A redução no desenvolvimento muscular de filhotes cujas mães foram submetidas ao consumo de dietas baseadas no padrão ocidental pode ser, ao menos em parte, explicada pela resistência periférica à insulina, condição na qual a atividade de proteínas relacionadas à via de sinalização intracelular sensível a esse hormônio encontra-se reduzida. A regulação positiva dessa via resulta no aumento da atividade do Alvo da Rapamicina em Mamíferos (mTOR) que atua como efetor positivo da taxa de tradução de RNAm e, consequentemente, da síntese proteica. Estudos que avaliam a atividade dessa proteína frente ao consumo crônico de dietas hiperlipídicas são escassos e controversos e, até o momento, não são conhecidos trabalhos que avaliaram esses marcadores em animais neonatos ou desmamados, provenientes de mães alimentadas com dieta hiperlipídica gestacional e pós-gestacional. O presente estudo objetiva avaliar o efeito do consumo de uma dieta hiperlipídica por ratas adultas sobre a morfologia e sobre a expressão e a fosforilação das proteínas que compõem a via de sinalização intracelular do mTOR no músculo esquelético da prole em dois momentos: nascimento e desmame. Para isso, inicialmente, 39 ratas foram distribuídas em dois grupos, de acordo com a dieta oferecida: controle (n=19) e hiperlipídica (n=20). Após o nascimento, cerca de seis filhotes por mãe foram eutanasiados para coleta de amostras e análise dos marcadores investigados. Os filhotes selecionados para dar continuidade ao experimento foram dispostos junto às mães que, por sua vez, foram distribuídas em outros quatro grupos, segundo a dieta gestacional e pós-gestacional: CON/CON (n=8); CON/HL (n=9); HL/HL (n=8); HL/CON (n=7). Ao final da lactação, os filhotes foram eutanasiados e amostras foram coletadas para análise. Os resultados obtidos indicam que, em relação aos animais neonatos, há redução das concentrações séricas de leptina e de IGF-I e aumento da fosforilação da Akt e do mTOR musculares, em resposta ao consumo materno da dieta hiperlipídica. Por sua vez, nos animais lactentes, observamos influência da dieta hiperlipídica materna pós-gestacional sobre a promoção de fenótipo obesogênico, com concomitante redução do desenvolvimento muscular e da fosforilação de proteínas alvo do mTOR em estado pós-prandial. Com base nos resultados obtidos, concluímos que a dieta hiperlipídica materna afeta a atividade do mTOR, sendo, esse efeito, dependente da idade e da condição fisiológica dos animais. / The decrease in muscle development of offspring whose mothers consume a typical Western diet can be partly explained by the progression of peripheral insulin resistance, a condition in which the activity of proteins related to the intracellular signaling pathway sensitive to this hormone is reduced. The positive regulation of this pathway results in increased activity of the Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) that acts as a positive regulator of the rate of mRNA translation and protein synthesis. Studies that assess the activity of this protein in response to chronic consumption of high fat diets are scarce and controversial and, to date, studies that evaluated these markers in the offspring of mothers fed a high fat diet during gestational and lactation are not known. This study aims to evaluate the effect of consuming a high fat diet for female adult rats in morphology and expression and phosphorylation of proteins that comprise the intracellular signaling pathway of mTOR in skeletal muscle of offspring in two stages: birth and weaning. Therefore, initially, 39 rats were divided into two groups, according to the available diet: control (n = 19) and diet (n = 20). After birth, around six pups per mother were killed for sample collection and analysis of the markers investigated. The pups selected to continue the experiment were placed with the mothers who, in turn, were divided into four groups according to gestational and post-gestational diets: CON/CON (n = 8), CON/HL (n = 9), HL/HL (n = 8), HL/CON (n = 7). At the end of lactation, the pups were euthanized and samples were collected for analysis. The results indicate that, for the newborn animals, there is a reduction of serum leptin and IGF-I concentrations and increased phosphorylation of Akt and mTOR in muscle in response to maternal consumption of high fat diet. In turn, we found that maternal high-fat diet during lactation promoted an obese phenotype in weaned animals, with concomitant reduction of muscle development and mTOR target proteins phosphorylation in the postprandial state. Based on these results, we conclude that maternal high-fat diet affects the activity of mTOR, depending on age and physiological condition of the animals.

Orientador: Lucia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_CarolinaStefano_M.pdf: 7530088 bytes, checksum: 5c8cf5e001032d6962337caaccfcbcd8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Miostatina (MSTN) é uma proteína que regula negativamente a formação de musculatura esquelética, e sua estrutura e função são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos. O nocaute de seu gene causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, o que despertou grande interesse médico e agropecuário desde a descoberta deste gene. Trabalhos anteriores descrevem a função da proteína, mas ainda faltam dados sobre a regulação da sua expressão gênica. Recentemente, o promotor do gene da Mstn foi identificado e caracterizado pelo nosso grupo de pesquisa, a partir de uma abordagem filogenética. Entretanto, além do promotor, também existem outros elementos cis-reguladores que podem atuar como estimuladores ou silenciadores do processo de transcrição gênica. Em conjunto com o promotor gênico, esses elementos controlam a taxa de transcrição e conferem especificidade espacial e temporal para sua expressão. Sendo assim, a proposta deste trabalho foi identificar e caracterizar possíveis elementos cis-reguladores da Mstn a fim de ampliar o conhecimento sobre a sua regulação transcricional. Para tal, análises de genômica comparativa, semelhantes àquelas empregadas na identificação do promotor gênico da Mstn, foram realizadas para localizar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) adjacentes ao lócus da Mstn de humano, camundongo e galinha, bem como para identificar potenciais sítios de ligação para fatores transcricionais conservados nessas regiões. Além disso, foi realizada uma análise da evolução desses possíveis elementos cis-reguladores, a fim de identificar polimorfismos que tenham o potencial de afetar a atividade transcricional da Mstn. Nossos resultados revelaram a existência de um arcabouço regulatório ancestral composto por sítios de ligação conservados em várias das ECRs analisadas, o qual tem sido mantido entre 310 e 430 milhões de anos. Além disto, foram identificados polimorfismos, bem como sítios de ligação grupo-específicos, os quais podem estar envolvidos na regulação diferencial da atividade da Mstn e, portanto, na geração de diferentes fenótipos musculares entre os animais. Dentre as oito ECRs estudadas, duas possuem maior potencial de estarem envolvidas na miogênese, uma vez que nelas foram identificados sítios de ligação para importantes fatores relacionados a este processo. Análises funcionais das ECRs 2 e 5/6 em células C2C12 em diferenciação confirmaram o potencial dessas ECRs de humano e camundongo de atuarem como elementos cis-reguladores, uma vez que mostraram que eles são capazes de modificar a expressão do gene repórter EGFP em comparação ao controle. As ECRs de galinha, por outro lado, não geraram resultados significativos, reforçando a hipótese de que as diferenças nos TFBS encontradas no grupo das aves geram alterações funcionais nas ECRs. O desenrolar de novos estudos a partir dos resultados obtidos neste trabalho permitirão estabelecer o papel específico das ECRs identificadas, bem como determinar a importância das variações de sequências destes elementos reguladores em diferentes animais. No longo prazo, nossas pesquisas poderão subsidiar o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a modulação da atividade da Mstn em patologias humanas que afetam a musculatura esquelética / Abstract: The Myostatin protein (MSTN) is an important regulator of skeletal muscle deposition in vertebrates, and its structure and function are conserved in several species, including humans. The knockout of this gene causes hyperplasia and hypertrophy of muscle fibers, which has aroused great medical and agricultural interest since its discovery. Previous studies have described the function of this protein, but data on the regulation of Mstn gene expression are still scarce. Recently, the Mstn gene promoter has been identified and characterized by our research group from a phylogenetic approach. However, in addition to the promoter, there are also other cis-regulatory elements that can act as enhancers or silencers of gene transcription process. Along with the gene promoter, these elements control the transcription rate and provide spatial and temporal specificity for its expression. Thus, the purpose of this study was to identify and characterize potential Mstn cis-regulatory elements in order to increase knowledge of the transcriptional regulation of this gene. For this purpose, comparative genomic analysis similar to those employed in the identification of the Mstn promoter were performed to locate evolutionary conserved regions (ECRs) adjacent to the locus of the Mstn gene in human, mouse and chicken, as well as to identify potential transcription factors binding sites (TFBS) conserved in these regions. Furthermore, an evolutionary analysis of the putative cis-regulatory elements has been performed in order to identify polymorphisms that have the potential to affect the transcriptional activity of Mstn. Our results indicate the existence of an ancestral regulatory framework that comprises conserved TFBS in almost all of the ECRs analyzed, which has been maintained between 310 and 430 million years. Furthermore, polymorphisms were identified, as well as group-specific binding sites, which may be involved in the differential regulation of Mstn activity and, therefore, in the generation of different muscle phenotypes in animals. Among the eight ECRs studied, two of them have great potential to be involved in myogenesis, given that binding sites for important factors related to this processes were identified. Functional analyses of ECRs 2 and 5/6 in differentiating C2C12 cells confirmed the potential of the human and mouse ECRs as cis-regulatory elements, once they have shown that they are able to enhance the expression of the EGFP reporter gene, when compared to the control. The chicken ECRs, on the other hand, did not generate significant results, supporting the hypothesis that the differences found in the TFBS pattern in birds generate functional modifications in the ECRs. The development of new studies from the results obtained here may help to establish the specific role of the ECRs identified, as well as determine the importance of the variation in the sequence of these regulatory elements in different animals. In the long run, our research may lay the foundation to the development of strategies that allow the modulation of Mstn activity in human pathologies affecting skeletal muscle / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-11T19:21:56Z No. of bitstreams: 1 alessandra_f_gomes_ioc_bcm_0067_2011.pdf: 34748958 bytes, checksum: 8c5c090d230591acbb61ec0b50f12643 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-11T19:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alessandra_f_gomes_ioc_bcm_0067_2011.pdf: 34748958 bytes, checksum: 8c5c090d230591acbb61ec0b50f12643 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Edital Universal MCT/CNPq no 014/2008 Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde - PAPES IV Pronex 2010 - Programa de Apoio a Núcleos de Excelência- CNPq/FAPERJ) Instituto Oswaldo Cruz (IOC) - Fiocruz / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Toxoplasma gondii parasito intracelular obrigatório tem como nicho durante a fase crônica da infecção, o músculo e o cérebro, o que justifica o emprego de culturas primárias de células musculares esqueléticas (CME) como modelo de estudo da toxoplasmose experimental. Os objetivos e resultados desta tese foram: (1) analisar a capacidade infectiva do T. gondii em CME durante a miogênese e seu efeito neste processo. Taquizoítos invadem 43% das células da cultura e mioblastos infectados inibem em 75% a formação de miotubos, afetando assim a miogênese. A expressão da molécula de adesão caderina foi modulada negativamente com diminuição expressiva do gene M-caderina em células infectadas; (2) Investigar o citoesqueleto em CME infectadas com T. gondii. A infecção de CME causou remodelamento de tubulina, desarranjo de filamentos de actina e reorganização de miosina. Testes por RT-PCR não mostraram significante mudança na síntese de mRNA para desmina durante a interação. Ensaios bioquímicos por Western blot mostraram uma redução da expressão da proteína desmina. O rompimento das barreiras físicas durante o escape do parasito da célula hospedeira garante novos ciclos celulares; (3) Correlacionar os dados experimentais das más formações congênitas observadas in vivo com o distúrbio da miogênese verificada in vitro. Análises histopatológicas apontram a interferência do T. gondii no desenvolvimento embrionário do tecido muscular revelando a formação de miofibras menores, com menos densidade de material citoplasmático e maior espaço intermiofibrilar; (4) Investigar a resposta celular de CME frente infecção pelo T. gondii. Nós demonstramos que a infecção leva a um aumento no número de corpúsculos lipídicos (CL), os CL interagem com o retículo sarcoplasmático e o citoesqueleto de actina. Por análise ultraestrutural foi visto que CL em contato direto com a membrana do vacúolo parasitóforo e dentro da matriz vacuolar, em torno e interagindo diretamente com a membrana do parasito, indicando que CL são recrutados e liberam seu conteúdo para dentro do PV. Houve um aumento nos níveis de mRNA da enzima ciclooxigenase-2 (COX- 2), nas primeiras horas de interação T.gondii-CME e um aumento na síntese de prostaglandina-E2 de 6 a 48 h de interação. Nós observamos um aumento na produção das citocinas interleucina-12 e interferon-γ em CME infectados. Nós sugerimos que o parasito modula a resposta celular de CME infectadas e deve contribuir para o erstabelecimento e manutenção na fase crônica da infecção na célula muscular. / The obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii has as niche during the chronic phase of infection, the muscle and brain, which justifies the use of primary cultures of skeletal muscle cells (SkMC) as a model of experimental toxoplasmosis. The aims and results of this study were: (1) analyze the infective capacity of T. gondii tachyzoites in SkMC during myogenesis and their effect on this process. Tachyzoites invaded 43% of the cell cultures and infected myoblasts inhibited in 75% the formation of myotubes, affecting the myogenesis. The cadherin (adhesion molecule) expression was downregulated in infected cells with substantial decrease in the M-cadherin gene; (2) Investigate the cytoskeleton organization in CME-T. gondii infected. The infection of SkMC causes remodeling of tubulin, disassembly of actin filaments and myosin reorganization. RT-PCR tests not showed significant change in the desmin mRNA synthesis during interaction. Biochemical assays by Western blot showed a reduction of the desmin protein expression. Physical barriers disruption during parasite egress from the host cell ensure new cellular cycles; (3) Correlate the experimental data in vivo showing congenital malformations with myogenesis disorder observed in vitro. Histopathological analysis showed T. gondii interference in the embryonic development of muscle tissue revealing smaller myofibers formation, with less ocytoplasmic material density and greater intermyofibrillary space, (4) Investigate the SkMC cellular response against T. gondii infection. We demonstrated that the infection leads the numbers increase of lipid bodies (LB), the LB interact closely with sarcoplasmatic reticulum and actin cytoskeleton. By ultrastructural analysis was observed LB in direct contact with parasitophorous vacuole membrane, within vacuolar matrix, around and interacting directly with parasite membrane, indicating that LB are recruited and deliveries its content inside the PV. There was COX-2 mRNA levels increase in the first hour of T. gondii-SkMC interaction and prostaglandin E2 synthesis increase from 6 h up to 48 h of infection. We observed also production increase of the cytokines interleukin-12 (IL-12) and interferon-γ (IFN-γ) in infected SkMC. We suggest that the parasite modulates SkMC cellular response and it might contribute to the establishment and maintenance of chronic phase of infection in muscle cell.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the viability of using diets composed of ingredients of plant and animal origin in the feeding of post-larvae jundiá (Rhamdia quelen) and its influence on the development of animals. Experiments were carried out where it is tested in the first (E1) the total replacement (30%) and partial (15%) of the liver poultry for fish meal (FJ) and / or protein soy concentrate (CPS) on the standard diet containing 30% liver poultry. In the second (E2) substitution levels (5; 10; 15; 20 and 25%) of the liver by FJ and third (E3) of the liver levels for CPS replacement (15, 20, 25 and 30%) supplemented with taurine (CPST). Performance parameters were analyzed (weight, total length, condition factor, specific growth rate, daily weight gain, survival and product weight versus survival), muscle development (fiber diameter, number of fibers / mm² and total number of fibers ) and enzymatic activity (trypsin, chymotrypsin, lipase, amylase and maltase). The best performance of jundiá post-larvae was from 15FJ diets (E1 and E2) and 15CPST (E3). In the muscle development is found larger diameter and total number of fibers with the above mentioned diets. The development of the digestive system was not affected by the diets provided to post-larvae in this study. The enzymes assessed were already present and active at the first feeding. The enzyme activity varied during all experimental periods, with reduced activity of trypsin and chymotrypsin for diets with higher percentages of CPST over those with a lower percentage. According to the results we conclude that the combination of the sources of animal and plant improved the diet, helping improve the development of post-larvae of jundiá. / O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da utilização de dietas compostas por ingredientes de origem animal e vegetal na alimentação de pós-larvas de jundiás (Rhamdia quelen) e sua influência no desenvolvimento dos animais. Foram realizados três experimentos onde testou-se no primeiro (E1) a substituição total (30%) e parcial (15%) do fígado de aves por farinha de peixe (FJ) e/ou concentrado proteico de soja (CPS) na dieta padrão contendo 30% de fígado de aves. No segundo (E2) níveis de substituição (5; 10; 15; 20 e 25%) do fígado por FJ e no terceiro (E3) níveis de substituição do fígado por CPS (15; 20; 25 e 30%) suplementado com taurina (CPST). Foram analisados parâmetros de desempenho (peso, comprimento total, fator de condição, taxa de crescimento específico, ganho em peso diário, sobrevivência e produto peso versus sobrevivência), desenvolvimento muscular (diâmetro da fibra, número de fibras/mm² e número total de fibras) e atividade enzimática (tripsina, quimotripsina, lipase, amilase e maltase). O melhor desempenho das pós-larvas de jundiá foi a partir das dietas 15FJ (E1 e E2) e 15CPST (E3). No desenvolvimento muscular encontrou-se maiores diâmetros e número total de fibras com as dietas citadas acima. O desenvolvimento do sistema digestório não foi prejudicado pelas dietas fornecidas às pós-larvas neste estudo. As enzimas analisadas já estavam presentes e ativas no momento da primeira alimentação. A atividade das enzimas oscilou durante todos os períodos experimentais, apresentando redução da atividade da tripsina e quimotripsina para as dietas com maiores percentuais de CPST em relação aquelas com menor percentual. De acordo com os resultados concluimos que a combinação das fontes de origem animal e vegetal aprimorou a dieta, contribuindo para melhorar o desenvolvimento das pós-larvas de jundiá.