Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T11:44:16Z No. of bitstreams: 1 Debora Batista de Oliveira.pdf: 2887120 bytes, checksum: 263a4a9265044107d6caf01ffb4095e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T11:44:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Debora Batista de Oliveira.pdf: 2887120 bytes, checksum: 263a4a9265044107d6caf01ffb4095e0 (MD5) Previous issue date: 2012-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As plaquetas são fragmentos celulares derivados do precursor hematopoiético megacariócito, que desempenham um importante papel na hemostasia, inflamação e resposta imune. Na dengue, as plaquetas constituem uma das populações celulares mais afetadas por mecanismos diretos ou indiretos da infecção. Desta forma, estudos que possam contribuir na compreensão da plaquetopenia, assim como nas alterações funcionais das plaquetas na dengue são de extrema importância para o entendimento da patogenia e no avanço de esquemas terapêuticos durante a infecção humana pelo dengue. O objetivo deste trabalho foi avaliar alterações nas plaquetas durante a infecção humana e ex vivo pelo DENV, observando sua morfologia, perfil de ativação e expressão de receptores do tipo Toll TLR2 e TLR4, interação com o vírus e relação com proteínas plasmáticas associadas à sua ativação e funcionalidade. Para isto, foram utilizados metodologias de citometria de fluxo, microscopia eletrônica de transmissão e ensaios imunoenzimáticos. Utilizando modelo in vitro de ativação em que plaquetas de doadores foram estimuladas com trombina, confirmamos a ativação dessas subpopulações celulares, sem detectar alteração da expressão dos TLR2 e TLR4. Ao avaliarmos o efeito da interação do DENV-2 com plaquetas de doadores, demonstramos evidências morfológicas de ativação e detectamos partículas virais em vesículas citoplasmáticas por microscopia eletrônica. Contudo, nas mesmas condições acima, não detectamos modulação da expressão de marcadores de ativação plaquetária, como CD62P e fibrinogênio, nem de TLR2 ou TLR4 por citometria de fluxo. A análise das plaquetas isoladas de pacientes DENV+ demonstrou maior expressão de CD62P e menor expressão de TLR4 comparado a pacientes com outras doenças febris e controles saudáveis por citometria de fluxo. Não detectamos diferença na expressão de CD40L e TLR2. Morfologicamente, a ativação das plaquetas de pacientes DENV+ foi confirmada. Brevemente, a quantificação de mediadores plasmáticos por ensaios imunoenzimáticos relacionados direta ou indiretamente com a ativação e função plaquetária indicou: (i) níveis aumentados da relação sCD62P/contagem de plaquetas com a gravidade da doença; (ii) envolvimento menor da quantidade de NOx plasmático nos pacientes; (iii) diminuição dos níveis do vasoconstritor TXB2 em pacientes com FD Sem SA comparado aos controles e pacientes Graves; (iv) níveis aumentados de TFPI com a gravidade da doença; (v) níveis diminuídos de CCL5 mas (vi) aumentados de CCL2 com a gravidade da doença. As análises de correlação demonstraram que enquanto os níveis de CCL5 estavam diretamente relacionados com a quantidade de plaquetas, a correlação foi inversa entre TFPI e plaquetas. De forma interessante, níveis aumentados de TXB2 foram vistos em pacientes com extravasamento plasmático comparados aos pacientes sem extravasamento. Nossos resultados confirmaram a capacidade de interação in vitro do DENV e plaquetas, com subsequentes modificações morfológicas. Na infecção natural, plaquetas de pacientes DENV+ são ativadas, inclusive com confirmação do perfil morfológico de ativação. Nós supomos que a diminuição da expressão de TLR4 nas plaquetas da nossa coorte de pacientes poderia estar (i) diretamente relacionado a ativação das plaquetas e/ou (ii) a uma coorte de pacientes clinicamente branda, caracterizada por uma evolução clínica e plaquetopenia pouco agravantes. A relação entre sCD62P/contagem de plaquetas e os níveis de TFPI confirmam a ativação plaquetária e seriam bons marcadores de prognóstico da doença. Além disso, CCL5 e TFPI participariam direta ou indiretamente da plaquetopenia ou da funcionalidade plaquetária. / Platelets are cell fragments derived from the hematopoietic precursor megacaryocyte, which play an important role in hemostasis, inflammation and immune response. In dengue, platelets constitute one of the cell populations most affected by direct or indirect mechanisms of infection. Therefore, studies that may contribute to the understanding of thrombocytopenia, as well as functional changes of platelets in dengue are extremely important for the understanding of the pathogenesis and progress of therapeutics during human infection by dengue. The aim of this study was to evaluate changes in platelets during human and ex vivo infection by DENV, observing its morphology, activation profile and expression of Toll-like receptors TLR2 and TLR4, interaction with the virus and relation with plasma proteins associated to its activation and functionality. To do so, flow cytometry methods, transmission electron microscopy and immunoassays were used. Using in vitro model of platelet activation in which platelets from donors were stimulated with thrombin, we confirmed the activation of these cellular subpopulations without detecting altered expression of TLR2 and TLR4. When evaluating the effect of the interaction of DENV-2 with donor platelets, we demonstrated morphological evidences of activation and detected viral particles in cytoplasmic vesicles by electron microscopy. However, under the same conditions above, we have not detected modulation of the expression of platelet activation markers such as fibrinogen and CD62P or TLR2 or TLR4 by flow cytometry. Analysis of platelets isolated from patients DENV+ demonstrated greater expression of CD62P and lower TLR4 expression compared to patients with other febrile illness and healthy controls by flow cytometry. We did not detect differences in the expression of CD40L and TLR2. Morphologically, the activation of platelet from patients DENV+ was confirmed. Briefly, quantification of plasma mediators by immunoassays related directly or indirectly with activation and platelet function indicated: (i) Increased levels of the relation sCD62P/platelet count in the severity of the disease, (ii) lesser involvement of plasmatic NOx in patients, (iii) decreased levels of vasoconstrictor TXB2 in patients with DF without WS compared to controls and severe patients, (iv) increased levels of TFPI according to the severity of the disease, (v) reduced levels of CCL5 (vi) but increased levels of CCL2 with increased disease severity. Correlation analysis showed that while the CCL5 levels were directly related to the platelet count, inverse correlation between TFPI and platelets occurred. Interestingly, increased levels of TXB2 were seen in patients with plasma leakage compared to patients without leakage. Our results confirmed the ability of in vitro interaction of DENV and platelets, with subsequent morphological changes. In natural infection, platelets from patients DENV+ are activated, even confirming the profile of morphological activation. We hypothesize that the decreased expression of TLR4 in platelets from our cohort of patients could be (i) directly related to platelet activation and/or (ii) to a cohort of patients clinically mild, characterized by clinical progression and thrombocytopenia not aggravated. The relationship between sCD62P/platelet count and levels of TFPI confirm platelet activation and would be good prognostic markers of the disease. Furthermore, CCL5 and TFPI could participate directly or indirectly in thrombocytopenia or in platelet function.