Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-11T04:06:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 342201.pdf: 27655060 bytes, checksum: e348dc3bbb9dab5d42edf25140ff44b7 (MD5) Previous issue date: 2016 / O receptor TRPA1 pertence à superfamília dos receptores de potencial transitório (TRPs) e está expresso na medula espinhal e em outros tecidos, sendo reconhecido por mediar uma diversidade de processos dolorosos e inflamatórios. A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por acúmulo da proteína Tau e dos peptídeos Aß. A progressão desta doença incurável é diretamente afetada pelos processos de estresse oxidativo e neuroinflamação. Os produtos resultantes do processo inflamatório e oxidativo - como as espécies reativas de oxigênio (EROS) e o Ca+2 em excesso - apresentam-se elevados no início, e durante, a progressão da DA. Destaca-se o fato de que estas moléculas endógenas, também são comprovados agonistas do receptor TRPA1. No entanto, o possível papel do TRPA1 na DA ainda é desconhecido. O objetivo deste trabalho de tese, portanto, foi investigar o possível papel do receptor TRPA1 em diferentes modelos animais relacionados a DA. Utilizamos neste trabalho diferentes abordagens experimentais: cultura de células primárias tratada com AßOs, administração i.c.v. de AßOs em camundongos Swiss, camundongos transgênicos (TG) 5XFAD e cérebros de humanos diagnosticados com a DA, e também, preparações distintas do peptídeo Aß (AßOs40 e AßOs42). Foram realizadas avaliações comportamentais de aprendizado e memória em animais, através do teste do reconhecimento de objetos, e do teste de esquiva passiva step down. Além de, uma variedade de técnicas moleculares e bioquímicas, como por exemplo, a avaliação da formação de EROS, determinação do potencial de membrana mitocondrial, imunocitoquímica, imunofluorescência em fatias de cérebro, western blotting, coimunoprecipitação, microscopia eletrônica de transmissão, entre outras. Os resultados demonstram a ampla expressão de TRPA1 em neurônios e nas microglias no encéfalo de camundongos, destacando ainda, a relevância do TRPA1 para a ligação de AßOs às sinapses, e para a indução do estresse oxidativo e morte neuronal. Os achados evidenciam ainda, a relação entre o acúmulo dos AßOs e a distribuição do TRPA1, em todas as abordagens experimentais utilizadas. Ademais, o aumento da expressão de TRPA1 na microglia e seu possível papel no processo inflamatório. O tratamento por via oral com o antagonista seletivo do TRPA1 (HC030031) apresenta efeito benéfico sobre a perda da memória, nos diferentes modelos animais utilizados neste trabalho, além de, reduzir a quantidade de placas e oligômeros de Aß e consequente melhoria do dano sináptico induzido por AßOs. Baseados nestes dados, sugerimos que o receptor TRPA1 é relevante para a toxicidade induzida por AßOs, sendo este receptor crucial para a patogênese DA e apresentando-se como um potencial novo alvo para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento da doença.<br> / Abstract : TRPA1 is a member of the transient receptor potential (TRP) superfamily well known to be expressed in the spinal horn and other tissues, and recognized to mediate a diversity of pain and inflammatory states. Alzheimer's disease (AD) is a degenerative disease characterized by accumulation of both tau and Aß peptides, and for having the disease course affected by progressive oxidative stress and brain inflammation. Products of inflammation, notably reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ are augmented during AD initiation and progression. Intriguingly, these are endogenous molecules known to be able to activate TRPA1. However, the possible role of TRPA1 in AD pathogenesis is still unknown and we aimed to investigate it. We used different approaches (primary cell culture treated with AßOs, AßOs-injected Swiss mice, 5XFAD TG AD mouse model and AD human brains; including respective controls to each) and also two distinct preparations AßOs40 and AßOs42. Besides behavioral assessments, a variety of molecular and biochemical techniques, namely the evaluation of ROS formation, mitochondrial membrane potential determination, immunocytochemistry, immunofluorescence in brain slices, western blotting, co-immunoprecipitation, electron microscopy, and others. Here we report TRPA1 is largely expressed in neurons and microglia in the brain. TRPA1 is relevant to AßOs binding and AßOs-induced oxidative stress/death in neuronal cells. We demonstrated the correlation between the up-regulation and spreading of both AßOs and TRPA1, in all the approaches used. Herein, we are also reporting TRPA1 augmented expression in the microglia and its possible role in the inflammation process. Of note, TRPA1 selective antagonist (HC030031) oral treatment improved memory deficits in the different mouse models of approach. Besides, reduced Aß burden in plaques and oligomers with consequent improvement on AßOs-induced synaptic loss. We propose TRPA1 as novel potential target to AßOs-induced toxicity and further memory impairment, being essential to AD pathogenesis.

A citopatologia bucal é um método de diagnóstico baseado em células obtidas por raspagem. Com a finalidade de constatar quantitativamente as alterações celulares ocasionadas pelo fumo em mucosa bucal clinicamente normal, durante a Campanha de Combate ao Câncer de Novo Hamburgo/RS de 2000, foram selecionados todos os indivíduos homens, fumantes e não-fumantes, acima de 40 anos e sem lesão bucal aparente. O processo de seleção resultou em um total de 13 fumantes e 9 não-fumantes. Os sítios bucais estudados foram: vermelhão do lábio inferior, porção anterior do soalho bucal e borda da língua. De cada sítio estudado foram obtidos dois esfregaços, sendo o primeiro submetido à técnica de impregnação pela prata (AgNORs) para avaliação quantitativa via IMAGELAB® e o segundo ao método de Papanicolaou Modificado para confirmação de normalidade. Através do teste estatístico Mann-Whitney (p=0,05) foram obtidos os seguintes resultados: (1) em soalho, o número de AgNORs por núcleo foi superior em fumantes comparado ao grupo não-fumantes; (2) em língua, a relação núcleo/citoplasma em fumantes é maior em comparação aos não-fumantes; (3) em lábio, o grupo com média acima de 3 AgNORs/núcleo apresentou área nuclear maior. Considerando que cada sítio possui comportamento específico frente às injúrias ocasionadas pelo fumo, concluímos que as referências quantitativas de relação núcleo/citoplasma e número de AgNORs/núcleo são eficazes para o controle de alterações celulares prévias à lesão bucal visível.

Resumo não disponível.

Em mucosa bucal, displasia epitelial é considerada a mais importante característica preditora de risco para transformação maligna de leucoplasias. Como forma de investigar outras características microscópicas de risco este trabalho analisou, através da técnica imunoistoquímica, a expressão de duas proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, p53 e p21WAF1, em diferentes alterações epiteliais. A amostra de leucoplasias foi dividida em 4 grupos conforme seu diagnóstico microscópico: displasia epitelial, acantose, hiperceratose e acantose associada a hiperceratose. Foram quantificadas as células positivas na camada basal e suprabasal. Avaliou-se também, de forma qualitativa, a presença de marcação imunoistoquímica nas camadas intermediária ou descamativa, e a presença e o tipo de infiltrado inflamatório subjacente ao tecido epitelial. Não foi constatada diferença estatística significativa entre os grupos para nenhuma variável, entretanto, a expressão de p21WAF1 na camada suprabasal das leucoplasias apresentou um aumento contínuo, sendo que a maior quantidade de células positivas foi vista no grupo displasia, seguido do grupo acantose, acantose com hiperceratose e hiperceratose. Além disso, 100% das displasias apresentavam marcação positiva na camada intermediária, enquanto que 83% das acantoses, 90% das acantoses com hiperceratoses e 77% das hiperceratoses. Encontrou-se uma correlação positiva entre a expressão de p53 e p21WAF1, sugerindo que, nestas lesões, a expressão de p21WAF1 é dependente da p53. A expressão imunoistoquímica da p53, apesar de alterada, não está relacionada com a alteração epitelial da leucoplasia. Os resultados sugerem que a acantose pode representar uma alteração epitelial mais severa e, portanto, determinar maior risco de transformação maligna de lesões cancerizáveis. / Epithelial dysplasia is recognized as the most important predictive feature to malignant transformation in oral leukoplakias. This study analyze other epithelial abnormalities beyond oral epithelial dysplasia observed in leukoplakias by means immunohistochemical identification of p53 e p21WAF1, that are proteins related to cell cicle control. The leukoplakia sample was separated into 4 groups, according microscopic diagnosis: epithelial dysplasia, acanthosis, hyperkeratosis and hyperkeratosis with acanthosis. Positive-immunolabelling cells from basal and suprabasal layer was counted. Qualitative evaluation of immunolabelling was performed in intermediate and desquamative layer. Inflammatory infiltrate presence and type was evaluated in connective tissue beneath epithelial tissue. No variable showed statistically significant differences between groups. However positive cells for p21WAF1 presented a continuous increase in suprabasal layer of leukoplakias. The higher amount of positive cells was observed in dysplasia, followed by acanthosis, hiperkeratosis with acanthosis and hyperkeratosis. In addition, 100% of dysplasias presented intermediate layer immunolabelling, whereas it was observed in 83% of acanthosis, in 90% hyperkeratosis with acanthosis and in 77% of hyperkeratosis. Positive correlation was observed between p53 and p21WAF1, suggesting that, in these lesions, p21WAF1 expression depends on p53. Even alterated, p53 immunolabelling is not related to leukoplakia epithelial abnormalities. The results suggest that acanthosis may represent a more severe epithelial disturbance, leading to a higher risk of cancerization.

O objetivo deste trabalho, que utilizou 87 dentes humanos extraídos, portadores de lesão periapical, foi o estudo morfológico das reabsorções, procurando relacionar sua identificação microscópia com a presença ou não do fenômeno na radiografia inicial de diagnóstico. Em uma primeira etapa, procedemos à análise das radiografias correspondentes às setenta e duas amostras, para, em um segundo momento, submetê-las à análise em microscopia óptica. A terceira fase do nosso trabalho constituiu-se na confrontação dos achados radiográficos e microscópicos da amostragem, preocupando-nos com aspectos que tenham ocorrido nas duas análises ou em só uma delas. Em cada análise (radiografica e microscópica), foram abordadas características, como localização, profundidade e estágio evolutivo. Utilizamos ainda, nas 15 amostras restantes, a microscopia eletrônica de varredura, unicamente com finalidade de ilustração complementar. Os resultados da análise radiográfica mostraram que 63,88% das amostras não permitiram identificar reabsorção radicular, sendo incluídas na categoria reabsorçáo radicular não observável. O restante da amostragem, 36,11%, permitiu ver, na radiografia, alguma forma de reabsorção, denominada reabsorção radicular observável. Na análise microscópica, 5,55% das raízes mantiveram contorno radicular íntegro, sendo incluídas na categoria de reabsorção radicular ausente. A maioria, entretanto, 94,44%, mostrou algum tipo de reabsorção, sendo incluída no grupo com reabsorção radicular presente. Os resultados das análises radiográfica e microscópica revelaram que alguma forma de reabsorção radicular está presente na maioria dos dentes portadores de processo crônico periapical. As reabsorções radiculares foram vistas com mais facilidade no exame microscópico do que no exame radiográfico. O presente trabalho deixou claro também que as radiografias convencionais não são recursos eficientes para o diagnóstico de reabsorções radiculares em estágios iniciais. / The objective of this dissertation, which employed 87 extracted human teeth, carriers of periapical lesion, was the morphological study of the resorptions, trying to relate their microscopic identification with the presence or not of the phenomenon in the incipient X-ray of diagnosis. In a first stage we proceeded to the analysis of the X-ray pictures related to the seventy two samples, then in a second stage we submitted them to the analysis in optical microscopy. The third stage of our work comprised the confrontation of the radiographic and microscopic findings of the sampling, observing the aspects that occurred in both analyses or in just one of them. In each one of the analyses (radiographic and microscopic), characteristics such as localization, depth and evolutionary stage were approached. We also employed, in the other 15 samples left, the scanning electron microscopy with the only objective of complementary illustration. The results of the radiographic analysis showed that 63,88% of the samples did not allow to identify radicular resorption, being included in the nonobservable radicular resorption category. The rest of the sampling , 36,11% allowed to see in the X-ray some form of resorption called observable radicular resorption. In the microscopic analysis, 5,55% of the roots kept complete radicular contour, being included in the category of absent radicular resorption. However, most part of the roots, 94,44%, showed some kind of resorption, being included in the group with present radicular resorption. The results of the radiographic and microscopic analyses revealed that some form of radicular resorption is present in most of the teeth carriers of periapical chronic process. The radicular resorptions were seen more easily in the microscopic exam rather than the radiographic exam. The present dissertation also showed evidence that the conventional X-ray pictures are not efficient resources for the diagnosis of radicular resorptions at initial stages.

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno suíno, sendo o agente da pneumonia enzoótica suína. Recentemente, o genoma de três cepas (J, 7448 e 232) de M. hyopneumoniae foi seqüenciado. Inicialmente, realizamos uma análise proteômica baseada em eletroforese bidimensional (2DE), estudos imunológicos e espectrometria de massas para a cepa patogênica 7448 de M. hyopneumoniae. Foram produzidos mapas proteômicos em duas faixas de pH (3-10 e 4-7). Um total de 31 produtos gênicos foram experimentalmente verificados. Em uma análise imunológica foi possível identificar pelo menos cinco proteínas antigênicas de M. hyopneumoniae. Seguindo este primeiro estudo prospectivo da cepa 7448, foi realizada uma análise proteômica comparativa de três cepas de M. hyopneumoniae, uma não-patogênica (J) e duas cepas patogênicas (7448 e 7422). Na comparação por 2DE foi possível identificar diferenças no nível de expressão entre as cepas em pelo menos 67 spots protéicos. Para uma análise mais ampla dos perfis protéicos das três cepas foi utilizada uma estratégia baseada em LC-MS/MS. Nas três cepas, 231 proteínas foram identificadas, correspondendo a cerca de 35% da capacidade codificadora do genoma de M. hyopneumoniae. A classificação funcional das proteínas identificadas sugere diferenças fisiológicas entres as cepas não-patogênicas e patogênicas. A aplicação de uma proteômica quantitativa label-free (o exponentially modified protein abundance index) demonstrou diferenças significativas nos níveis de expressão de pelo menos 64 proteínas. Por fim, uma análise imunológica baseada em 2DE utilizando um anticorpo monoclonal contra a repetição R1 da proteína P97, foi capaz de identificar um padrão de clivagem proteolítica diferencial entre as três cepas de M. hyopneumoniae. / Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen for pigs, being the causative agent of enzootic pneumonia. Recently, the genome sequences of three strains, J, 7448 and 232 have been reported. Here, we describe the results of a proteomic analysis, based on two-dimensional gel electrophoresis of soluble protein extracts, immunoblot and mass spectrometry from the M. hyopneumoniae pathogenic strain 7448. A preliminary M. hyopneumoniae proteome map in two pH ranges (3 - 10 and 4 - 7) was produced. A total of 31 different coding DNA sequences were experimentally verified. Moreover, at least five highly antigenic proteins of M. hyopneumoniae were identified by immunoblots. Following the previous report of a proteomic survey of the pathogenic 7448 strain, we performed comparative protein profiling of three M. hyopneumoniae strains, namely the non-pathogenic J strain and the pathogenic strains 7448 and 7422. In 2DE comparisons, we were able to identify differences in expression levels between strains for 67 proteins. For more comprehensive protein profiling, an LC-MS/MS strategy was used. Overall, 231 different proteins were identified, corresponding to 35% of the M. hyopneumoniae genome coding capacity. The functional classification of identified proteins was suggestive of physiological differences between the non-pathogenic and the pathogenic strains. Also, application of the exponentially modified protein abundance index demonstrated significant differences in the expression levels of proteins detected in more than one strain, confirming over-expression in one or two of the strains for 64 proteins. 2DE immunoblot analyses allowed the identification of differential proteolytic cleavage patterns of the P97 adhesin in the three strains.

OBJETIVO: Avaliar a velocidade de proliferação celular em mucosa bucal clinicamente normal exposta aos carcinógenos do fumo e do álcool, por meio da citopatologia associada a técnica de AgNOR, em um período de 24 meses. METODOLOGIA: Foram avaliados no exame inicial 60 indivíduos, 17 controles (grupo 1), 25 fumantes (grupo 2) e 18 fumantes e etlistas (grupo 3). Na avaliação longitudinal, realizada 24 meses depois, foram reavaliados 52 individuos, 15 no grupo 1, 23 no grupo 2 e 14 no grupo 3. Os esfregaços citopatológicos foram obtidos da mucosa do lábio inferior, da borda da língua e do assoalho bucal e foram submetidos a coloração pela técnica de AgNOR para avaliação da média do número, da média da área de AgNORs por núcleo e do percentual de núcleos com mais de 3 e mais de 5 AgNORs. Os valores obtidos nas avaliações inicial e final foram comparados pelo teste t de Student com um nível de significância de 5%. RESULTADOS: Houve um percentual de retorno de 86,7%. Foi observado um aumento estastisticamente significativo para os valores de média do número de AgNORs por núcleo nos grupos 2 e 3 nos três sítios anatômicos analisados. Esse aumento foi maior no grupo 3. No grupo 1, observou-se uma tendência ao aumento desses valores. CONCLUSÕES: A avaliação longitudinal das variações da velocidade de proliferação celular em indivíduos expostos aos carcinógenos do fumo e do álcool pode representar uma ferramenta para o monitoramento desses indivíduos, uma vez que em período de 24 meses houve aumento dos valores das variáveis analisadas. Para a realização da avaliação longitudinal foi suficiente a análise da média do número de AgNORs por núcleo.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A doenÃa tuberculose à altamente infecciosa e estima-se que um terÃo da populaÃÃo mundial esteja infectada. Em 2012, foi estimado que 8,6 milhÃes de pessoas no mundo tiveram a doenÃa, representando umas das doenÃas infecciosas que mais matam no mundo. O agente causador da infecÃÃo à o Mycobacterium tuberculosis, uma micobactÃria com alta capacidade de adquirir resistÃncia aos fÃrmacos usados no tratamento. O desenvolvimento de novas drogas ou opÃÃes terapÃuticas com atividade antimicobacteriana se faz necessÃrio para a reduÃÃo da prevalÃncia da doenÃa. As plantas atravÃs de vias metabÃlicas secundÃrias produzem diversos compostos, sendo jà verificada atividade biolÃgica contra micobactÃrias em algumas classes de terpenÃides. Este estudo avaliou a atividade antimicobacteriana de Ãleos essenciais de Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus e Cinnamomun zeylanicum contra a cepa padrÃo (H37Rv) de M. tuberculosis. A tÃcnica utilizada foi de microdiluiÃÃo em placa de 96 poÃos (Resazurin Microtiter Assay - REMA), onde se utiliza a rezasurina, indicador de oxirreduÃÃo, para a avaliaÃÃo do crescimento bacteriano. O rendimento da extraÃÃo dos Ãleos de L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum foi de 0,49%, 0,68%, 0,30%, 0,009% e 0,13%, respectivamente. O citral foi encontrado como o principal constituinte dos Ãleos de L. alba (70,6%) e C. citratus (80,7%). O Ãleo de L. sidoides teve como principal constituinte o cariofileno (30,2%). O timol (64,3%) foi encontrado em maior percentual de concentraÃÃo no Ãleo do P. amboinicus. No Ãleo de C. zeylanicum foi encontrado o trans-cinamaldeÃdo (86,0%) como principal constituinte. O Ãleo essencial de L. alba nÃo apresentou atividade antimicobacteriana. Os Ãleos de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum apresentaram CIM de 299,5Â117,2Âg/ml, 1.250Âg/ml, 351,6Â55,2Âg/ml e 286,5Â130,2Âg/ml, respectivamente. O Ãleo que apresentou maior atividade antimicobacteriana foi o de L. sidoides, com potÃncia de 5,4 x 10-4. Os resultados mostram que os Ãleos essenciais de L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus e C. zeylanicum, contÃm substÃncias com propriedades de inibiÃÃo do crescimento da cepa padrÃo H37Rv de M. tuberculosis. Os Ãleos essenciais sÃo alternativas promissoras na descoberta de novos agentes terapÃuticos. / The infectious agent is the Mycobacterium tuberculosis, one mycobacteria with high capacity to acquire resistance to agents used in the treatment. The development of new drugs or treatments with antimicrobial activity is necessary for reducing the prevalence of the disease. Plants through secondary metabolic pathways produce various compounds, being already observed biological activity against mycobacteria in some classes of terpenoids. This study evaluated the antimicrobial activity of essential oils from Lippia alba, Lippia sidoides, Cymbopogon citratus, Plectranthus amboinicus and Cinnamomun zeylanicum against standard strain (H37Rv) of M. tuberculosis. The technique used was in 96-well microdilution (Resazurin Microtiter Assay - REMA) card, which uses the rezasurina, redox indicator for the evaluation of the bacterial growth. The yield of extraction of oils from L. alba, L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum was 0.49%, 0.68%, 0.30%, 0.009% and 0.13%, respectively. Citral was found as the major constituent of oil of L. alba (70.6%) and C. citratus (80.7%). The oil of L. sidoides has as the main constituent the caryophyllene (30.2%). The thymol (64.3%) was found in a higher percentage of oil concentration in P. amboinicus. In the oil of C. zeylanicum the trans-cinnamaldehyde (86.0%) was found as the main constituent. The essential oil of L. alba do not showed antimicrobial activity. The oil of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum showed MIC of 299.5Â117.2mg/ml, 1.250&#956;g/ml, 351.6Â55.2mg/ml and 286.5Â130.2g/ml, respectively. The oil that showed higher antimicrobial activity was the of L. sidoides, with power of 5.4 x 10-4. The results show that essential oils of L. sidoides, C. citratus, P. amboinicus and C. zeylanicum contains substances with properties of inhibiting the growth of the standard strain H37Rv of M. tuberculosis. Essential oils are promising alternatives in the discovery of new therapeutic agents.

OBJETIVO: Avaliar a velocidade de proliferação celular em mucosa bucal clinicamente normal exposta aos carcinógenos do fumo e do álcool, por meio da citopatologia associada a técnica de AgNOR, em um período de 24 meses. METODOLOGIA: Foram avaliados no exame inicial 60 indivíduos, 17 controles (grupo 1), 25 fumantes (grupo 2) e 18 fumantes e etlistas (grupo 3). Na avaliação longitudinal, realizada 24 meses depois, foram reavaliados 52 individuos, 15 no grupo 1, 23 no grupo 2 e 14 no grupo 3. Os esfregaços citopatológicos foram obtidos da mucosa do lábio inferior, da borda da língua e do assoalho bucal e foram submetidos a coloração pela técnica de AgNOR para avaliação da média do número, da média da área de AgNORs por núcleo e do percentual de núcleos com mais de 3 e mais de 5 AgNORs. Os valores obtidos nas avaliações inicial e final foram comparados pelo teste t de Student com um nível de significância de 5%. RESULTADOS: Houve um percentual de retorno de 86,7%. Foi observado um aumento estastisticamente significativo para os valores de média do número de AgNORs por núcleo nos grupos 2 e 3 nos três sítios anatômicos analisados. Esse aumento foi maior no grupo 3. No grupo 1, observou-se uma tendência ao aumento desses valores. CONCLUSÕES: A avaliação longitudinal das variações da velocidade de proliferação celular em indivíduos expostos aos carcinógenos do fumo e do álcool pode representar uma ferramenta para o monitoramento desses indivíduos, uma vez que em período de 24 meses houve aumento dos valores das variáveis analisadas. Para a realização da avaliação longitudinal foi suficiente a análise da média do número de AgNORs por núcleo.

Resumo não disponível.