Das Gesangssystem der Vögel hat sich als ein hervorragendes Modellsystem erwiesen, um Fragen zu Mechanismen entwicklungsbedingter neuronaler Plastizität von Lernprozessen zu erarbeiten. Bei Singvögeln haben sich im Laufe der Phylogenese neuronale Zentren entwickelt, die sich auf das Gesangslernen und die Gesangsproduktion spezialisiert haben. Zebrafinkenmännchen, wie viele andere Singvögel auch, erlernen ihren Gesang, indem sie von einem Tutor ihr artspezifisches Gesangsmuster schon in früher Jugend im Gedächtnis abspeichern und dann ganz allmählich ihr eigenes Vokalisationsmuster über auditorische Rückkopplung an das im Gehirn abgespeicherte Muster angleichen. Parallel zu diesen Verhaltensänderungen, finden auch auf neuronaler Ebene zahlreiche Veränderungen in den Gesangskernen statt, die in der hier vorliegenden Arbeit detailliert untersucht wurden, indem Zebrafinken zum einen mit einem Gesangstutor aufwuchsen oder ohne ein Gesangsvorbild. Die Folgen dieser unterschiedlichen Aufzuchtsbedingungen wurden dann im Gesang und in den neuronalen Strukturen der Gesangskerne mit einer Vielzahl von Techniken analysiert, einschließlich der Golgi-Technik, Elektronenmikroskopie, Immunhistochemie, verschiedener neuronaler Tracersubstanzen und quantitativer Stereologie, sowie intrazellulärer Ableitungen am in vitro Hirnschnittpräparat. Die Daten zeigen u.a., dass dendritische Spines an der Gedächtnisbildung für Gesang maßgeblich beteiligt sind und zwar in einer Vorderhirnregion, der eine wichtige Rolle bei frühen sensorischen Lernprozessen zukommt, dem lateralen magnocellularen Nucleus des anterioren Nidopalliums (LMAN). Zebrafinkenweibchen singen nicht und haben weitaus kleinere Gesangskerne als die Männchen. Zebrafinkenweibchen, die nie einen artspezifischen Gesang hören, weisen im Vergleich zu denen, die mit einem solchen aufgewachsen sind, signifikante Unterschiede in der neuronalen Struktur im Nucleus robustus arcopallii (RA) auf. Diese Befunde zeigen, dass die Gesangskerne bei Weibchen trotz ihrer kleineren Größe dennoch eine wichtige Rolle bei der Gedächtnisbildung eines artspezifischen Gesangsmusters spielen. Man beachte, dass die Nomenklatur des Vogelgehirns 2004 revidiert wurde (Reiner et al, J Comp Neurol 473:377-414, 2004; http://avianbrain.org/papers/RevisedNomenclature.pdf). / The song system of birds has been used extensively as a model system for studying basic mechanisms of neuronal plasticity and development underlying a learned behavior. Discrete sets of interconnected nuclei in the avian brain have evolved and are a prerequisite for song learning processes and the production of song. Zebra finch males, like many other song birds, learn their song by memorizing a tutor song model early in life and then gradually matching their vocal output by auditory feedback to the stored memory of that tutor song. In parallel to these behavioural changes, various changes in neuronal structures of song system nuclei take place. These structural correlates of song learning processes have been investigated in great detail in the current research by raising zebra finches with and without a song tutor model and then studying the consequences for song and for neuronal structure in the song system by using a variety of techniques including Golgi-technique, electron microscopy, immunohistochemistry, various neuronal tracer and quantitative stereology, intracellular recordings in the in vitro slice preparation and analyzing sonograms at the behavioral approach. There is strong evidence that, among other findings, dendritic spines are very much involved in memory formation of song in the lateral magnocellular nucleus of the anterior nidopallium (LMAN), a forebrain region particularly involved in sensory learning processes early in life. Female zebra finches do not sing and have much smaller song nuclei than males. Rearing females either with being exposed to species-specific song early in life or deprived of hearing song, exhibit significant differences in neuronal structure particularly in nucleus robustus arcopallii (RA). These data give further evidence that, despite their smaller sizes, song system nuclei in female birds do play an important role in memorization of song. Please note that in 2004 the nomenclature of the avian brain has been revised (Reiner et al, J Comp Neurol 473:377-414, 2004; http://avianbrain.org/papers/RevisedNomenclature.pdf).

Neuronale Verbindungen verändern sich abhängig von unseren Wahrnehmungen (synaptische Plastizität) - womöglich die Grundlage für Lernen und Gedächtnis. Diese zellulären Prozesse werden jedoch stark reguliert, und können durch den Zustand des Organismus beeinflusst werden. Diese Doktorarbeit befasst sich mit einem Mechanismus durch den zelluläre Lernprozesse in Pyramidalzellen durch lokale hemmende Neurone moduliert werden können. Dazu werden biophysikalische Modelle einzelner Zellen in Mikroschaltkreisen zu Rate gezogen. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt, dass hemmende Neurone die Lernsignale in den Dendriten der Pyramidalzelle nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip modulieren. Demnach könnten sie einen binären Schalter für das Lernen darstellen. Im Speziellen modulieren sie ein wichtiges dendritisches Lernsignal: das rückwärts-gerichtete Aktionspotenzial, das die Synapsen über neuronale Aktivität unterrichten kann. Die Hemmung muss zeitlich genau erfolgen wenn es um die Blockierung dieses rückwärts-gerichteten Signals geht; insbesondere, wenn der betrachtete Mechanismus der Lernregulierung gleichzeitig den vorwärts-gerichteten Informationsfluss erhalten soll. Wie diese Arbeit zeigt, kann die gewünschte Taktung dennoch erreicht werden, wenn die hemmenden Neurone in einem gängigen inhibitorischen Feedforward-Schaltkreis eingebettet sind. In einem solchen Schaltkreis werden die hemmenden Neurone und die Pyramidenzellen von der gleichen vorgeschalteten Zellpopulation erregt, sodass die Pyramidalzelle erst erregende und dann hemmende Reize erfährt, was die genaue Taktung zwischen Erregung und Hemmung ermöglicht. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Frage ob und wie solche zeitlich regulierten Feedforward-Schaltkreise im Gehirn etabliert werden können. Es wird demonstriert, dass konkrete Lernregeln für hemmende Synapsen in diesen Schaltkreisen diese so formen kann, dass sie für die individuellen zeitlichen Bedingungen der modulierten Zelle angemessen sind. / The neural correlate of learning is thought to be the experience-dependent adjustment of neuronal connections – synaptic plasticity. However, cellular processes mediating these changes are highly regulated, and can be influenced by the state of the organism. Limiting learning to behaviorally relevant episodes is useful if new experiences can overwrite old memories. In this thesis, we use computational modeling to explore a mechanism by which cellular learning processes in principal neurons can be modulated by another cell type: local inhibitory neurons. Although these cells are known to play a role for learning, the cellular mechanisms by which they influence synaptic plasticity are not completely understood. The aim is hence to shed light onto the cellular mechanisms underlying the regulation of synaptic plasticity. In the first part of this thesis, it is shown that inhibitory neurons can modulate dendritic signals for plasticity in principal neurons in an all-or-none manner. Thereby, inhibition can provide a binary switch for plasticity, which, as further demonstrated, can be specific for inputs arriving via different neural pathways. An important dendritic signal for plasticity is the backpropagating action potential, which informs synapses about neuronal activity and can be modulated by inhibition. We show that the timing requirement for inhibition of theses signals is tight; especially if modulation of plasticity via this mechanism ought to preserve forward-directed stimulus processing in the same neuron. Yet, we demonstrate that the desired timing can be accomplished if inhibition is embedded in a common inhibitory feedforward circuit. The second part of this thesis addresses the question whether and how appropriately timed inhibitory feedforward circuits can be established. We demonstrate that particular plasticity rules at inhibitory synapses can shape microcircuits to become properly adjusted to the individual timing requirements of the modulated neuron.

Dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen, die eigene und fremde Antigene prozessieren und mittels Haupthistokompatibilitätsmoleküle, humane Leukozytenantige (HLA) im Menschen, T-Zellen präsentieren, um Toleranzen zu induzieren oder T-Zell-vermittelte Immunantworten zu initiieren. Abhängig von ihrer Differenzierung haben sie spezifische Phänotypen und Funktionen undunterschiedliche Interaktionen mit Pathogenen, in dieser Arbeit durch Leishmania donovani (LD) repräsentiert, welche in Phagolysosomen der Makrophagen propagieren. Der Einfluss der Differenzierungszustände und von intrazelluläre Infektionen auf die Antigenprozessierung und -präsentation waren weitgehend undefiniert. Um hier Einblick zu gewinnen, haben wir die HLA-I-präsentierten Selbstpeptidome von menschlichen unreifen und reifen DCs, die aus der MUTZ3-Zelllinie generiert wurden, und LD-infizierte bzw. nicht-infizierte aus der THP1-Zelllinie generierte Makrophagen mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), sowie die Proteasom-Zusammensetzung per RT-PCR und die HLA-Expression und Aktivierungszustände der Zellen per Durchflusszytometrie analysiert und verglichen. Wir fanden, dass die HLA-I-Selbstpeptidome der Zellen heterogen und individualisiert waren, von Nonapeptiden dominiert wurden und ähnliche HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste aufwiesen. Sie stammten aus Quellenproteinen aus fast allen subzellulären Lokalisationen und mit unterschiedlichen zellulären Funktionen in ähnlichen Anteilen und schlossen Tumor-assoziierter Antigene (TAAs) ein. Die Persistenz der LD hatte keinen Einfluß auf den Aktivierungszustand der Makrophagen, verursachte aber eine weitgehende Veränderungen des Peptidoms, der HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste, der Quellproteine einschließlich TAAs und der HLA- und Proteasom-Expression. / Dendritic cells (DCs) and macrophages are specialized antigen presenting cells that process self and foreign antigens and present them to T cells via major histocompatibility complex molecules, human leukocyte antigens (HLA) in humans, for induction of tolerance or initiation of T cell-mediated immune responses. Related to differentiation state, they have specific phenotypes and functions, and varied interactions with pathogens herein exemplified by Leishmania donovani (LD) that parasitize macrophages and propagate within their phagolysosomes. The impact of the differentiation state and intracellular infection on antigen processing and presentation by HLA class I remained undefined. To gain insight, we analyzed and compared the HLA-I self peptidomes of MUTZ3 cell line-derived human immature and mature DCs, and THP1 cell line-derived LD-infected and none-infected macrophages by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), as well as proteasome compositions by quantitative RT-PCR, and HLA expression and cell activation states by flow cytometry. We found that the HLA I-presented self-peptidomes of the cells in the different states were heterogeneous and individualized, dominated by nonapeptides with similar HLA binding affinities and anchor residues. They were sampled from source proteins of almost all subcellular locations and from proteins involved in various cellular functions in similar proportion including tumour-associated antigens (TAAs). The persistence of LD within the macrophage, did not affect macrophage activation. However, its impact was observed in self-peptidome heterogeneity, HLA binding affinities, anchor residue preferences, source protein peptide sampling (including TAAs) and HLA and proteasome expression.

Die Ätiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen ist bis heute ungeklärt. Sie beinhaltet eine unkontrollierte Aktivierung von immunologischen Effektorzellen durch antigenpräsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen und intestinale Epithelzellen, die Antigene der luminalen Flora fehlerkennen und/oder falsch verarbeiten und den daraus resultierenden Gewebsschädigungsmechanismen. Am Interleukin-2 defizienten Mausmodell der Colitis ulcerosa konnten wir zeigen, daß T-Zellen eine zentrale Rolle beim mukosalen Entzündungsprozeß bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und insbesondere bei Colitis ulcerosa spielen. So kann zum Beispiel im Tiermodell eine Colitis ulcerosa durch Injektion von T-Zellen aus kranken Tieren auf gesunde Kontrolltiere übertragen werden. T-Zellen gehören zu den wichtigsten Produzenten pro-inflammatorischer Zytokine. Das Ausbleiben der Darmentzündung bei keimfrei gehaltenen Interleukin-2 defizienten Mäusen stützt die Hypothese einer Fehlaktivierung von T-Zellen durch luminale Antigene. In weiterführenden Experimenten haben wir den Beweis erbracht, daß primäre mukosale Epithelzellen das Potential zur Antigenpräsentation besitzen. Ihre Funktion besteht jedoch offenbar in der aktiven, reversiblen Hemmung von CD4+ T-Zellantworten. Da sie in unmittelbarem Kontakt mit den luminalen Antigenen stehen, kommt ihnen zumindest im Kolon eine regulatorische, tolerogene Rolle zu. Eine Störung dieses Prozesses trägt möglicherweise zur Ausbildung und Aufrechterhaltung unkontrollierter Entzündung bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und insbesondere bei Colitis ulcerosa bei. Dendritische Zellen sind die am längsten bekannten und potentesten antigenpräsentierenden Zellen. Wir konnten zeigen, daß bei Patienten in Remission bereits ein Mangel an zirkulierenden unreifen, d.h. potentiell tolerogenen, dendritischen Zellen besteht, der bei akuten Schüben stark zunimmt. Dendritische Zellen von Patienten reagieren auf mikrobielle Modellstimuli im Gegensatz zu dendritischen Zellen von Gesunden mit der Ausbildung eines aktivierten Phänotyps und der Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine. Unsere Daten lassen vermuten, daß ihre tolerogene Rolle gestört ist und sie möglicherweise aktiv zum Entzündungsgeschehen durch eine Fehlreaktion auf die kommensale Flora beitragen. Die klinische Relevanz der gestörten T-Zellaktivierung wird durch klinische Daten deutlich. Wir haben gezeigt, daß der T-Zellaktivierungshemmer Tacrolimus zur überbrückenden Therapie refraktärer chronisch entzündlicher Darmerkrankungen bis zum Wirkeintritt konventioneller Immunmodulatoren, wie zum Beispiel Azathioprin oder 6-Mercaptopurin, zur raschen Induktion einer Remission und auch bei Therapieversagen konventioneller Immunmodulatoren geeignet ist. Weiterhin demonstrierten wir seine Wirksamkeit bei refraktären extraintestinalen Komplikationen chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, wie dem Pyoderma gangrenosum. / The etiology of inflammatory bowel disease is still unknown. Patients with inflammatory bowel disease have an inappropriate T-cell response to antigenic components of their indigenous gut flora and/or food stream. This breakdown in "oral tolerance" is poorly understood. However, this phenomenon likely relates to how antigen presenting cells, such as dendritic cells and epithelial cells, process and present antigen(s) to T-cells. Our data in the interleukin-2 knock out mouse model of ulcerative colitis underscores the central role of T-cells for the inflammatory process in inflammatory bowel disease and particularly ulcerative colitis. Adoptive transfer experiments showed that T-cells from diseases animals can transmit the ulcerative like disease onto healthy controls. T-cells are among the main producers of pro-inflammatory cytokines. The absence of the ulcerative colitis like disease in gnotobiotic interleukin-2 mice supports the hypothesis of an inappropriate T-cell response towards the indigenous flora. In additional studies we were able to show, that intestinal epithelial cells are capable to present antigen. However, their major role is apparently the reversible silencing of activated CD4+ T-cell responses. Their close proximity with luminal antigens suggest a regulatory, tolerogenic role at least in the colon. A disturbance of this process probably contributes to the occurrence and perpetuation of uncontrolled inflammation in inflammatory bowel disease and particularly UC. Dendritic cells are the longest known most potent antigen presenting cells. We have demonstrated that inflammatory bowel disease patients lack circulating, immature, and thereby potentially tolerogenic dendritic cells. Cultured dendritic cells from inflammatory bowel disease patients showed a more vigorous response to microbial surrogate stimuli compared with healthy controls. Our data suggest that the normally tolerogenic role of circulating dendritic cells is impaired in inflammatory bowel disease patients. It appears that they actively contribute to the inflammatory process by a false response to the indigenous flora. The clinical relevance of an uncontrolled T-cell activation is supported by our clinical data. We demonstrated that the T-cell activation inhibitor tacrolimus is suitable for the management of refractory inflammatory bowel disease. Low dose oral tacrolimus was also effective in refractory extraintestinal complications of inflammtory bowel disease such as pyoderma gangrenosum. The concepts and available data of current and evolving biologic therapies are extensively discussed.

Mit zunehmendem Alter verringert sich die Fähigkeit des menschlichen Organismus Infektionen erfolgreich zu bekämpfen und, z.B. nach Impfung, einen protektiven Schutz aufzubauen. Es wird vermutet, dass die Alterung des Immunsystems eine Rolle dabei spielt. Wichtige Ergebnisse liefern dazu vor allem tierexperimentelle Studien, welche jedoch die Komplexität menschlicher Immunität nur bedingt abbilden. Nur ansatzweise erforscht ist der Einfluss immunologischer Alterungsprozesse auf die primäre Immunantwort im Menschen. Um ein besseres Verständnis über primäre Immunantworten im Alter zu erlangen, haben wir junge (n=11, Med=26 Jahre) und ältere (n=12, Med=60 Jahre) Erwachsene mit einem viralen Erreger experimentell infiziert und die akute Immunreaktion und Entwicklung langlebiger Protektion eingehend untersucht. Dafür verwendeten wir den attenuierten Lebendimpfstoff gegen Gelbfieber, der ein hervorragendes Modelsystem darstellt um anti-virale Primärantworten im Menschen zu erforschen. Wir konnten zeigen, dass ältere Impflinge weniger Gelbfiebervirus-(GFV)-neutralisierende Antikörper produzierten, schwächere GFV-spezifische CD8+ T-Zellantworten erzeugten und quantitativ als auch qualitativ veränderte GFV-spezifische CD4+ T-Zellantworten generierten. Zudem wiesen ältere Impflinge häufiger eine vergleichsweise späte Virämie auf. Unsere systembiologische Untersuchungen zeigten, dass die niedrige Zahl von frisch aus dem Thymus ausgewanderten naiven CD4+ T Zellen, sogenannten CD4+ Recent thymic emigrants, sowie der Mangel an dendritischen Zellen vor bzw. am Beginn der Infektion ausschlaggebend für die schlechtere Immunreaktion und niedrigere Langzeit-Immunität bei Älteren war. Daraus schließen wir, dass in älteren Menschen die Verfügbarkeit eines breiten Repertoires naiver CD4+ T-Zellen und eine effektive Induktion des angeborenen Immunsystems in der frühen Phase einer primären Infektion kritisch für die akute Abwehr viraler Erreger und die Ausbildung protektiver Immunität ist. / The immunological competence to fight infections and to generate protective immunity, for example upon vaccination, progressively declines with advancing age. Although the aged immune system has been extensively studied at steady state and in aged animal models, there is only rudimentary understanding on how aging affects the immune response to a primary infection in humans. Involving complex individual systemic immune properties, such investigations have been very challenging particularly with the given restrictions of experimental infections in humans. In our study, we explored age-related changes in human immunity during experimental, primary immunization with live-attenuated yellow fever (YF) vaccine. In 11 young (median age: 26 years) and 12 elderly (median age: 60 years) vaccinees, we assessed individual viral burden and compared humoral and cellular immunity by advanced flow cytometric analysis over the entire course of the acute infection and up to 3 years after it. We discovered that aged subjects developed fewer neutralizing antibodies, mounted diminished YF-specific CD8+ T-cell responses and showed quantitatively and qualitatively altered YF-specific CD4+ T-cell immunity. A comparatively late peak in YF viremia suggested impaired infection control and viral clearance in the elderly. Among numerous immune signatures, low in vivo numbers of naive CD4+ recent thymic emigrants (CD4+ RTE) prior immunization and peripheral dendritic cells (DCs) in the early phase of the innate response phase were indicative for reduced acute responsiveness and altered long-term persistence of human cellular immunity to YF vaccination in the elderly. Thus, we reveal by this study that essential elements of immune responses such as CD4+ RTEs and DCs affect productive immunity in the elderly, explaining conclusively diminished responsiveness to vaccination with neo-antigens and infection with de novo pathogens in aged people.

Dendritic cells (DCs), a hematopoietic cell type belonging to the sub-group of cells called antigen presenting cells (APCs), inhabit a central role in innate and adaptive immunity. Although the DC family is very heterogeneous, all members share unique features. Most importantly, DCs can stimulate an immune response. This is due to the cells’ ability to capture and process antigens and to maturate in the presence of danger signals presented by pathogens. Maturation in turn results in the migration of DCs from the tissue they reside in to the draining lymph nodes, as well as in the subsequent presentation of the acquired antigens to T cells. In the skin, which is one of the most immunogeneic organs, DCs are present in sizable numbers in both the epidermis and the dermis. This study focused on two types of DCs: epidermal Langerhans cells (LCs) and dermal DCs (DDCs). While much is understood about LCs, far less is known about the role that DDCs play in skin immunity. Therefore one purpose of this study was to characterize DDCs and to compare their phenotype and functions to that of LCs. This study used two different methods to characterize human skin resident immune cells with regard to their number and distribution. First, a stable analytical immunohistochemistry-based method was developed and applied to a substantial number of healthy skin donors. This enabled a quantitative analysis of skin DC types and skin resident T cells at different anatomical locations in situ. A novel method to count dermal cell populations in situ was developed that resulted in the first published quantification of APCs, DDCs, as well as T cells in human dermis. Second, the traditional form of the emigration assay, which selectively enriches vital cells capable of ex vivo emigration from the skin, was upgraded toward a stable analytical method to separate epidermal LCs from DDCs. In this way, both skin DC types became accessible in sufficient numbers to allow for a comparison of phenotypes and functions in vitro. The resulting phenotypic observations clearly showed that both, LCs and DDCs are not fully mature after their emigration ex vivo and that both can be transformed into a phenotypically more mature state by treating them with inflammatory cytokines. What’s more, LCs are also functionally in an immature state after their emigration. They efficiently took up antigen, showed a low capacity to trans-migrate in response to chemokines, and demonstrated a low capacity to stimulate allogeneic T cells in a mixed leukocyte reaction (MLR). For the first time this study observed all these main APC functions not only for LCs but additionally for DDCs. As these observations were made in relation to LCs of the same donor, it could be concluded that DDCs are functionally more mature than LCs after emigration. DDCs showed a lower antigen uptake capacity than LCs but were superior in terms of their migratory and stimulatory capacity. However, treatment with cytokines could skew LC functions toward functional capacities observed for DDCs, i.e., it decreased LCs’ Ag uptake and increased their migratory and stimulatory capacity, whereas the cytokine treatment did not alter DDCs’ functional capacities. After improving immuno-histochemistry and the emigration assay using healthy skin samples, these newly developed techniques were implemented in clinical trials to observe the number, distribution and migratory capacity of skin DCs and T cells in patients undergoing allogeneic hematopoietic cell transplantation (aHSCT). Such a study is of importance because the turnover of DCs and T cells is closely associated with the occurrence of acute graft-versus-host disease (aGvHD), the major cause of morbidity and mortality after aHSCT. Due to the study design used, this study concisely demonstrate that at the onset of aGvHD, different DC types accumulate along with effector T cells in skin lesions of aGvHD but not in uninvolved skin of the same patient. These results suggest that in addition to donor T cells LCs and DDCs play a role during the early phase of cutaneous aGvHD directly within the site of inflammation. The view of many authors that DC depletion in the transplant recipient, especially in target organs, is a promising approach for aGvHD prophylaxis and therapy is further underscored by these results. One targeting strategy to inhibit GvHD by eliminating recipient DCs may be the use of DC specific monoclonal antibodies. Alemtuzumab (anti-CD52) is a monoclonal antibody and has proven effective in preventing aGvHD after aHSCT. It may, despite depleting donor T cells, also work by targeting recipient DCs. To determine whether the last mechanism of action is significant, a second clinical study investigated the effects of intravenous alemtuzumab on DCs by comparing the number of these cells in skin and blood of patients before and after a 4-week course of alemtuzumab treatment. The result was that although skin DCs weakly express the target antigen CD52 the number of these cells was not consistently reduced by alemtuzumab. In contrast, circulating blood DCs have a stronger CD52 expression and were significantly reduced by the treatment. In conclusion, this work provides new insights into the phenotypical and functional characteristics of human skin DCs, as well as into the fate of these cell types during aHSCT. The investigation of the APC system during aGvHD as carried out here will help to understand the process of aGvHD in more detail. All these efforts may hopefully support the development of new approaches for therapy and prevention of this major limitation of aHSCT and may help to improve this only curative therapy for several life-threatening diseases.

Seit 20 Jahren unterteilt man Monozyten in eine klassische CD14++/CD16-Population und eine proinflammatorische CD16+ Population. Letztere macht 10-20 % der peripheren Blutmonozyten aus und ist unter verschiedenen pathologischen Zuständen drastisch erhöht. Seit Kurzem wird die CD16+ Fraktion in zwei weitere Untergruppen aufgeteilt, die CD14++/CD16+ und die CD14+/CD16+ Monozyten. In der hier vorliegenden Arbeit wurde versucht, die relativ neue und wenig charakterisierte Subpopulation der CD14++/CD16+ Monozyten näher zu beschreiben. Es sollte die Frage beantwortet werden, ob diese sich von den übrigen Subpopulationen abzugrenzen lässt und damit als eigenständige Zellgruppe anzusehen ist. Die von gesunden Spendern gewonnen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) wurden mithilfe einer Magnetsäulenvorseparation von einem Großteil der T-, B- und NK-Zellen befreit. Die restlichen Zellen wurden mit Anti-CD14-FITC und Anti-CD16-PE markiert. In einem Hochgeschwindigkeitssortierer wurden diese, anhand ihres Fluoreszenzmusters, in die drei Subpopulationen CD14++/CD16- (Sub1), CD14++/CD16+ (Sub2) und CD14+/CD16+ (Sub3) aufgeteilt. Durch dieses Verfahren konnte ein hoher Reinheitsgrad erreicht werden. Die erhaltenen Subpopulationen wurden mit heterologen CD4+ T-Lymphozyten zusammen gebracht. Die Reaktion dieser T-Zellen auf die verschiedenen Subpopulationen wurde im Proliferations- und Sekretionsassay (IFN-γ, IL-4) studiert. Des Weiteren wurde die Zytokinsekretion der Monozytenarten nach definierter Stimulierung (LPS, Zymosan, aktivierte T-Zellen) analysiert. In einem zweiten Versuchskomplex wurden aus den jeweiligen Subpopulationen unreife dendritische Zellen (Sub-DCs) differenziert und diese auf bestimmte Oberflächenmarker bzw. deren Verhalten mit heterologen CD4+ T-Zellen im Proliferations-/Sekretionsassay (IFN-γ, IL-4) untersucht. Nach 7 Tagen Inkubation fanden sich im Sub2- und Sub3-Ansatz ca. 10 % mehr proliferierende T-Zellen als im Sub1-Ansatz. Dabei lag der Anteil der CD25+ T-Zellen in diesen beiden Versuchsansätzen ebenfalls um 10 % höher. Der Proliferationsassay über 14 Tage zeigte für die Sub3 ca. 10-15 % mehr proliferierende T-Zellen als für die anderen Populationen. Das Niveau der CD25-Expression der T-Zellen war hierbei in allen drei Ansätzen gleich. Im Sekretionsassay induzierten alle drei Subpopulationen eine Th1-Antwort, jedoch mit einem leicht höheren Anteil IFN-γ-positiver T-Zellen für die CD16+ Monozyten. Durch LPS-Gabe produzierten die CD14+/CD16+ Monozyten am meisten TNF-α, gefolgt von den CD14++/CD16+. Bei den CD14++/CD16- fanden sich die geringsten Mengen an TNF-α. Zusammen mit aktivierten T-Zellen demonstrierten die CD14++/CD16+ Monozyten die stärkste TNF-α-Sekretion unter allen anderen Subpopulationen. Für die beiden CD16+ Populationen wurden nach LPS-Stimulation höhere Werte für IL-1β bestimmt als für die klassischen Monozyten. Sowohl im LPS- als auch im Zymosanansatz lag die IL-6-Sekretion der CD14++/CD16- Subpopulation über der der anderen zwei Fraktionen. Unter allen drei Stimuli wurden die höchsten Werte für IL-8 bei den CD14++/CD16- Monozyten detektiert, gefolgt von den CD14++/CD16+. Am niedrigsten lag die IL-8-Produktion bei den CD14+/CD16+. Die IL-10-Sekretion im LPS- und im Zymosanansatz der CD14++/CD16- und CD14++/CD16+ Monozyten war gegenüber der CD14+/CD16+ Subpopulation erhöht. Nach Entwicklung der unreifen dendritischen Zellen aus den entsprechenden Monozytenarten weisen diese eine differenzierte Morphologie auf. Die DCs der CD14+/CD16+ Monozyten hatten eine stärkere HLA-DR-Expression in der mittleren Fluoreszenzintensität als die anderen beiden Sub-DC-Populationen, wobei sich keine Unterschiede in der HLA-DRExpressionsintensität zwischen Sub1- und Sub2-DCs feststellen ließen. Der Anteil der CD11c positiven Zellen war bei den Sub1-DCs deutlich größer als bei den Sub2-DCs. Dagegen exprimierten die Sub3-DCs praktisch kein CD11c. Im Proliferationsassay über 7 Tage ergaben sich keine signifikanten Differenzen zwischen den Subpopulationen. Allerdings zeigte sich eine Tendenz zu geringeren Werten im Anteil proliferierender bzw. CD25-positiver T-Lymphozyten für den Sub2-DC-Ansatz. Nach 14 Tagen im Assay war der Anteil der proliferierenden T-Zellen bei den Sub1-DCs um 10 % höher als bei den Sub2-DCs. Es fanden sich ca. 10 % mehr CD25+ T-Zellen im Sub1-DC-Ansatz als in den anderen beiden Ansätzen. Der Sekretionsassay erbrachte für alle Sub-DCs eine Th1-Induktion der T-Zellen. Dabei ließen sich keine Abweichungen im Anteil IFN-γ-positiver T-Zellen zwischen den einzelnen Sub-DC-Kulturen nachweisen. Die gewonnen Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen auf der einen Seite das proinflammatorische Potential (z.B. TNF-α-Sekretion, erhöhte Proliferation), auf der anderen Seite die antiinflammatorische Komponente (IL-10-Sekretion) der CD14++/CD16+ Monozyten. Eine Rolle in der Regulation von entzündlichen und infektiologischen Erkrankungen erscheint für diese Subpopulation denkbar. Die Subpopulation 2 kann dabei als eigenständige Monozytenfraktion betrachtet werden. Die funktionellen Unterschiede zwischen den analysierten Monozytensubpopulationen zeigten sich auch nach deren Differenzierung zu unreifen dendritischen Zellen. In Anbetracht des erhöhten Anteils der CD16+ Monozyten im Rahmen diverser autoimmuner Krankheiten und der immer klarer werdenden Unterteilung in eine CD14++/CD16+ und eine CD14+/CD16+ Subpopulation, sollten weitere Untersuchungen zur klinischen Relevanz dieser Monozytengruppen durchgeführt werden. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse könnten bei der Zuordnung und Interpretation in diese zukünftigen klinischen Befunde behilflich sein. / For more than 20 years monocytes were subdivided in the classical CD14++/CD16- population and the proinflammatory CD16+ populations. The latter one includes about 10-20 % of the peripheral blood monocytes and is dramatically expanded under different pathological circumstances. Recently, the CD16+ fraction was further subdivided into two subpopulations: The CD14++/CD16+ and CD14+/CD16+ monocytes. In the present paper, the subpopulation of CD14++/CD16+ monocytes was characterized in order to answer the question if this subset can be distinguished as an independent cell population. T cells, B cells and NK cells were depleted from peripheral mononuclear blood cells (PBMCs) from healthy donors using immunomagnetic cell separation. Subsequently, the pre-separated cells were stained with anti-CD14-FITC and anti-CD16-PE and separated by fluorescence activated cell sorting (FACS) in three subpopulations: The CD14++/CD16- (Sub1), the CD14++/CD16+ (Sub2) and the CD14+/CD16+ (Sub3). The achieved purity was sufficient for the subsequent experiments. The obtained subpopulations were co-cultured together with heterologous CD4+ T lymphocytes. The reaction of these T cells to the different subpopulations was studied in the proliferation and secretion assay (IFN-γ, IL-4). Furthermore, the cytokine secretion of the monocyte subsets after defined stimulation (LPS, Zymosan, activated T cells) was analysed. In a second set of experiments, immature dendritic cells were differentiated from the monocyte subpopulations (Sub-DCs) and phenotypically and functionally characterized according to the expression of cell surface markers and the response to heterologous CD4+ T cells in the proliferation/secretion assay (IFN-γ, IL-4). After 7 days of incubation, the Sub2 and Sub3 of the monocytes induced approximately 10 % higher proliferation rates of T cells than the Sub1. The resulting frequency of CD25+ T cells in these two co-culture settings was also 10 % higher. The proliferation analysis after 14 days again showed for the Sub3 ca. 10-15 % more proliferating T cells than for the other populations. At this, the frequency of CD25 expression was equal in all co-cultures. In the secretion assay all three subpopulations induced a Th1 response, but the range of IFN-γ-positive T cells was somewhat higher for the CD16+ monocytes. Under LPS stimulation the CD14+/CD16+ monocytes produced the highest amounts of TNF-α followed by the CD14++/CD16+. The CD14++/CD16- showed the lowest amounts of TNF-α. In co-culture with activated T cells the CD14++/CD16+ monocytes demonstrated the strongest TNF-α secretion from all subpopulations. After LPS stimulation, a higher level of IL-1β was measured for both CD16+ populations than for the classical monocytes. In the LPS and the Zymosan stimulated cultures, the IL-6 secretion of the CD14++/CD16- subpopulation was higher than in the two other fractions. Under all three stimuli the highest levels of IL-8 were detected for the CD14++/CD16- monocytes followed by the CD14++/CD16+. The lowest IL-8 production was found by the CD14+/CD16+. The IL-10 secretion of the CD14++/CD16- and CD14++/CD16+ monocytes was increased compared to the CD14+/CD16+ subpopulation after LPS and Zymosan stimulation. The in vitro generated immature dendritic cells from the different monocyte subsets showed a differentiated morphology. The DCs of the CD14+/CD16+ monocytes had the strongest HLA-DR expression compared to the other two Sub-DC populations. No differences in the HLA-DR intensity were found between the Sub1- and Sub2-DCs. The rate of CD11c-positive cells was significantly higher in the Sub1-DCs than in the Sub2-DCs. However, the Sub3-DCs expressed no CD11c altogether. The proliferation assay over 7 days showed no significant differences between the subpopulations. Nevertheless, a tendency for lower levels of proliferating or CD25-positive T lymphocytes was seen in T cells co-cultured with the Sub2-DC. After 14 days, the ratio of proliferating T cells was 10 % higher with the Sub1-DCs than with the Sub2-DCs. The Sub1-DC co-culture yielded ca. 10 % more CD25+ T cells than the other two. The secretion assay revealed for all Sub-DCs a Th1 response of the T cells, with no differences in the amount of IFN-γ-positive T cells between the Sub-DC cultures. The results illustrate on one hand the proinflammatory potential (e.g. TNF-α secretion, higher proliferation), on the other hand the antiinflammatory effect (IL-10 secretion) of CD14++/CD16+ monocytes. A role in the regulation of inflammatory and infectious diseases seems to be possible for this subpopulation. The subpopulation 2 can be regarded as an independent fraction of monocytes. The functional differences between the analyzed monocyte subpopulations are further underscored following differentiation into immature dendritic cells. Considering the increased proportion of CD16+ monocytes in various autoimmune diseases and their clear subdivision in a CD14++/CD16+ and a CD14+/CD16+ subpopulation, new investigations about the clinical relevance are warranted. The findings obtained in the work presented could be in the basis for these future clinical studies.

Dendritische Zellen (DCs) sind befähigt, als potenteste Antigen-präsentierende Zelle anti¬genspezifische Immunantworten zu initiieren und zu regulieren. Mittels in vivo Antigen¬beladung von spezifischen DC-Subpopulationen mit rekombinanten Antigen-gekoppelten Antikörpern gegen C-Typ-Lektinrezeptoren konnte im Mausmodell erfolgreich adaptive zelluläre und humorale Immunantworten hervorgerufen werden. Im Menschen kann dieser Ansatz therapeutisch noch nicht zum Einsatz kommen, da DC-Subpopulationen im humanen Gewebe momentan nicht ausreichend charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane Gewebe auf das Vorhandensein der im peripheren Blut beschriebenen DC-Subpopulationen (mDC-1 DCs: CD11c+BDCA1+, mDC-2 DCs: CD11clowBDCA3+ und pDCs: CD11c-CD123+BDCA2+) und die Expression von C-Typ-Lektinrezeptoren (DC-SIGN, MMR, Langerin, DCIR und DEC205) mittels Immun¬fluoreszenz untersucht. Anhand der vorge¬gebenen Marker im peripheren Blut konnten alle drei DC-Subpopulationen in der Milz, Thymus und Tonsillen detektiert werden. Zusätzlich konnte hier erstmalig eine vierte CD11c-CD123-BDCA2+ pDC-2 DC-Subpopulation in der Milz beschrieben werden, deren Funktion derzeit noch näher untersucht wird. Im Thymus konnte CD26 nach FACS-Analysen von Gordon Heidkamp als spezifischer Marker für mDC-2 DCs identifiziert und dies in der vorliegenden Arbeit auch durch Immun¬fluores¬zenzaufnahmen von Gewebeschnitten verifi¬ziert werden. CD26 stellt damit erstmalig einen Marker dar, der erfolgreich als alternativer Marker für BDCA3, welcher unspezifisch an Thrombomodulin bindet, zur Identifikation von mDC-2 DCs in der Immunfluoreszenz von Thymusproben eingesetzt werden könnte. Die getesteten Anti¬körper XCR-1 (monoklonal) und Clec9a (polyklonal) hingegen erschienen in der Immun¬fluoreszenz sowie in FACS-Analysen (Gordon Heidkamp) nicht geeignet. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter C-Typ-Lektinrezeptoren (MMR, Langerin, DCIR, DC-SIGN und DEC205) im vorhandenen Gewebe näher betrachtet. Nach Auswertung der Immun¬fluoreszenzen konnte eine weit verbreitete Expression der untersuchten C-Typ-Lektin¬rezeptoren in humaner Milz und Thymus gefunden werden. Einzig hDCIR war auf vereinzelten Zellen exprimiert, und Langerin im Thymus nicht detektierbar. Um nicht verfügbare monoklonale Antikörper gegen C-Typ-Lektinrezeptoren zu produzieren und später Antigene an diese koppeln zu können, sollten lösliche Proteine einiger C-Typ-Lektinrezeptoren (humanes und murines Clec9a, Dectin-1 und -2, Langerin) produziert werden. Dabei gelang es bereits, lösliche Proteine der C-Typ-Lektinrezeptoren von humanem und murinem Dectin-1 zu generieren und diese zur weiteren Antikör¬per¬produktion einzusetzen.

Das kolorektale Karzinom (KRK) zählt zu den immunogenen Tumoren und zeichnet sich durch eine ausgeprägte Infiltration von verschiedenen Immunzell-Populationen aus. Dabei scheinen insbesondere CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen Typ 1 das Tumorwachstum zu beeinflussen und spielen somit eine zunehmende Rolle als prognostische Marker. Dementsprechend ergaben sich mehrere Hinweise, dass eine hohe Frequenz dieser beiden T-Zell-Populationen in KRK-Geweben mit einer erhöhten Überlebensrate assoziiert ist. Diese neuen Erkenntnisse könnten zukünftig in die Klassifikation des KRKs einfließen und therapeutische Entscheidungen beeinflussen. Im Gegensatz zu Tumor-infiltrierenden T-Zellen ist jedoch über die Frequenz und die Eigenschaften von nativen humanen dendritischen Zellen (DCs) in Kolonkarzinom-Geweben und deren mögliche Rolle in der immunologischen Abwehr von Tumoren nur sehr wenig bekannt. Als professionelle antigenpräsentierende Zellen spielen DCs eine Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer Tumor-gerichteten Immunantwort und können dadurch die Tumorentwicklung wesentlich beeinflussen. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation erstmalig Frequenz, Verteilung, Reifestatus und Zytokinexpression von 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in Kolonkarzinom-Geweben sowie in korrespondierenden tumorfreien Kolon-Geweben untersucht. SlanDCs stellen eine große Subpopulation von humanen Blut-DCs dar, die nach Aktivierung hohe Konzentrationen von verschiedenen proinflammatorischen Zytokinen sezernieren. Darüber hinaus sind sie effizient in der Lage, die antitumoralen Eigenschaften von CD8+ T-Lymphozyten und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie von Natürlichen Killer-Zellen zu fördern. Ausgehend von diesen Eigenschaften könnten slanDCs einen Beitrag zur Immunabwehr des Kolonkarzinoms leisten und somit das Tumorwachstum beeinflussen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen der Nachweis von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben erbracht. In diesem Zusammenhang konnte eine höhere Frequenz von slanDCs in Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) im Vergleich zu den korrespondierenden tumorfreien Geweben (Mittelwert: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) detektiert werden. Des Weiteren wurde eine höhere Dichte von infiltrierenden slanDCs in Kolonkarzinom-Gewebeproben (Mittelwert: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) im Vergleich zu plasmazytoiden DCs (Mittelwert: 4,86 pDCs/mm2, n=20), welche eine andere Subpopulation von humanen DCs im Blut repräsentieren, nachgewiesen. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten verschiedene Immunfluoreszenzfärbungen zur Untersuchung des Reifestatus und der Zytokinexpression der Kolonkarzinom-infiltrierenden slanDCs. Dabei konnten in allen zehn untersuchten Tumorgeweben CD83-exprimierende slanDCs detektiert werden (Mittelwert: 46,7 % CD83+ slanDCs), was auf einen reifen Phänotyp dieser DCs hinweist. Zudem erfolgte der Nachweis einer Interleukin (IL)-23-Expression in variabler Ausprägung durch infiltrierende slanDCs in zehn von elf analysierten Kolonkarzinom-Geweben (Mittelwert: 33,8 % IL-23+ slanDCs). Dabei stellte sich heraus, dass slanDCs einen wesentlichen Anteil der IL-23-exprimierenden Zellen in einigen untersuchten Gewebeproben darstellen. Eine Expression von Tumornekrosefaktor durch Kolonkarzinom-infiltrierende slanDCs wurde hingegen nur in einer geringen Frequenz detektiert. Weitere Untersuchungen identifizierten slanDCs als neue zelluläre Komponente der T-Zell-Zone von tertiären lymphoiden Strukturen (TLS) der Tumorumgebung des Kolonkarzinoms. Darüber hinaus wies ein deutlicher Anteil der dort lokalisierten slanDCs einen reifen Phänotyp oder eine Expression von IL-23 auf. Ausgehend von diesen neuen Ergebnissen könnten die infiltrierenden slanDCs an der Modulation einer adaptiven Immunantwort in der T-Zell-Zone Kolonkarzinom-assoziierter TLS beteiligt sein und einen Einfluss auf das Tumorwachstum ausüben. Weiterhin könnte die Expression des proinflammatorischen Zytokins IL-23 durch slanDCs im Tumor-umgebenden Stroma und in den TLS eine Induktion IL-17-produzierender Zellen fördern und damit auf eine Beteiligung der slanDCs an einem entzündungsbedingten Fortschreiten der Tumorerkrankung über die IL-23/IL-17-Achse hindeuten. Insgesamt leisten die gewonnenen Erkenntnisse einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von humanen nativen DCs im Kolonkarzinom und könnten die Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien in der Behandlung dieser Tumorerkrankung fördern. / Colorectal cancer as an immunogenic tumor is characterized by a marked infiltration of different immune cell populations. Especially CD8+ T-lymphocytes and CD4+ T helper cells type 1 seem to influence tumor growth and therefore play an increasing role as prognostic markers. Thus, it has been shown that high densities of these T cell subsets are associated with improved survival of colorectal cancer patients. These new insights could become part of the classification of colorectal cancer and influence therapeutic decisions. Despite these studies, little is known about the frequency and properties of native human dendritic cells (DCs) in colon cancer tissues and their potential role in antitumor immunity. DCs as professional antigen-presenting cells are critical for the induction and maintenance of antitumor immunity and can essentially influence tumor progression. Thus, the frequency, distribution, maturation, and cytokine expression of 6-sulfo LacNAc+ (slan) DCs in colon cancer tissues as well as in corresponding tumor-free colon specimens were investigated. SlanDCs represent a subset of human blood DCs that secrete large amounts of proinflammatory cytokines upon activation. Furthermore slanDCs are able to efficiently activate CD4+ T cells, tumor-reactive CD8 + T cells, and natural killer cells. Due to these functional properties, slanDCs may contribute to antitumor immunity and may influence tumor growth. Within this doctoral thesis the presence of slanDCs in primary colon cancer samples was immunohistochemically verified. In this context, a higher frequency of slanDCs in colon cancer tissues (mean: 16,69 slanDCs/mm2, n=38) in comparison to the corresponding tumor-free specimens (mean: 9,25 slanDCs/mm2, n=38) could be detected. Moreover, higher frequencies of infiltrating slanDCs in colon cancer tissues (mean: 18,85 slanDCs/mm2, n=20) were detectable compared to plasmacytoid DCs (mean: 4,86 pDCs/mm2, n=20), representing another human blood DC-subset. Based on these results, various immunofluorescence stainings were performed to investigate maturation and cytokine expression of the infiltrating slanDCs. SlanDCs expressing the maturation marker CD83 were detected in all 10 analyzed colon cancer tissues (mean: 46,7% CD83+ slanDCs). In addition, IL-23-expressing slanDCs were present at varying percentages in 10 of 11 evaluated colon cancer samples (mean: 33,8% IL-23+ slanDCs). Interestingly, in several tissues slanDCs represented a marked proportion of all IL-23-expressing cells. However, slanDCs expressing tumor necrosis factor could only be detected in low frequencies in the analyzed colon cancer specimens. Further studies revealed that slanDCs are a novel component of the T-cell zone of colon cancer-associated tertiary lymphoid structures (TLS). A proportion of these TLS-associated slanDCs displays a mature phenotype or express IL-23. These novel findings indicate that slanDCs may modulate adaptive immune responses in the T-cell zone of colon cancer-associated TLS and may contribute to the regulation of tumor progression. Furthermore the IL-23-expressing slanDCs in the tumor-surrounding stroma and the TLS may promote the generation of IL-17-producing cells and may participate in inflammation-related cancer progression mediated by the IL-23/IL-17 axis. These novel observations can help to decipher the role of human native DCs in colon cancer and may have implications for the design of therapeutic strategies against this tumor entity.

Dendritische Zellen (DCs) sind befähigt, als potenteste Antigen-präsentierende Zelle anti¬genspezifische Immunantworten zu initiieren und zu regulieren. Mittels in vivo Antigen¬beladung von spezifischen DC-Subpopulationen mit rekombinanten Antigen-gekoppelten Antikörpern gegen C-Typ-Lektinrezeptoren konnte im Mausmodell erfolgreich adaptive zelluläre und humorale Immunantworten hervorgerufen werden. Im Menschen kann dieser Ansatz therapeutisch noch nicht zum Einsatz kommen, da DC-Subpopulationen im humanen Gewebe momentan nicht ausreichend charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane Gewebe auf das Vorhandensein der im peripheren Blut beschriebenen DC-Subpopulationen (mDC-1 DCs: CD11c+BDCA1+, mDC-2 DCs: CD11clowBDCA3+ und pDCs: CD11c-CD123+BDCA2+) und die Expression von C-Typ-Lektinrezeptoren (DC-SIGN, MMR, Langerin, DCIR und DEC205) mittels Immun¬fluoreszenz untersucht. Anhand der vorge¬gebenen Marker im peripheren Blut konnten alle drei DC-Subpopulationen in der Milz, Thymus und Tonsillen detektiert werden. Zusätzlich konnte hier erstmalig eine vierte CD11c-CD123-BDCA2+ pDC-2 DC-Subpopulation in der Milz beschrieben werden, deren Funktion derzeit noch näher untersucht wird. Im Thymus konnte CD26 nach FACS-Analysen von Gordon Heidkamp als spezifischer Marker für mDC-2 DCs identifiziert und dies in der vorliegenden Arbeit auch durch Immun¬fluores¬zenzaufnahmen von Gewebeschnitten verifi¬ziert werden. CD26 stellt damit erstmalig einen Marker dar, der erfolgreich als alternativer Marker für BDCA3, welcher unspezifisch an Thrombomodulin bindet, zur Identifikation von mDC-2 DCs in der Immunfluoreszenz von Thymusproben eingesetzt werden könnte. Die getesteten Anti¬körper XCR-1 (monoklonal) und Clec9a (polyklonal) hingegen erschienen in der Immun¬fluoreszenz sowie in FACS-Analysen (Gordon Heidkamp) nicht geeignet. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter C-Typ-Lektinrezeptoren (MMR, Langerin, DCIR, DC-SIGN und DEC205) im vorhandenen Gewebe näher betrachtet. Nach Auswertung der Immun¬fluoreszenzen konnte eine weit verbreitete Expression der untersuchten C-Typ-Lektin¬rezeptoren in humaner Milz und Thymus gefunden werden. Einzig hDCIR war auf vereinzelten Zellen exprimiert, und Langerin im Thymus nicht detektierbar. Um nicht verfügbare monoklonale Antikörper gegen C-Typ-Lektinrezeptoren zu produzieren und später Antigene an diese koppeln zu können, sollten lösliche Proteine einiger C-Typ-Lektinrezeptoren (humanes und murines Clec9a, Dectin-1 und -2, Langerin) produziert werden. Dabei gelang es bereits, lösliche Proteine der C-Typ-Lektinrezeptoren von humanem und murinem Dectin-1 zu generieren und diese zur weiteren Antikör¬per¬produktion einzusetzen.