la maladie. Nos donnéesmontrent que les animaux tPA-/- ont des scores cliniques moins importants que les animaux WT pendant une EAE.Les nombres absolus de LT CD4+, de microglie activée et de macrophages infiltrés, ainsi que de cellulesdendritiques sont moins importants dans le parenchyme spinal des animaux tPA-/- en comparaison avec lesanimaux WT. En lien avec ces observations in vivo, le tPA augmente in vitro l’activation et la prolifération des LTainsi que la sécrétion d’IL-6 par un mécanisme dépendant du domaine protéase et de la génération de plasmine.Dans des expériences in vitro en collaboration avec l’équipe du Dr Diego Clemente, le tPA induit l’augmentation del’expression des molécules du CMH de classe II et des molécules de costimulation à la surface des cellulesdendritiques et des macrophages par un effet de type cytokine, suggérant une capacité plus importante pour cescellules à présenter des antigènes en présence de tPA. Notre étude apporte une meilleure compréhension du rôledu tPA dans la réponse immunitaire pendant l’EAE et ouvre de nouvelles perspectives dans l’étude de l’axe tPA/plasmine dans la physiopathologie de la maladie. / Tissue plasminogen activator (tPA) is a serine protease, mainly synthesized by endothelial cells of vessels.Initially discovered in the vascular compartment where its main function is to participate to fibrinolysis, tPA is alsopresent in the cerebral parenchyma, and expressed by several cell types like neurons or oligodendrocytes. tPA isinvolved in many physiological brain functions such as synaptic plasticity or glutamatergic potentiation. tPA is alsoa main actor of neuroinflammation. It activates microglia and participates in the opening of the blood-brain barrier(BBB) by cytokine-like effects and via its protease domain and plasmin generation from plasminogen. Interestingly,tPA activity is more important in cerebrospinal fluid of multiple sclerosis (MS) patients. In addition, tPA revealsdeleterious aspects in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the mouse model of MS. In order tobetter understand the role of tPA in EAE physiopathology, we focused on its involvement in the immune responseduring disease. tPA-/- EAE animals present less severe clinical scores than WT animals. Our results indicate alsothat absolute numbers of CD4 + T cells, activated microglia and infiltrated macrophages, as well as dendritic cellsare less important in the spinal parenchyma of tPA-/-. In connection with these in vivo observations, our in vitro datashow that tPA increases activation and proliferation of T cells, as well as IL-6 secretion by a protease-dependentmechanism and plasmin generation. In experiments in collaboration with Dr Diego Clemente's team, our data showthat tPA increases the expression of MHC class II and costimulatory molecules on the surface of dendritic cells andmacrophages in vitro by a cytokine-like effect, suggesting a more important ability for these cells to present antigenswith tPA. Our study provides a better understanding of the role of tPA in immune response during EAE, and opensup new perspectives in the study of the tPA / plasmin axis in the physiopathology of the disease.

Les épines dendritiques sont de petites protrusions post-synaptiques présentant des changements morphologiques corrélés avec la plasticité synaptique. Elles ont pour origine les filopodes dendritiques qui s’élargissent lors du contact avec l’axone. Ces changements morphologiques impliquent une grande variété de molécules dont des protéines associées à l’actine et des protéines d’adhésion. Cependant, comment ces différentes protéines sont coordonnées dans le temps et l’espace est encore largement méconnu. De plus, les techniques de microscopie conventionnelle ne permettent pas d’étudier l’organisation et la dynamique de ces protéines dans les épines dont la taille est proche de la limite de resolution. L’objectif de ma thèse a donc été d’explorer le rôle des protéines associées à l’actine ainsi que celui des protéines d’adhésion N-cadhérines dans l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine des épines dendritiques. Dans une première étude, nous avons suivi la motilité des filopodes et épines dendritiques de neurones en visualisant l’actine-GFP. Nous avons couplé cette approche avec : 1) une technique de piégeage optique de microsphères recouvertes de N-cadhérines ou des substrats micro-imprimés également recouverts de N-cadhérines afin de contrôler temporellement et spatialement les adhésions cadhérine-cadhérine, 2) la stimulation pharmacologique de la myosine II afin d’induire la contraction F-actine/myosine et 3) l’expression de mutants de N-cadhérine non adhésifs. Nous avons ainsi démontré que la stabilisation des filopodes en épines était dépendante de l’engagement d’un embrayage moléculaire entre les adhésions trans-synaptiques N-cadhérine et le flux rétrograde d’actine généré par les myosines II. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la microscopie super-résolutive (PALM et dSTORM) et le suivi de protéines individuelles (sptPALM) pour étudier l’organisation et la dynamique à l’échelle nanométrique des protéines à l’origine des réseaux d’actine branchés dans les épines. Ainsi, nous avons caractérisé la localisation et la dynamique de l’actine, du complexe Arp2/3, du complexe WAVE, d’IRSp53, de VASP et de Rac-1. Nous avons montré que, contrairement aux structures motiles classiques comme lamellipode, le réseau d’actine branché dans les épines n’ést pas formé aux extrémités protrusives puis incorporé dans un flux rétrograde d’actine. Ce réseau est initié à la PSD puis croît vers l’extérieur afin de générer les protrusions membranaires responsablent des changements morphologiques de l’épine. Nos résultats montrent également qu’un contrôle strict de l’activité de Rac-1 est nécessaire au maintien de la morphologie des épines dendritiques et de l’architecture du réseau d’actine branché. L’ensemble de mon travail souligne l’importance du rôle de l’organisation à l’échelle nanométrique du réseau d’actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique et la formation des épines dendritiques. Ces résultats pourraient avoir un rôle important dans la compréhension des changements morphologiques lors de la plasticité synaptique. / Dendritic spines are tiny post-synaptic protrusions exhibiting changes in morphology correlated with synaptic plasticity. They originate from motile dendritic filopodia, which enlarge after contacting axons. These morphological changes involve a wide number of molecular actors, including actin-binding proteins, and adhesion molecules. However, how these various molecular components are coordinated temporally and spatially to tune changes in spine shape remains unclear. Furthermore, conventional photonic microscopy techniques could not achieved the spatial resolution required to study the dynamic nanoscale organization of these proteins within the micron size dendritic spines. The objective of my Ph.D. was to unravel how actin-binding proteins and N-cadherin adhesion regulate the organization and dynamics of F-actin network in dendritic spines. In a first study, we measured the motility of dendritic filopodia and spines by time lapse imaging of actin-GFP in primary hippocampal neurons. We combined those measurements with: 1) manipulation of N-cadherin coated beads with optical tweezers, or micropatterns to control the timing and location of nascent N-cadherin adhesions, 2) pharmacological stimulation of myosin II to trigger contraction of the F-actin/myosin network and 3) expression of non-adhesive N-cadherin mutants to compete for the interaction between N-cadherin adhesion and F-actin. Using these different approaches we demonstrated that the stabilization of dendritic filopodia into mature spines was dependent on the engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the myosin driven F-actin flow. In a second study, we used super resolution microscopy (PALM and dSTORM) and single protein tracking (sptPALM) to study the dynamic nanoscale organizations of branched actin networks within dendritic spines. Using these technics, we characterized within dendritic spines, the localization and dynamics of actin, Arp2/3 complex, WAVE complex, IRSp53, VASP and Rac-1. We established that, opposite to classical motile structures such as the lamellipodium, branched F-actin networks in dendritic spines are not formed at the tip of membrane protrusions and incorporated in a retrograde flow. On the contrary, they are growing outwards from the PSD generating membrane protrusions responsible for spine motility. We also show that a thigh control of Rac1 activity is required to maintain dendritic spine morphology and branched actin network organization. Altogether, these studies point out the role of the nanoscale functional organization of F-actin networks and its linkage to adhesion proteins in the regulation of dendritic spine formation and dynamics. These findings may have important implications in the understanding of spine morphology changes driven by synaptic activity.

Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.:1. Verzeichnis der Abkürzungen 5 2. Einleitung 7 Fragestellung 11 3. Material und Methoden 12 3.1 Verwendete Materialien 12 3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur 12 3.1.2 Stimulatoren 12 3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen 12 3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer 13 3.1.4.1 RNA-Isolierung 13 3.1.4.2 RT-PCR 13 3.1.4.3 cDNA Microarrays 14 3.2 Zellen und Kulturbedingungen 15 3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut 15 3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen 16 3.3 Durchflusszytometrie 17 3.4 RNA Isolierung 18 3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung 18 3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit 19 3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration 19 3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 20 3.4.2.3 RNA-Fällung 21 3.5 cDNA Expressions-Ansätze 22 3.5.1 mRNA-Amplifikation 22 3.5.2 Membranmarkierung 23 3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array 23 3.5.2.2 Probensynthese 24 3.5.2.3 Aufreinigung 25 3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran 25 3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse 27 3.6 Statistische Auswertung 27 4. Ergebnisse 28 4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von IL-4 und GM-CSF 28 4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10 29 4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 30 4.3.1 Oberflächenexpression nach 7 Tagen 30 4.3.2 Oberflächenexpression nach 2 Tagen 32 4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7 33 4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und GM-CSF 36 4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL-10 überwinden? 37 4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 38 4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung Dendritischer Zellen 40 5. Diskussion 49 5.1 Hintergrund 49 5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 51 5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 53 5.4 Genexpression 55 5.4.1 Übersicht 55 5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10 56 5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10 58 5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10 59 5.5 Biologische Bedeutung 61 6. Zusammenfassung 63 7. Literaturverzeichnis 67

Parapoxvirus ovis (PPVO) is known for its immunostimulatory capacities and has been successfully used to generate vector vaccines effective especially in non-permissive host species. Murine conventional and plasmacytoid dendritic cells (cDC and pDC) are able to recognize PPVO. The PPVO-sensing receptor on pDC is hitherto unknown. In this study we aimed to define the pattern recognition receptor responsible for the activation of murine pDC by inactivated and replication-competent PPVO. We show that PPVO-induced expression of type I and type III interferons, pro-inflammatory cytokines, and costimulatory CD86 by bone marrow-derived pDC but not cDC is blocked by chloroquine, an inhibitor of endosomal maturation. The activation of pDC is independent of viral replication and depends mainly on TLR9. Moreover, the use of phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor wortmannin or C-Jun-N-terminal kinase inhibitor SP600125 results in significant reduction of PPVO-induced pDC activation. Taken together, our data identify endosomal TLR9 as PPVO-sensing receptor in pDC.

Cancer is the second most common cause of death in the world, and the number of people with the disease increases each year. The therapy of the disease currently stands on four pillars; surgery, chemotherapy, radiotherapy, and immunotherapy. Through the past few years, immunotherapy has become the fastest developing treatment modality. However, despite its unprecedented efficacy in some patients, the majority of patients still does not respond to the therapy. Therefore, there is a need to investigate the mechanisms that make immunotherapy inefficient. Cell-based cancer immunotherapy is the treatment modality which uses live ex vivo-produced tumor-targeting immune cells to treat cancer. One of the mechanisms that may compromise its therapeutic efficacy is the expression of inhibitory molecules on the surface of the produced immune cells. Tim-3 is the inhibitory molecule which attracts attention in recent years. Tim-3 expression in the tumor cells and the tumor-infiltrating immune cells is often associated with worse prognosis and more aggressive forms of the disease. However, its role in the in vitro or ex vivo-produced immune cells is difficult to predict. In this work, an in vitro study model which is based on in vitro-produced antigen-specific CD8+ T cells with high expression of Tim-3 has been...

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells, which display an extraordinary capacity to induce T-cell responses. Recent findings revealed that DCs also play a crucial role in the activation of natural killer (NK) cells representing important effectors in the innate immune defense against viruses and tumors. Here, we summarize various studies investigating the bidirectional crosstalk between human DCs and NK cells. In this context, it has been reported that DCs efficiently enhance CD69 expression, proliferation, interferon (IFN)-γ secretion and cytotoxic activity of NK cells. Cell membrane-associated molecules as well as soluble factors such as interleukin-12, tumor necrosis factor-α and type I IFNs contributed to DC-mediated NK cell activation. Reciprocally, the ability of human NK cells to enhance the immunostimulatory capacity of DCs was shown. Thus, NK cells promoted the maturation of DCs and markedly augmented their capacity to produce proinflammatory cytokines and to stimulate T-cell responses. The NK cell-mediated effects on DCs were dependent on cell membrane-associated molecules such as NKp30 and soluble factors such as tumor necrosis factor-α and IFN-γ. In conclusion, the reciprocal activating interaction between human DCs and NK cells may play a pivotal role in the immune defense against viruses and tumors. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.