Desmogleine (Dsg1-4) sind transmembranäre Adhäsionsproteine aus der Gruppe der desmosomalen Cadherine, die Zell-Zell-Kontakte zwischen benachbarten Keratinozyten der Epidermis in und außerhalb von Desmosomen vermitteln. Eine durch Autoantikörper induzierte Störung dieser Haftstrukturen (hauptsächlich Dsg1 und Dsg3) resultiert im klinischen Bild der Pemphigus-Erkrankung. Dieses ist makroskopisch durch eine Blasenbildung der Haut gekennzeichnet. Auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene lassen sich im Falle von Pemphigus vulgaris (PV) eine Retraktion des Zytoskeletts, eine Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge und eine Aktivierung verschiedener Signalwege u.a. der p38MAPK nachweisen. PV eignet sich daher als Modellerkrankung zur Untersuchung der Bedeutung desmosomaler Cadherine für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten. Durch zahlreiche Studien wurde die wichtige Funktion von Dsg3 als Adhäsionsprotein bestätigt und eine Beteiligung an der Modulation zahlreicher Signalwege, die in Zusammenhang mit der Pemphigus-Pathogenese stehen, untersucht. Im Gegensatz dazu konnte bisher keine spezifische Funktion des desmosomalen Cadherins Dsg2 in der Epidermis identifiziert werden. Dsg2 kommt als einziges Desmoglein in allen Geweben vor, die Desmosomen enthalten, und ist auch an den Zell-Zell-Kontakten im Myokard und Darmepithel vorhanden, wo kein Dsg1 und Dsg3 exprimiert werden. Hier nimmt Dsg2 eine wichtige Rolle als Adhäsionsmolekül und als Regulator interzellulärer Prozesse ein. In dieser Arbeit wurde daher vergleichend die Bedeutung von Dsg2 und Dsg3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten im Hinblick auf ihre Funktion als Adhäsionsmolekül und als Rezeptormolekül, speziell im p38MAPK-Signalweg, untersucht. Wesentliche Unterschiede zeigten sich zunächst in der Lokalisation beider Proteine. Während sich die in der Literatur beschriebene Lokalisation von Dsg3 im Stratum basale und spinosum der Epidermis bestätigte, konnte Dsg2 nur am Haarfollikel nachgewiesen werden. In differenzierten HaCaT-Zellen, einer Keratinozyten-Zelllinie war Dsg2 eher punktförmig und Dsg3 nahezu linear an der Zellmembran lokalisiert. Dementsprechend ließ sich Dsg2 nach Triton-vermittelter Zellfraktionierung in ähnlicher Verteilung zwischen der Zytoskelett-gebunden und -ungebundenen Fraktion nachweisen wie Desmoplakin, das an der Zellemembran ausschließlich in Desmosomen vorkommt. Durch Dsg-spezifische Antikörper, deren inhibitorische Eigenschaft in zellfreien AFM-Studien nachgewiesen wurde, konnte nur eine Inhibierung der Dsg3- und nicht der Dsg2-vermittelten Adhäsion in HaCaT-Zellen erzielt werden. Im Gegensatz dazu induzierte derselbe Dsg2-spezifische Antikörper einen signifikanten Haftungsverlust in einer Darmepithelzelllinie. Die mittels siRNA induzierte Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge führte jedoch nur unter erhöhter mechanischer Belastung der Zellen zu einem Adhäsionsverlust. Die simultane Modulation der Funktion von Dsg2 und Dsg3 mittels siRNA bzw. der Inkubation Dsg2-depletierter Zellen mit AK23, einem inhibitorischen Dsg3-spezifischen Antikörper, resultierte in einem drastischen, teilweise p38MAPK-abhängigen, Adhäsionsverlust. Dieser Befund lieferte erste Hinweise auf eine kompensatorische Funktion von Dsg2 bei eingeschränkter Dsg3-vermittelter Haftung in Keratinozyten. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Verteilung von Dsg2 an der Zellemembran Dsg3-depletierter HaCaT-Zellen untersucht. Der Verlust von Dsg3 resultierte hierbei in einer Zunahme und Linearisierung der Dsg2-Membranfärbung, was die Hypothese einer kompensatorischen Funktion im Falle einer Beeinträchtigung der Dsg3-Funktion bekräftigt. Um die Funktion von Dsg2 unter dieser Bedingung gezielter zu untersuchen, wurde das transgene Dsg3-Mausmodell eingesetzt und primäre Keratinozyten aus neonatalen Dsg3-defizienten und nicht-Dsg3-defizienten Geschwistertieren isoliert. Entsprechend der vorhergehenden Befunde zeigten die Dsg3-defizienten Zellen eine deutliche Zunahme der Dsg2-Membranlokalisation sowie zusätzlich eine erhöhte DSG2-mRNA-Expression, allerdings bei unveränderten Dsg2-Proteinmengen. Weiterhin wurde die Funktion von Dsg2 und Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher untersucht. Der für Dsg3 identifizierte Komplex mit der phosphorylierten Form der p38MAPK (p-p38MAPK) konnte für Dsg2 nicht nachgewiesen werden. Ebenso führte eine Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge, im Gegensatz zur Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge, nicht zur Aktivierung der p38MAPK und einer Retraktion des Zytoskeletts. Der direkte Zusammenhang zwischen einem Dsg3-Funktionsverlust und der p38MAPK-Aktivität ließ sich dadurch bestätigen, dass sowohl die Keratinretraktion als auch der Haftungsverlust nach Dsg3-Depletion durch den Einsatz eines p38MAPK-spezifischen Inhibitors partiell inhibierbar waren. Auch in primären Keratinozyten mit vollständiger Dsg3-Defizienz verbesserte eine p38MAPK-Inhibierung die Zelladhäsion. Ebenso wurde in Dsg3-defizienten Zellen im Vergleich zu Zellen mit endogener Dsg3-Expression eine deutliche Lokalisation der p-p38MAPK an der Zellmembran nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass möglicherweise in Abwesenheit von Dsg3 andere Membranproteine an der Regulation dieses Signalweges beteiligt sind. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine bisher nicht beschriebene Funktion von Dsg2 als Kompensationspartner für Dsg3 in Keratinozyten identifiziert und die Rolle von Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher charakterisiert. / Desmogleins (Dsg1-4) are transmembrane adhesion proteins and members of the protein family of desmosomal cadherins which mediate cell-cell adhesion of adjacent keratinocytes inside and outside of desmosomes. Autoantibody-induced loss of binding of these proteins (mainly Dsg1 and Dsg3) results in the phenotype of Pemphigus vulgaris (PV). The patients suffer from erosions and lesions in skin and mucous membranes. Hallmarks of the disease on cellular level are the retraction of the keratin intermediate filaments, a depletion of Dsg3 and a modulation of several signaling pathways, e.g. p38MAPK. PV is therefore an important disease model to study the role of desmosomal cadherins for intercellular adhesion in keratinocytes. Numerous research groups confirmed the importance of Dsg3 as an adhesion protein and furthermore investigated a contribution of Dsg3 to signaling pathways in PV pathogenesis. In contrast, up to now no specific function for the desmosomal cadherin Dsg2 has been identified in the epidermis. Dsg2 is the only desmoglein isoform that is ubiquitously expressed in all desmosome-containing tissues and can also be identified in the cell-cell contacts of the myocardium and the intestinal epithelium in which Dsg1 and Dsg3 are absent. In both tissues, Dsg2 plays an important role as adhesion protein or regulator of intracellular processes. Therefore, in the present study the relevance of the two desmosomal cadherins Dsg2 and Dsg3 for intercellular adhesion was compared and their roles as modulators of the p38MAPK pathway were studied. Basic differences were identified in the localization of both proteins: Dsg2 was restricted to keratinocytes in the hair follicle in adult human skin, whereas Dsg3 was located in the basal and the suprabasal layers of the epidermis. In differentiated HaCaT cells, an immortalized keratinocyte cell line Dsg2 localization appeared to be punctuated along the cell membrane whereas Dsg3 showed a linear distribution. Accordingly, Dsg2 was predominantly detectable in the cytoskeleton-anchored, desmosome-containing protein pool after Triton-X-100-mediated cell fractionation predominantly. Using Dsg-specific antibodies which were proven to be inhibitory in cell-free studies by atomic-force microscopy, loss of cell cohesion was detectable after targeting of Dsg3 only. In contrast, the same Dsg2-specific antibody induced a significant loss of cell-cell cohesion in an intestinal epithelial cell line. Interestingly, the siRNA-mediated reduction of Dsg2-protein levels induced a loss of cell cohesion under conditions of increased shear only. The simultaneous modulation of Dsg2 and Dsg3 by siRNA or by incubation of Dsg2-depleted cells with AK23, a pathogenic Dsg3-specific antibody, led to a drastic and partially p38MAPK-dependent loss of cell-cell adhesion. This indicated a compensatory role of Dsg2 under impaired Dsg3-function in keratinocytes. Therefore, in further studies the distribution of Dsg2 after transfection with Dsg3-specific siRNA was investigated. Indeed, Dsg3-depleted keratinocytes demonstrated a pronounced and linearized distribution of Dsg2 along the cell membrane which corroborated the hypothesis of Dsg2 compensating for Dsg3 under conditions of reduced Dsg3-binding properties. To further investigate the function of Dsg2 under conditions of complete loss of Dsg3, primary murine keratinocyte were isolated from Dsg3-knockout mice and their wild-type littermates. According to the results of the cell-culture model, Dsg3-deficient primary keratinocytes showed a prominent membrane localization of Dsg2 and increased levels of DSG2-mRNA but not of Dsg2-protein. Next, the function of Dsg2 and Dsg3 as modulators in the p38MAPK signaling pathway was investigated. The recently identified complex of Dsg3 with phosphorylated-p38MAPK (p-p38MAPK) was not detectable after Dsg2 immunoprecipitation. According to this, depletion of Dsg2 in contrast to Dsg3 did not result in activation of p38MAPK and p38MAPK-dependent keratin retraction. The protective effect of p38MAPK inhibition on both loss of cell-cell adhesion as well as keratin retraction after Dsg3-depletion confirmed the direct relation between loss of Dsg3-function and p38MAPK activation. Similarly, in primary murine keratinocytes lacking Dsg3, inhibition of p38MAPK was effective to improve cell adhesion. In these cells a more pronounced membrane localization of p-p38MAPK was detectable. This indicates that other membrane proteins play a role as regulators of this signaling molecule under conditions of Dsg3-deficiency. In summary, the results of this work identify a novel function for Dsg2 as compensation partner for Dsg3 and further characterize the role of Dsg2 and Dsg3 as modulators of the p38MAPK signaling pathway in keratinocytes.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2009.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2009.

Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung der Haut. Ein wesentliches Charakteristikum der Erkrankung sind Autoantikörper, welche gegen die humanen Zell-Adhäsionsmoleküle Desmoglein (Dsg) 3 und 1 gerichtet sind und zu zunehmender Zell-Dissoziation der Keratinozyten führen (Akantholyse). Neben der Dsg3-Reorganisation sind zytoskelettale Veränderungen in Form einer ZK-Retraktion und einer Reorganisation des Actin-Zytoskeletts als ein wichtiges Merkmal akantholytischer Zellen beschrieben worden. Dennoch ist der zeitliche Verlauf und die funktionelle Relevanz dieser zytoskelettalen Veränderungen im Vergleich zu anderen Prozessen, wie der Dsg3-Reorganisation oder der Zell-Dissoziation, unklar. In dieser Arbeit wurde daher die Rolle der ZK-Filamente und der Actinfilamente für die PV-Pathogenese untersucht. Inkubation von kultivierten Keratinozyten mit PV-IgG resultierte in einer ZK-Retraktion, welche eng mit dem Beginn der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierte. Weiterhin fand sich eine Abhängigkeit der PV-IgG-induzierten ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation von der p38MAPK-Signalkaskade, während die Beteiligung der p38MAPK an der Dsg3-Reorganisation von untergeordneter Rolle zu sein scheint. Übereinstimmend dazu führte eine Überexpression von E-Cadherin zu einer Hemmung der p38MAPK-Aktivierung, der ZK-Retraktion und der Zell-Dissoziation, so dass den Cadherinen eine übergeordnete Rolle in der Vermittlung der PV-Pathogenese zuzukommen scheint. Neben einer ZK-Retraktion zeigten die Zellen als Reaktion auf eine Inkubation mit PV-IgG auch wesentliche Reorganisationen der Actinfilamente, welche ebenfalls eng mit der Dsg3-Reorganisation und der Zell-Dissoziation korrelierten. Darüber hinaus interferierte die pharmakologische Modulation des Actin-Zytoskeletts mit den PV-IgG-Effekten. So führte eine Stabilisierung der Actinfilamente zu einer Reduktion sowohl der Dsg3-Reorganisation als auch der Zell-Dissoziation, während eine Zerstörung der Filamente die Effekte verstärkte. Zur Unterstützung dieser Ergebnisse wurde die Rolle des Actins für die durch Rho-GTPasen vermittelte Hemmung von PV-IgG-Effekten untersucht. Eine Aktivierung der Rho-GTPasen führte neben einer Hemmung PV-IgG-vermittelter Effekte auch zu einer Verstärkung des kortikalen Actin-Rings, während eine Hemmung der Actin-Polymerisation die protektiven Effekte der Rho-GTPasen-Aktivierung aufheben konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine übergeordnete Rolle sowohl der desmosomalen als auch der klassischen Cadherine für die PV-Pathogenese zeigen. Daneben scheint auch der Actin-Reorganisation eine wesentliche Position zuzukommen. Die ZK-Retraktion hingegen scheint, zumindest im Bezug auf die Dsg3-Reorganisation, sekundär zu sein, trägt aber möglicherweise im Anschluss an eine p38MAPK-Aktivierung wesentlich zum Verlust der Zell-Zell-Adhäsion bei. / In human autoimmune blistering skin disease pemphigus vulgaris (PV) autoantibodies are mainly directed against keratinocyte cell adhesion molecules desmoglein (Dsg) 3 and 1 and cause keratinocyte cell dissociation (acantholysis). Early ultrastructural work revealed cytokeratin (CK) retraction to be a characteristic hallmark of acantholytic keratinocytes and recent studies reported profound alterations of the actin cytoskeleton. Nevertheless, the temporal sequence and relevance of these cytoskeletal phenomena in pemphigus pathogenesis compared to other events such as Dsg3 reorganisation or keratinocyte dissociation are only poorly understood. We examined roles of CK and actin filaments in PV-IgG-mediated keratinocyte dissociation. Incubation of cells with PV-IgG resulted in a CK retraction which closely correlated with the onset of cell dissociation and Dsg3 reorganisation. Both, PV-IgG-induced CK retraction and cell dissociation were found to be p38MAPK-dependent whereas the contribution of p38MAPK activation for Dsg3 reorganisation seemed to be secondary. According to this, overexpression of E-cadherin prevented PV-IgG-induced p38MAPK activation, cell dissociation and CK retraction. Therefore cadherins seem to have a primary role for PV pathogenesis. Parallel to CK retraction, PV-IgG treatment resulted in striking changes in actin cytoskeleton organization which also closely correlated with cell dissociation and Dsg3 reorganisation.Therefore, we investigated whether pharmacologic manipulation of actin polymerization modulates pathogenic effects of PV-IgG. Pharmacological stabilization of actin filaments significantly blocked cell dissociation and Dsg3 fragmentation whereas actin depolymerisation strongly enhanced pathogenic effects of PV-IgG. To substantiate these findings, we studied whether the protective effects of Rho GTPases, which are potent regulators of the actin cytoskeleton and were shown to be involved in pemphigus pathogenesis, were dependent on modulation of actin dynamics. Activation of Rho-GTPases enhanced the cortical junction-associated actin belt and blunted PV-IgG-induced cell dissociation. However, when actin polymerization was blocked under these conditions the protective effects of Rho-GTPase activation were abrogated. Taken together, these experiments indicate a primary role of both desmosomal and classical cadherins for PV pathogenesis. Furthermore actin reorganization seems to be critical for PV-IgG-induced acantholysis. CK retraction may contribute to p38MAPK-dependent keratinocyte dissociation in pemphigus but appears to be secondary, at least to Dsg3 reorganisation.