Os insetos da subfamília Triatominae Jeannel, 1919 de Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera: Reduviidae), também conhecidos como barbeiros, constituem um grupo amplamente distribuído pela região Neotropical que comporta hoje, 142 espécies ocorrentes e uma fóssil, distribuídas em 18 gêneros, são insetos hematófagos estritos em todas as fases da vida e reconhecidos vetores da Doença de Chagas. Essa enfermidade é considerada um dos mais importantes problemas de saúde na América Latina, com cerca de 12 a 14 milhões de indivíduos chagásicos, 60 milhões vivendo em risco e cerca de 20.000 caso/ano em 18 países da América do Sul e Central. Neste estudo foram analisadas seqüências de nucleotídeos dos genes 16S e CitB mitocondrial em populações de triatomíneos, dos gêneros Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 e Triatoma Laporte, 1832, mantidos em colônias no insetário Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA) - SP, comparando-as com seqüências dos mesmos genes disponíveis no GenBank. Os fragmentos obtidos variaram de 311 a 317 pb (16S) e 393 pb (CitB). Observou-se baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas do gene 16S, enquanto o gene CitB mostrou-se mais polimórfico, podendo ser utilizado para estudos de populações geográficas. As seqüências geradas foram alinhadas com seqüências dos mesmos genes para outros triatomíneos e também de Arilus cristatus Linaeus, 1763 (Hemiptera: Reduviidae: Harpactorinae) (16S e CitB) e Oncerotrachelus sp. Stål, 1868 (Hemiptera: Reduviidae: Saicinae) (16S). As relações entre as espécies foram avaliadas pelos métodos de Distância (Neighbor Joining), Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança. As análises de fragmentos para os dois genes demonstraram a parafilia de Rhodniini e Triatomini, confirmando resultados anteriores. Evidenciou-se a possível origem dos "Triatomas" Neotropicais a partir de derivações de Triatomas Neárticos, verificada pela estreita relação genética de Panstrongylus e Triatoma vitticeps (Stål, 1859) com o ramo Norte-Centro Americano de Triatoma; por meio das relações com T. protracta (Uhler, 1894), Dipetalogaster maxima (Uhler, 1894) e T. dimidiata Latreille, 1811. É dada a conhecer a primeira seqüência de bases nitrogenadas de fragmentos do gene 16S para Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. Os resultados mostraram a utilidade de 16S e CitB como marcadores moleculares de espécies e de populações de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia, no entanto, exigem um alto grau de segurança e controle de contaminação. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores e o uso de caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento, indispensáveis para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle. As colônias de triatomíneos do SESA revelaram-se importante fonte de material para estudos sistemáticos de triatomíneos, pois compreendem amostras significativas de várias populações triatomínicas da América, principalmente de espécies consideradas vetores principais do mal de Chagas como Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 e Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Algumas questões sistemáticas relativas a origem e relacionamento filogenético dos triatomíneos continuam em aberto; novos reagrupamentos serão necessários para que a Subfamília continue válida; Análises mais completas, com a inclusão de representantes das tribos Alberproseniini, Bolboderini e Cavernicolini, são ainda necessárias. / The insects of the Triatominae subfamily Jeannel, 1919 of Reduviidae (Hemiptera: Heteroptera), also known as triatomine bugs, constitute a widely distributed group in the Neotropical region and including 142 current species and a fossil one, distributed in 18 genera. They are strict hematophagic insects in all phases of their life cicle and recognized vectors of the Chagas disease. This disease is considered one of the most serious Health problem in Latin America, with about 12 the 14 million of chagasic individuals, 60 million people living at risk and about 20,000 cases/year in 18 Central and South American countries. In this study mitocondrial 16S and CytB nucleotide sequences were analyzed in populations of triatomine bugs of the genera Panstrongylus Berg, 1879, Rhodnius Stål, 1859 and Triatoma Laporte, 1832 from colonies maintained in the Insectary of Special Health Service of Araraquara - SESA (acronym in Portuguese), Araraquara- SP, comparing them with sequences of the same available genes deposited in the GenBank. The obtained fragments varied from 311 to 317 bp (16S gene) and 393 pb (CytB). Low intra-specific variation among the genetic distance of the 16S gene, while the CytB gene revealed a higher polymorphism, being able to be used in geographic population studies. The generated sequences were aligned with sequences of the same genes for other triatomine bugs and also with Arilus cristatus Linaeus, 1763 (16S and CytB) and Oncerotrachelus sp Stål, 1868 (16S). The relationships among the species had been evaluated by the methods of Distance (Neighbor Joining), Maximum Parsimony and Maximum Likelihood. The analyses of fragments for the two genes had demonstrated the paraphily of Rhodniini and Triatomini, confirming previous results. It was hypothesized the possible origin of the Neotropical "Triatomas" from derivations of Nearctic triatomes, verified for the narrow genetic relation of Panstrongylus and Triatoma vitticeps (Stål, 1859) with the North-Center American branch of Triatoma by the relationships with T. protracta (Uhler, 1894), D. maxima (Uhler, 1894) and T. dimidiata Latreille, 1811. It is known the first sequence of nitrogen bases of fragments of the 16S gene for Triatoma sherlocki Papa, Jurberg, Carcavallo, Cerqueira e Barata, 2002. The results had shown the utility of 16S and CytB as markers of species and of triatomine populations and their importance in systematic and taxonomy questions. However, demands one high degree of security and control of contamination. There is a necessity of new studies involving other molecular markers and the use of classic systematic characters of morphology, ecology and behavior, indispensable for systematic decisions adjusted a time, that would have not only systematic impact but, for the control strategies. The colonies of triatomine of the SESA had shown important source of material for systematic studies of this kind of insect, since they include significant samples of triatomine populations of America, mainly of species considered the main vectors of the Chagas disease such as Triatoma infestans (Klug, 1834), Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), Rhodnius prolixus Stål, 1859 and Triatoma brasiliensis Neiva, 1911. Some systematic questions related to the origin and phylogenetic relationship of the triatomine bugs have kept opened; new regroupings will be necessary so that the Subfamily continues valid; more complete analyses, with the inclusion of representative members of the Alberproseniini, Bolboderini and Cavernicolini tribes, are still necessary.

O tratamento da doença de Chagas é recomendado em pacientes na fase crônica indeterminada com a finalidade de reduzir a carga parasitária, o desenvolvimento de manifestações clínicas tais como as cardiomiopatias e episódios de reativação. Os métodos sorológicos constituem o padrão ouro para a definição de cura pós tratamento, porém não avaliam a carga parasitária tecidual, podendo demorar muitos anos até a soronegativação, enquanto os métodos parasitológicos apresentam baixa sensibilidade na fase crônica. No presente estudo a hemocultura, microscopia ótica, PCR em tempo real (qPCR) e imunoistoquímica foram usados para monitorar a carga parasitária em sangue e órgãos de camundongos Swiss infectados com 2x103 formas da cepa Y de T. cruzi. Foram analisados animais não tratados (NT), tratados somente na fase aguda (TA), somente na fase crônica (TC) e em ambas as fases da infecção (TAC). O tratamento foi realizado com 100 mg/Kg/dia de benznidazol durante 20 dias consecutivos. Amostras foram coletadas no 13º dpi, 26º dpi e 61º dpi (pico da fase aguda, final da fase aguda e fase crônica). Na fase crônica da infecção a microscopia ótica e a hemocultura encontraram 0 e 25% de amostras positivas, respectivamente, e com a qPCR as cargas parasitárias de todas amostras foram quantificadas ao longo do experimento, independentemente do grupo. No 13º dpi, os animais NT apresentaram 16.630,4 enquanto os TA 6.153,6 parasitos/ml de sangue (p<0,05). Os animais TAC foram os que tiveram a maior redução da carga parasitária em sangue e órgãos, muito embora também tenha havido redução nos animais TA (cérebro e coração) e TC (cérebro, coração, músculo e rim) em relação aos NT. Da fase aguda para a crônica houve redução da carga parasitária tanto em sangue quanto em órgãos (mais acentuada). Nos animais NT no 61º dpi, o sangue apresentou carga parasitária comparável a do coração, tecido adiposo, pulmão, intestino, baço e fígado, enquanto nos animais TAC o sangue foi o material biológico com a maior carga parasitária, confirmando que a parasitemia pode e deve ser utilizada para o diagnóstico e monitoramento da infecção por T. cruzi no organismo, em todas as fases da infecção. Ademais, o tecido adiposo atuaria como reservatório de T. cruzi no organismo, uma vez que a carga parasitária sofreu menor redução neste tecido após tratamento. A técnica de imunoistoquímica, realizada em amostras de tecido adiposo e cardíaco, confirmou os resultados da qPCR, fato importante especialmente no 61º dpi, quando as cargas parasitárias foram muito baixas. Portanto, o tratamento realizado em ambas as fases da infecção chagásica seria o mais eficaz para alcançar a redução da carga parasitária de T. cruzi no organismo, em relação ao tratamento realizado apenas uma vez. A qPCR, técnica extremamente sensível, poderia ser empregada para o monitoramento da parasitemia em pacientes tratados na fase crônica indeterminada, detectando falhas terapêuticas ou confirmando a cura etiológica. / The treatment of Chagas disease has been recommended in patients in the chronic indeterminate phase to reduce the parasite load, the development of clinical manifestations such as cardiomyopathies and episodes of reactivation. Serological methods are the gold standard for the definition of cure after treatment, but they do not evaluate the parasite load in tissues, and may take many years until reversion, while parasitological methods have low sensitivity in the chronic phase. In the present study, blood culture, optical microscopy, real-time PCR (qPCR) and immunohistochemistry were used to monitor the parasite load in blood and organs of Swiss mice infected with 2x103 forms of the T. cruzi Y strain. Untreated (NT) animals, treated only in the acute phase (TA), only in the chronic phase (TC) and in both phases of the infection (TAC) were analyzed. The treatment was performed with 100 mg/kg/day of benznidazole for 20 consecutive days. Samples were collected at the 13th dpi, 26th dpi and 61st dpi (peak of acute phase, end of acute phase and chronic phase). In the chronic phase of the infection, optical microscopy and blood culture found 0 and 25% of positive samples, respectively, and with qPCR the parasite load levels of all samples were quantified throughout the experiment, regardless of the group. At the 13th dpi, the NT animals presented 16,630.4 whereas the TA animals had 6,153.6 parasites/ml (p<0.05). TAC animals were the ones that had the greatest reduction of the parasite load in blood and organs, although there was also reduction in the TA (brain and heart) and TC (brain, heart, muscle and kidney) animals in relation to NT. From the acute phase to the chronic one there was reduction of the parasite load in both, blood and organs (more pronounced). In NT animals at the 61º dpi, blood samples presented parasite load levels comparable to that of the heart, adipose tissue, lung, intestine, spleen and liver, while in the TAC animals blood was the biological sample with the highest parasite load, confirming that parasitemia can and should be used for the diagnosis and monitoring of T. cruzi infection in the body at all stages of infection. In addition, the adipose tissue would act as reservoir of T. cruzi in the organism, since the parasite load suffered a smaller reduction in this tissue after treatment. The immunohistochemical technique, performed on adipose and cardiac tissues, confirmed the results of qPCR, an important fact especially in the 61º dpi, when parasite load levels were very low. Therefore, the treatment performed in both phases of the chagasic infection would be the most effective to achieve the reduction of parasite burden of T. cruzi in the organism, in comparison with the treatment performed only once. The qPCR, an extremely sensitive and timely technique, could be used to monitoring parasitemia in patients treated in the indeterminate chronic phase, detecting therapeutic failures or confirming the etiological cure.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-18T12:02:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE DOUTORADO COM CORREÇOES.pdf: 10540720 bytes, checksum: f145a8c9fdeee7916351a8189dd086ab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T12:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE DOUTORADO COM CORREÇOES.pdf: 10540720 bytes, checksum: f145a8c9fdeee7916351a8189dd086ab (MD5) Previous issue date: 2015-08-25 / FACEPE / A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, constitui-se um dos maiores problemas de saúde pública em países do cone sul das Américas, pela sua vasta distribuição, altos índices de prevalência e gravidade de evolução. Embora o nifurtimox ainda seja utilizado em alguns países, o único fármaco atualmente disponível para a quimioterapia anti-Chagásica no Brasil é o benznidazol. No entanto, é ineficaz frente ao estágio crônico da doença e seu uso está associado à incidência de efeitos colaterais graves, o que torna imprescindível a busca por novos fármacos anti-T. cruzi. Para o desenvolvimento de um tratamento farmacológico apropriado, é necessária a descoberta de novos alvos terapêuticos no parasito, entre os quais se destaca a cruzaína, uma cisteína protease essencial à sua sobrevivência. As tiossemicarbazonas constituem uma classe de compostos bastante examinada devido a sua versatilidade química e ampla gama de atividades farmacológicas, com destaque para sua potencial atividade inibitória frente à enzima cruzaína. Com base nisso, foi planejada a síntese de uma série de 32 inéditas aril-tiossemicarbazonas (38a-l; 39a-t) através da o–alquilação de fenóis com 2-haloacetofenonas em meio básico, seguida pela condensação entre as acetofenonas e tiossemicarbazidas em meio ácido. A elucidação estrutural foi realizada por RMN 1H, RMN 13C, IV; a pureza foi determinada por análise elementar e a estrutura cristalográfica caracterizada pela difração de raios-X. A avaliação antiparasitária foi determinada frente às formas epimastigota, amastigota e tripomastigota do T. cruzi, ao passo que a citotoxicidade contra células hospedeiras foi avaliada em esplenócitos e fibroblastos. Ademais, analisou-se o processo de morte celular induzido pelos compostos, bem como a inibição causada por eles sobre a enzima cruzaína. A rota sintética empregada forneceu as aril-tiossemicarbazonas (38a-l; 39a-t) com rendimento e pureza aceitáveis. A análise de RMN indicou a presença de isômeros, de tal maneira que a estrutura cristalográfica obtida revelou a geometria e a configuração dos compostos obtidos. Já a avaliação da atividade antiparasitária, revelou que a maioria dos compostos exibiu atividade superior ao benznidazol contra as formas extracelulares do T. cruzi, com destaque para os compostos 39a e 39c, que mostraram atividade antiparasitária ampla e seletiva. O composto 39c, por sua vez, foi o mais seletivo contra as formas extracelulares do parasita e não apresentou citotoxicidade sobre esplenócitos de camundongo em altas concentrações. Por outro lado, estas aril-tiossemicarbazonas demonstraram, de um modo geral, baixa seletividade frente à forma amastigota do parasito. Além disso, 14 dos compostos testados inibiram a cruzaína com percentuais de inibição superiores a 70%, denotando que as alterações na conformação molecular e planaridade das tiossemicarbazonas aumentaram a afinidade pelo sítio de ligação da enzima. As tiossemicarbazonas 39i e 39n revelaram-se potentes inibidores, comparáveis ao composto de referência, K11777. Por último, foi observado que o tratamento baseado nestas tiossemicarbazonas causou morte celular de tripomastigotas por necrose. Enfim, o planejamento estrutural efetuado permitiu compreender aspectos químicos e relações estrutura-atividades de novas aril-tiossemicarbazonas. Consequentemente, isto resultou na triagem e identificação de inéditas aril-tiossemicarbazonas dotadas de atividade anti-T. cruzi de amplo espectro de ação, que afetam a ação da cruzaína e subsequentemente levam a morte celular por necrose. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, it constitutes one of the major public health problems in southern cone countries of the Americas for its wide distribution, high rates of prevalence and severity of evolution. Although nifurtimox is still used in some countries, the only drug currently available for anti-chagasic chemotherapy in Brazil is benznidazole. However, it is ineffective against the chronic stage of the disease and is associated with serious side effects, which makes it essential to search for new drugs anti-T. cruzi. For developing an appropriate drug treatment, the discovery of new therapeutic targets in the parasite is necessary, among which stands out the cruzain, a cysteine protease essential for their survival. The thiosemicarbazones are a class of compounds quite examined due to its chemical versatility and wide range of pharmacological activities, highlighting its potential inhibitory activity against the enzyme cruzain. Based on this, it was planned synthesis of a series of novel 32 aryl-thiosemicarbazones (38a-l, 39a-t) by o-alkylation of phenols with 2-haloacetofenonas in basic medium, followed by condensation between acetophenone and thiosemicarbazides in acidic medium. The structural elucidation was performed by 1H NMR, 13C NMR, IR; purity was determined by elemental analysis and the crystal structure characterized by X-ray diffraction. The evaluation antiparasitic was given front of the epimastigote, amastigote and trypomastigote forms of T. cruzi, while the cytotoxicity was evaluated against host cells in splenocytes and fibroblasts. Furthermore, it was examined whether the cell death induced by the compounds, as well as inhibition caused by them on the enzyme cruzain. The employed synthetic route provided the aryl thiosemicarbazones (38a-l, 39a-t) with acceptable yield and purity. NMR analysis indicated the presence of isomers, such that the crystal structure obtained showed the geometry and configuration of the compounds obtained. Since the evaluation of antiparasitic activity, revealed that most of the compounds exhibited superior activity to benznidazole against extracellular forms of T. cruzi, especially the compounds 39a and 39c, which showed broad and selective antiparasitic activity. Compound 39c, in turn, was the most selective against extracellular forms of the parasite and showed no cytotoxicity against mouse splenocytes in high concentrations. On the other hand, these aryl thiosemicarbazones shown, generally, low selectivity towards the amastigote form of the parasite. Furthermore, 14 of the tested compounds inhibited cruzain with inhibition percentage higher than 70%, indicating that the changes in molecular conformation and planarity of thiosemicarbazones increased affinity for the enzyme binding site. The thiosemicarbazones 39i and 39n have proved to be potent inhibitors comparable to the reference compound, K11777. Finally, it was observed that treatment based on these thiosemicarbazones caused cell death of trypomastigotes by a necrotic pathway. In the end, the structural planning made possible understand chemical aspects and structure-activity relationships of new aryl thiosemicarbazones. Consequently, this resulted in the screening and identification of inedited aryl thiosemicarbazones endowed with antiparasitic activity of broad spectrum of action, affecting the action of cruzain and subsequently leading to cell death by necrosis.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-08T13:48:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DANILO FONTES_PPGCF_UFPE.pdf: 6750693 bytes, checksum: ec0d551dfa4fb27855a7caf940d95aab (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T13:48:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_DANILO FONTES_PPGCF_UFPE.pdf: 6750693 bytes, checksum: ec0d551dfa4fb27855a7caf940d95aab (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / FACEPE / Os hidróxidos duplos lamelares (HDL), também conhecidos como compostos tipo hidrotalcita, são materiais capazes de incorporar espécies biologicamente ativas, negativamente carregadas, na sua região interlamelar, de modo a neutralizar as cargas po-sitivas das lamelas, através do mecanismo de troca iônica. Além deste mecanismo, os HDL possuem alta capacidade de adsorção de materiais não iônicos e carregados positivamente, através de interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio na sua vasta área superficial. Os HDL possuem ocorrência natural e também podem ser sintetizados em laboratório por rotas simples e de baixo custo, que permitem o isolamento de sólidos de alta pureza. O presente trabalho tem por objetivo a síntese e caracterização de HDL (CaAl-HDL e MgAl-Cl-HDL), e sua aplicação junto aos fármacos antiretrovirais Efavirenz (EFZ) e Zidovudina (AZT), e do anti-chagásico Benznidazol (BNZ). Os materiais obtidos foram caracterizados pelas técnicas de difração de raios-X (DRX), termogravimetria (TG), calorimetria exploratória diferencial (DSC), análise térmica diferencial (DTA), espectroscopia no infravermelho (IV), microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia de luz polarizada e análise elementar de metais e de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN). Foi possível observar que em sistemas com HDL de cálcio e alumínio (CaAl-HDL), obtido pelo método de evaporação do solvente, contendo até 30% de EFZ e até 20% do BNZ, o fármaco tornou-se uma molécula com características amorfas, perdendo seu caráter cristalino. Este fenômeno pôde ser comprovado através da ausência de planos cristalinos do fármaco no DRX, e também do seu ponto de fusão no DSC. Nos testes de liberação, estes sistemas obtiveram destaque no incremento de solubilidade, sendo a proporção HDL-EFZ 30% a mais promissora, com aumento de 558% do EFZ solúvel em relação ao fármaco isolado; e o sistema HDL-BNZ 20%, proporcionando 702% de aumento na solubilidade do fármaco. Desta maneira comprovou-se que associação entre o CaAl-HDL e o BNZ e EFZ (fármacos de baixa solubilidade) confere incremento de solubilidade, promovendo uma maior taxa de dissolução nos estudos in vitro. A solubilidade aquosa de um fármaco constitui requisito prévio à absorção e obtenção de resposta clínica, para a maioria dos medicamentos administrados por via oral. No sistema contendo MgAl-Cl-HDL e AZT, obtido pelo método de síntese por co-precipitação a pH constante, foi possível notar que, o fármaco tornou-se amorfo através da interação com a superfície do HDL, como evidenciado através do DRX, TG, IV e MEV. No estudo de liberação, foi possível obter um perfil de liberação prolongada do AZT, de 90% de fármaco em 24 horas de estudo. Os sistemas CaAL-HDL:EFZ e MgAl-Cl-HDL:AZT tornaram-se menos tóxicos quando comparados a seus respectivos fármacos isolados, enquanto o sistema CaAL-HDL:BNZ, não alterou a toxicidade do BNZ, quando testados em linhagem de macrófagos humanos. / Layered double hydroxides (LDH), also known as hydrotalcite compounds, are materials able to incorporate biologically active species, negatively charged, into the interlayer region, to neutralize the positive charges of the lamellae through the ion exchange mechanism. Besides this mechanism, LDH have a high adsorption capacity for positively charged non-ionic materials, through electrostatic interactions and hydrogen bonds on its vast surface area. LDH are found in nature and can also be synthesized by simple and low-cost routes, that allow for the isolation of high purity solids. This paper presents the synthesis and characterization of the LDH (CaAl-LDH e MgAl-Cl-LDH), its applications with the antiretroviral drugs efavirenz and zidovudine, and the anti-chagas drug Benznidazol. The materials were characterized by the techniques of x-ray diffraction (XRD), thermogravimetry (TG), differential scanning calorimetry (DSC), differential thermal analysis (DTA), infrared spectroscopy (IR), scanning electron microscopy (SEM), polarized light microscopy, and elemental analysis of metals and carbon, hydrogen and nitrogen (CHN). It was observed that in systems with CaAl-HDL, obtained by the solvent evaporation method, containing up to 30% of EFZ and 20% of BNZ, the drug became a molecule with amorphous characteristics, losing its crystalline character. This phenomenon could be demonstrated by the absence of the drug crystal planes in the XRD analysis, and also by its melting point in the DSC analysis. In the release experiments, these systems stood out because they promoted an increase in solubility, with LDH-EFZ 30% being the most promising, with an increase in the EFV solubility of 558% compared to the drug itself; and the LDH-BNZ 20% system providing a 702% increase in solubility. Thus, the association between CaAl-LDH and BNZ and EFZ (low solubility drugs) was proven to increase the solubility of these drugs, promoting a higher dissolution rate in in vitro studies. The aqueous solubility of a drug is a prerequisite for obtaining absorption and clinical response for most drugs administered orally. In the system containing MgAl-Cl-LDH and AZT, obtained by the method of co-precipitation at constant pH, it was noticeable that, after the synthesis, the drug became amorphous due to the interaction with the surface of the LDH, as evidenced by the XRD, TG, SEM, and IR analyses. In the release study, it was possible to obtain a profile of the prolonged release of AZT, 90% of the drug in a 24-hour experiment. The cell viability experiment showed that the CaAl-LDH:EFZ and MgAl-Cl-HDL:AZT systems became less toxic than the isolated drugs and the CaAl-HDL:BNZ system did not alter the toxicity of the drug itself, when tested in human macrophage lineage.

A doença de Chagas é uma doença crônica causada pela infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T.cruzi). A sua principal consequência clínica é o desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), que acomete 30% dos pacientes. Não foi determinado um indicador de evolução para a CCC ou permanência na forma indeterminada assintomática da doença de Chagas. Diversos trabalhos têm mostrado alterações no perfil de expressão gênica e proteômica ocorridas na fase aguda e crônica da doença de Chagas experimental e humana. Tais alterações advêm da regulação estabelecida em diversos estágios da expressão gênica e podem ser fatores relevantes no prognóstico da doença. Neste contexto, os microRNAs (miRs), podem exercer uma importante função reguladora. Sua ação se dá pela associação a um RNA mensageiro (RNAm) alvo, inibindo sua tradução ou degradando este transcrito. Assim, a hipótese deste trabalho é a de que a infecção aguda por T. cruzi modula a expressão de miRs no miocárdio de camundongos. Foi avaliado por qRT-PCR o perfil de expressão de miRs 15, 30 e 45 dias após a infecção. O perfil de expressão de miRs resultante foi suficiente para segregar os grupos de acordo com o tempo da infecção. O número de miRs diferencialmente expressos aumentou com a progressão da infecção. Além disso, seis miRs tiveram sua expressão correlacionada à piora na parasitemia e intervalo QTc dos animais: miR-142-3p miR-142-5p, miR-145, miR-146b, miR-149 e miR-21. Análises de correlação realizadas com todos os miRs avaliados ressaltaram este mesmo grupo de miRs entre os mais significativamente correlacionados, além de outros 73 correlacionados com a parasitemia, 67 com o intervalo QTc e 16 com ambos os parâmetros simultaneamente. Nas análises in silico, TNF-alfa e ciclina-D1 foram moléculas nodais recorrentes nas redes criadas com alvos dos miRs diferencialmente expressos em todos os tempos avaliados. Na única rede criada com os miRs correlacionados às alterações na parasitemia e intervalo QTc, TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 e Src foram as moléculas nodais. Este trabalho apresenta de maneira inédita o envolvimento dos miRs durante a infecção aguda por T. cruzi, proporcionando novas perspectivas em relação a potenciais ferramentas terapêuticas e prognósticas / Chagas disease is a chronic illness caused by infection with the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Its main clinical outcome is the development of chronic Chagas cardiomyopathy (CCC), which affects 30% of the patients. The factors that define the progression to CCC or maintenance in the asymptomatic indeterminate form of the disease are still poorly understood. Several studies have presented changes occurred in the gene and proteomic expression profiles in both acute and chronic phases of experimental and human Chagas disease. Such changes result from regulation established at different stages of gene expression and may be relevant for the disease prognosis. In this context, microRNAs (miRs) may play an important regulatory function. miRs act by association to a target messenger RNA (mRNA), inhibiting translation or degrading the transcript. Thus, our hypothesis is that acute infection by T. cruzi modulates the expression of microRNAs in the myocardium of mice. The miR expression profile was evaluated by qRT-PCR 15, 30 or 45 days after the infection. This profile was sufficient to segregate the samples according to the time of infection. The number of differentially expressed miRs was higher as the infection progressed. Moreover, six miRs had their expression correlated with worsening of parasitaemia and QTc interval: miR-142-3p miR-142- 5p, miR-145, miR-146b, miR-149 and miR-21. Secondary unbiased correlation analyses showed this cluster of miRs among the most significant and other 73 miRs correlated with parasitaemia, 67 with QTc and 16 with both parameters simultaneously. In silico target prediction analyses showed TNF-alfa and cyclin-D1 as recurrent nodal molecules of the networks created with miRs targets from all time points. The network generated with miRs correlated to changes in parasitaemia and QTc interval showed TNF-alfa, TGF-beta, Rac1 and Src as nodal molecules. This work points out for the first time the involvement of miRs in the acute infection by T. cruzi, providing new insights about potential diagnostic and prognostic tools

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELENI SOCORRO MARQUES SOUSA.pdf: 2411872 bytes, checksum: 588ba15c010ba33129eff5bfb3f25b33 (MD5) Previous issue date: 2009-05-25 / Introduction: The oral transmission of Chagas disease has been calling the attention in the last few years, especially because of the occurrence of outbreaks due to the ingestion of food such as sugar cane juice, with the possibility of contamination by sylvatic reservoirs of Trypanosoma cruzi, such as Didelphis sp. Objectives: a) Perform a systematic literature review on sugarcane (Saccharum spp) and/or Didelphis sp contamination by T. cruzi; b) Verify the transmission of T. cruzi strains collected from the secretion of the perianal glands of D. albiventris by direct contamination of sugarcane; c) Try to elucidate T. cruzi potential of penetration in sugarcane stalks; d) Assess possible penetration of T. cruzi through sugarcane roots by examining histological sections of stalks inoculated in vivo with this protozoan. Methodology: The study was carried out in two phases: 1) Systematic review of the literature using scientific articles that address the contamination of sugarcane and/or Didelphis sp by T. cruzi, searching for information in Cochrane Library, LILACS, MEDLINE and SciELO, using as descriptors T. cruzi, Didelphis sp, and Saccharum spp. We included in this review the articles published in the American continent from 1909 to October 2008 that presented at least two descriptors associated; 2) Experimental assessment of sugarcane contamination by T. cruzi, in which opossums were experimentally infected by intraperitoneal inoculation with a suspension containing this protozoan and assessed by microhaematocrit technique, culture in LIT (liver infusion tryptose) medium, and PCR. Fragments of sugarcane were contaminated by direct inoculation of T. cruzi suspension collected from the perianal glands of these marsupials. Sugarcane juice was extracted at different intervals, using a manual grinder, and assessed by direct examination and inoculation of mice. Also, histological sections of sugarcane contaminated in vitro and in vivo were performed and analyzed using an optical microscope. Results: After reading and discussing the articles selected, we confirmed the importance of opossums and sugarcane in the transmission of Chagas disease. Nevertheless, only one study approaches directly the object of this research since the others describe experimental contamination of Didelphis sp with different strains of T. cruzi. Given the Abstract xix methods employed herein, this study showed the contamination of sugarcane through the infection of mice up to 6 h after inoculation with strain Y of T. cruzi and up to 4 h with sylvatic P12. This showed plant contamination when inoculated in the tips but not on the surface. However, it was not possible to observe the potential of T. cruzi penetration in sugarcane or the contamination through its roots with the method used during this study, and no protozoan were visualized using an optical microscope. Conclusion: A systematic review of the literature showed the lack of studies on this theme. To the best of our knowledge, this is a pioneer relevant study and lead to the conclusion that the transmission of T. cruzi by sugarcane contaminated wit secretion of the perianal glands of opossums is possible. We suggest the use of other methods for evaluating T. cruzi penetration in sugarcane, and the contamination of this plant through the roots / Introdução: A transmissão oral da doença de Chagas destaca-se na atualidade pela ocorrência de surtos da doença por ingestão de alimentos como caldo de cana, não se descartando a possibilidade de contaminação através de reservatórios silvestres do Trypanosoma cruzi, como os gambás. Objetivos: a) Fazer uma revisão sistemática da literatura abordando a temática da contaminação da cana-de-açúcar (Saccharum spp) e/ou Didelphis sp por T. cruzi; b) Verificar a transmissão de cepas de T. cruzi provenientes das glândulas perianais de D. albiventris por contaminação direta da cana-de-açúcar; c) Buscar elucidar o potencial de penetração de T. cruzi nos tecidos do colmo da cana-de-açúcar; d) Avaliar a possível penetração de T. cruzi através das raízes da cana-de-açúcar inoculada in vivo com este protozoário. Metodologia: Estudo realizado em duas etapas: 1) Revisão sistemática da literatura utilizando artigos científicos que abordam a temática da contaminação da cana-deaçúcar e/ou Didelphis sp por T. cruzi, pesquisando nas bases de dados Biblioteca Cochrane, LILACS, MEDLINE e SciELO, utilizando como descritores T. cruzi, Didelphis sp e Saccharum spp. Participaram da revisão artigos publicados no continente americano no período de 1909 até outubro de 2008 que apresentaram ao menos dois descritores associados; 2) Avaliação experimental da contaminação da cana-de-açúcar por T. cruzi, em que gambás foram infectados experimentalmente por inoculação intraperitoneal de suspensão deste protozoário e avaliados por microhematócrito, cultura em meio LIT (liver infusion tryptose) e PCR. Fragmentos de cana-de-açúcar foram contaminados por inoculação direta de suspensão de T. cruzi proveniente das glândulas perianais desses marsupiais. O caldo de cana foi extraído em diferentes intervalos, com o uso de um moedor manual, e avaliado por exame direto e inoculação em camundongos. Também foram realizados cortes histológicos da cana-de-açúcar contaminada in vitro e in vivo e analisados por microscopia óptica. Resultados: Mediante leitura e discussão dos artigos, observou-se a importância dos gambás e da cana-de-açúcar na transmissão da doença de Chagas. Porém, ao final da análise constatou-se que apenas um estudo tinha maior relação com os objetivos da pesquisa. Nas condições metodológicas empregadas, o estudo mostrou a contaminação da cana-de-açúcar por meio da infecção de camundongos Resumo xvii em até 6 h após a inoculação da cepa Y de T. cruzi e em até 4 h com a cepa P12 silvestre. Isso mostrou que a planta se contaminou quando inoculada na extremidade, mas não quando inoculada na superfície. Entretanto, não foi possível observar o potencial de penetração do T. cruzi na cana-de-açúcar ou a contaminação por via radicular com o método utilizado, não tendo sido visualizados esses protozoários por microscopia óptica nas lâminas confeccionadas. Conclusão: A revisão sistemática da literatuta mostrou a carência de estudos a esse respeito. Os resultados do estudo experimental são inéditos e permitiram concluir que a transmissão de T. cruzi por cana-de-açúcar contaminada com secreção das glândulas perianais de gambás é possível. Sugere-se o emprego de outros métodos para avaliar a penetração de T. cruzi em cana-de-açúcar, bem como para a sua contaminação via radicular

A Doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi, e possui duas fases clínicas, sendo o tratamento com o fármaco benznidazol eficaz somente na fase aguda, porém com diversos efeitos adversos ao longo do período do tratamento. Desta forma, consórcios vêm sendo estabelecidos entre \"governo - universidade - indústria\", com auxilio de capital nacional e estrangeiro para o desenvolvimento de novos fármacos. Apesar de diversas ferramentas disponíveis para o planejamento de novos compostos, a busca por produtos naturais ainda desperta interesse de muitos pesquisadores. Diversos trabalhos vêm descrevendo estudos de síntese e atividade tripanocida de lignanas, as quais merecem destaque, veraguensina (17) e grandisina (18). Devido à falta de tratamento e a alta toxicidade dos agentes disponíveis, este trabalho tem como objetivo sintetizar análogos dessas lignanas, relacionados a derivados de tetraidrofurânicos, furânicos, pirrólicos e de seus intermediários e testa-lasfrente à atividade tripanocida e citotóxica. O planejamento sintético envolveu a geração de derivados 1,4-diaril-2-butino-1,4-diol (28a-t) a partir da reação de condensação entre fenil carbinol (26) e aldeídos arílicos (27a-t) com diferentes padrões de substituiçõescom diversos grupos funcionais. Estes intermediários, obtidos em rendimentos moderados, foram convertidos aos correspondentes 1,4-diaril-1,4-diidroxílicos (30a-g), pela reação de redução em dióxido de platina e, posteriormente, oxidados a 1,4-diaril-1,4-dicetonas (29a-g). A partir da formação dos intermediários 29 e 30, os produtos de interesse, 2,5-diaril-furano (32a-g) e 2,5-diaril-tetraidrofurano (31a-g) foram preparados empregando reações de ciclização na presença de ácidos tríflico e trifluoroacético, respectivamente. Os intermediários e produtos obtidos em rendimentos de moderado a bom, totalizando 48 compostos, foram avaliados em ensaios de atividade tripanocida, envolvendo a cepa Tulahuen de T. cruzi, bem como ensaios de citotoxicidade. Considerando as cinco séries sintetizadas (28, 29, 30, 31 e 32), vale destacar que a maioria apresentou compostos com potente atividade tripanocida, a partir de 1,4 ?M, superior ao fármaco disponível benznidazol (7,9 ?M) e, adicionalmente, não apresentaram citotoxicidade em ensaios realizados por citometria de fluxo. / Chagas\' disease is caused by the Trypanosoma cruzi, whichhas two clinical stages. The treatment with the benznidazole is effective only in the acute stage, although with several side effects throughout the treatment period. Therefore, consortia are being established between \"government - university - industry\", with national and foreign financial support for drug discovery development. In spite of many available tools to design new compounds, the search for natural products still arouse interestfor a great number of researchers. Several papers have described studies of synthesis and trypanocidal activity of lignans, being veraguensin (17) and grandisin (18) worth to mention. Due to the lack of treatment and the high toxicity of the available drugs, this research has the aimto synthesize analogues from the above lignans, such astetrahydrofuran, furanic, pyrrolic derivatives and their intermediates,and test their trypanocidal activity and cytotoxicities. The synthetic strategy was based on the synthesis of 1,4-diarylacetylene-1,4-glycols (28a-t) via condensation reaction between phenyl carbinol (26) and substituted aryl aldehydes (27a-t) with several functional groups at different positionsof the aromatic ring. These intermediates, obtained in moderate yields, were converted to their corresponding 1,4-diaryl-1,4-dihydroxyl derivatives (30a-g) by the reduction reaction using platinum dioxide and, subsequently, oxidized to 1,4-diaryl-1,4-diketones (29a-g). From the synthesis of the intermediates 29 and 30, products of interest, 2,5-diaryl-furan (32a-g) and 2,5-diaryl-tetrahydrofuran (31a-g) were prepared from the cyclization reaction in the presence of the triflic and trifluoracetic acids, respectively. The intermediates and products, obtained in moderate to good yields, in a total of 48 compounds, were assessed in trypanocidal assays, using T. cruzi Tulahuen strain,as well as cytotoxicity assays. Considering the five synthesized series (28, 29, 30, 31 e 32), it is worth noting that the majority of the compounds showed potent trypanocidal activity from 1.4 ?M, higher than the available benznidazole (7,9 ?M) and, additionally, they were not cytotoxicin Flow Cytometry assays.

Os antagonistas adrenérgicos dos receptores ?, tais como o nebivolol, podem reduzir a mortalidade dos pacientes na fase crônica da doença de Chagas causada pelo Trypanossoma cruzi. O nebivolol está disponível na clínica como mistura racêmica dos isómeros d e l com duplo mecanismo de ação. O d-nebivolol é antagonista do receptor adrenérgico ?1, enquanto o l-nebivolol é responsável pelas propriedades vasodilatadoras do fármaco. O nebivolol é metabolizado principalmente por glicuronidação e metabolismo oxidativo dependente do CYP2D6, formando os glicuronídeos do nebivolol e os metabólitos hidroxilados do nebivolol, os quais contribuem para o antagonismo do receptor ?1 adrenérgico. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da doença de Chagas na farmacocinética-farmacodinâmica dos isômeros do nebivolol e seus metabólitos em pacientes idosos metabolizadores rápidos para o CYP2D6. Foram investigados pacientes idosos portadores da doença de Chagas (n = 11) e idosos hipertensos (n = 11) previamente fenotipados como metabolizadores extensivos (EM) ou metabolizadores lentos (PM) para o CYP2D6, usando o metoprolol como fármaco marcador (21 EM e 1 PM). As coletas seriadas de sangue foram realizadas até 48 h após a administração de dose única oral de 10 mg de nebivolol racêmico. As concentrações plasmáticas dos isômeros individuais do nebivolol e glicuronídeos do nebivolol foram avaliadas por LC-MS/MS. O método mostrou linearidade nas concentrações de 15-3000 pg de cada isômero do nebivolol/mL de plasma e de 0,2-125 ng de cada isômero do glicuronídeo do nebivolol/mL de plasma. Os parâmetros farmacocinéticos foram avaliados usando o programa Phoenix (WinNonlin) e expressos em mediana, média e intervalo de confiança 95%. Os testes estatísticos foram utilizados para comparar os parâmetros farmacocinéticos entre os isômeros (teste de Wilcoxon) e entre os grupos (teste de Mann-Whithey); p < 0,05. A farmacocinética do nebivolol é estereosseletiva em pacientes idosos hipertensos portadores (9,7 vs.. 6,1 ng.h/mL) ou não (10,1 vs.. 5,4 ng.h/mL) da doença de Chagas forma crônica fenotipados como metabolizadores rápidos, com observação de maiores valores de AUC para o isômero l-nebivolol. A glicuronidação do nebivolol também é estereosseletiva em pacientes idosos hipertensos portadores (72,9 vs.. 311,6 ng.h/mL) ou não (65,3 vs.. 335,2 ng.h/mL) da doença de Chagas forma crônica fenotipados como metabolizadores rápidos, com observação de maiores valores de AUC para o isômero d-glicuronídeo. A doença de Chagas forma crônica não altera a farmacocinética e a capacidade de glicuronidação de ambos os isômeros do nebivolol em pacientes fenotipados como metabolizadores rápidos. Os valores de clearance do l-nebivolol (48,6 vs.. 14,3 L/h) e do d-nebivolol (48,4 vs.. 20,4 L/h) estimados pelo modelo populacional foram menores para os indivíduos fenotipados como metabolizadores lentos quando comparados com os ii metabolizadores rápidos do CYP2D6. O cálculo da biodisponibilidade dos isômeros individuais do nebivolol para os indivíduos metabolizadores rápidos (9% para o l-nebivolol e 5% para o d-nebivolol) e metabolizadores lentos (42% para o l-nebivolol e 29% para o d-nebivolol) do CYP2D6 permitiu inferir que o clearance não difere entre os isômeros na administração oral. As concentrações plasmáticas de nebivolol obtidas no presente estudo seguindo a administração de dose única oral de 10 mg de nebivolol racêmico a pacientes idosos hipertensos portadores ou não doença de Chagas não foram suficientes para detectar alterações nos intervalos PR, RR e QT, oriundos dos eletrocardiogramas, realizados nos mesmos tempos de colheita das amostras de sangue. Em conclusão, a doença de Chagas na forma crônica não alterou a farmacocinética e a farmacodinâmica dos isômeros do nebivolol nos idosos investigados. / Adrenergic antagonists in ? receptors, such as nebivolol may reduce mortality of patients in the chronic phase of Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi. Nebivolol is available as a racemic mixture of d and l isomers with dual mechanism of action. The d isomer is a ?1 adrenergic receptor antagonist, while the l isomer is responsible for the drug vasodilatory properties. Nebivolol is primarily metabolised by glucuronidation and oxidative metabolism dependent on CYP2D6 to form glucuronide and hydroxylated metabolites of nebivolol, which contribute to the antagonism of adrenergic receptor ?1. This study aims to evaluate the effect of Chagas disease on the pharmacokinetics-pharmacodynamics of nebivolol isomers and its metabolites in CYP2D6 extensive metabolisers elderly patients. Hypertensive elderly patients with (n = 11) and without Chagas disease (n = 11) were previously phenotyped as extensive metabolizers (EM) or poor metabolizers (PM) for CYP2D6, applying metoprolol as a probe drug (21 EM and 1 PM). Serial blood samples were collected within 48 hours after a single oral dose administration of 10 mg racemic nebivolol. Plasma concentrations of nebivolol individual isomers and its glucuronides were measured by LC-MS/MS. The assay was linear over the rage of 15-3000 pg of each isomer of nebivolol/mL plasma and 0.2 to 125 ng of each isomer of nebivolol glucuronide/mL plasma. Pharmacokinetic parameters were evaluated applying Phoenix (WinNonlin) software and expressed as median, mean and 95% confidence interval. Statistical tests compared the pharmacokinetic parameters between isomers (Wilcoxon test) and between groups (Mann-Whithey test); p < 0.05. Pharmacokinetics of nebivolol is stereoselective in hypertensive elderly patients with (9.7 vs. 6.1 ng.h/mL) and without (10.1 vs 5.4 ng·h/mL) the chronic form of Chagas disease and phenotyped as extensive metabolisers, with higher AUC values for l-nebivolol. Nebivolol glucuronidation is also stereoselective in hypertensive elderly patients with (311.6 vs 72.9 ng.h/mL) and without (335.2 vs 65.3 ng.h/mL) the chronic form of Chagas disease and phenotyped as extensive metabolisers, with higher AUC values for d-glucuronide. The chronic form of Chagas disease does not alter the pharmacokinetics and glucuronidation capacity of either nebivolol isomers in patients phenotyped as extensive metabolizers. Clearance values for l-nebivolol (48.6 vs 14.3 L/h) and d-nebivolol (48.4 vs 20.4 L/h) estimated by the population model were lower for individuals phenotyped as CYP2D6 poor metabolisers compared to extensive metabolizers. Bioavailability calculation of individual nebivolol isomers for CYP2D6 extensive metabolisers (l-nebivolol 9%, d-nebivolol 5%) and poor metabolizers (l-nebivolol 42%, d-nebivolol 29%) made it possible to infer that clearance does not differ between the isomers in oral administration. Plasma concentrations of nebivolol observed in the present study following a single oral dose of 10 mg of racemic nebivolol to hypertensive elderly patients with and without Chagas disease were not sufficient to detect alterations in the PR, RR, and QT intervals in the electrocardiograms performed at the same iv times of blood sampling. In conclusion, Chagas disease in the chronic form did not alter the pharmacokinetics or pharmacodynamics of nebivolol isomers in the investigated elderly patients.

A doença de Chagas, uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um grave problema de saúde pública. Atualmente, cerca de dez milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas, sendo que a situação é mais crítica na América Latina, onde a doença é endêmica. A necessidade de novas alternativas terapêuticas é grande, pois os fármacos disponíveis apresentam sérias limitações, como baixa eficácia e alta toxicidade. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease essencial à sobrevivência do parasita, é considerada um importante alvo para o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de novos inibidores da enzima cruzaína empregando como modelo um composto hit (1) com propriedades anti-T. cruzi. Este inibidor competitivo (um derivado imidazólico), que apresenta elevada potência e afinidade contra a enzima alvo (IC50 = 1 &micro;M e Ki = 120 nM, respectivamente), foi identificado em trabalhos anteriores de nosso grupo por meio da integração de técnicas computacionais (triagem virtual) e experimentais (avaliação bioquímica in vitro). A presente proposta de planejamento molecular, empregando métodos de química medicinal, levou a investigação de padrões estruturais explorando a complementaridade entre as moléculas pequenas e os resíduos de aminoácidos dos subsítios da cruzaína. Um conjunto promissor de 38 compostos foi planejado, sintetizado e avaliado em ensaios in vitro frente à enzima cruzaína e posteriormente, contra o parasita. Entre os derivados do composto hit (1), que apresentaram valores de IC50 contra a enzima alvo na faixa nano- e micromolar, destaca-se o composto 14 (IC50 = 120 nM e Ki = 20 nM), um inibidor competitivo, potente e de alta afinidade contra a enzima alvo, que também apresentou atividade in vitro e in vivo contra o parasita. A integração de métodos experimentais e computacionais foi útil no processo de otimização de inibidores inéditos da cruzaína. As relações entre a estrutura e atividade obtidas são de grande relevância para o desenvolvimento de candidatos a novos fármacos para a terapia da doença de Chagas. / Chagas´ disease, an infection caused by Trypanosoma cruzi, is a serious public health problem. Currently, about ten million people are infected worldwide, and the situation is more critical in Latin America, where the disease is endemic. The need for new therapies is urgent, since the drugs available have serious limitations, such as low efficiency and high toxicity. The cruzain enzyme, an essential cysteine protease for the parasite survival is considered an important target for the development of new antichagasic agents. In this work, the goal was the development of new cruzain inhibitors based on modifications of a hit compound (1) with properties anti-T. cruzi. This competitive inhibitor (an imidazole derivative), shows high affinity and potency (IC50 = 1 &micro;M and Ki = 120 nM, respectively), and was identified in a previous work in our group by integrating computational techniques (virtual screening) and experimental (in vitro biochemical evaluation). The proposed molecular design, employing methods of medicinal chemistry, aimed to investigate structural patterns exploiting the complementarity between small molecules and amino acid residues of the subsites of cruzain. A promising set of 38 compounds was designed, synthesized and evaluated in in vitro assays against the cruzain enzyme and subsequently against the parasite. Among the derivatives of the hit compound (1), which had IC50 values against the target enzyme in the nano- and micromolar range, the compound 14 (IC50 = 120 nM and Ki = 20 nM), a potent and high affinity competitive inhibitor against cruzain showed activity in vitro and in vivo against the parasite. This work illustrates the importance of the integration of experimental and computational methods in the optimization process of novel cruzain inhibitors. The structure-activity relationship studies revealed in this work are useful for the development of new drug candidates for the treatment of Chagas´ disease.

A cruzaína é a principal cisteíno protease encontrada no parasito Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da Doença de Chagas. A enzima é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do parasito dentro do hospedeiro e possui uma excelente validação pré-clínica como alvo susceptível à ação de fármacos. Várias classes de inibidores peptídicos reversíveis e irreversíveis, baseados no estado de transição, inibem efetivamente a cruzaína. No entanto, a maioria destes inibidores ainda não apresenta perfis farmacodinâmicos/farmacocinéticos adequados e/ou estão relacionados com potenciais efeitos fora do alvo (do inglês, off-target). Com o objetivo de encontrar inibidores mais eficientes e seletivos, foi aplicado uma abordagem de planejamento de ligantes baseada em hipótese, combinando quiminformática, síntese orgânica, ensaios bioquímicos e determinação do modo de interação para validar os compostos planejados como inibidores de cruzaína. Neste trabalho, é mostrado um conjunto de dipeptidil-nitrilas que foram sintetizadas e avaliadas com base nestes métodos para investigar as interações nos subsítios S1, S2 e S3 de cruzaína. Nossos resultados demonstram o sucesso da abordagem aplicada que resultou na identificação de vários inibidores da cruzaína em concentrações que chegam a sub-micromolar. Alguns dos compostos dessa classe de dipeptidil-nitrilas também são agentes tripanossomicidas por apresentar concentrações efetivas com formas infectivas do T. cruzi em baixo micromolar. / Cruzain is the major cysteine protease found in the parasite Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. The enzyme is essential for the development and survival of the parasite within host cells, having excellent pre-clinical validation evidence as a druggable target. Several classes of peptide inhibitors including transition state-based reversible and irreversible ones effectively inhibit cruzain. However, most of these inhibitors still have poor PK/PD profiles and are related with potential off target effects. In order to find more efficient and selective inhibitors, we have applied the hypothesis driven ligand design approach, combining cheminformatics, organic synthesis, biochemical assays and mode of binding determination to validate the designed compounds as cruzain inhibitors. Here, we show a set of dipeptidyl nitriles that were synthetized and evaluated based on these methods to probe interactions at S1, S2 and S3 pockets of cruzain binding site. Our results unveil the success of the applied approach that yielded in the identification of several cruzain inhibitors at sub-micromolar concentrations. Some of the compounds of this class of dipeptidyl nitriles are also trypanocidal agents with effective concentrations in the low micromolar range against infective forms of T. cruzi.