<p style="text-align: justify;">Reverzno-faznom tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom primenom dva sistema<br />rastvarača ispitano je pona&scaron;anje i hromatografska lipofilnost prirodnih stiril laktona 7-(+)-<br />goniofufurona, 7-epi-(+)-goniofufurona, krasalaktona B i C i dvadeset njihovih<br />novosintetizovanih derivata i analoga. U ranijim ispitivanjima pokazalo se da ova jedinjenja<br />imaju veliki biolo&scaron;ki potencijal jer pokazuju zapaženu citotoksičnost prema vi&scaron;e humanih<br />tumorskih ćelijskih linija. Hromatografsko pona&scaron;anje jedinjenja uglavnom je u skladu sa<br />njihovom strukturom. Ustanovljene su linearne veze između hromatografskih retencionih<br />konstanti i većine in silico parametara lipofilnosti. Primenom hemometrijske QSRR analize<br />utvrđeni su veoma dobri multi linearni regresioni prediktivni modeli kvantitativne zavisnosti<br />između eksperimentalno dobijene hromatografske retencione konstante, koja defini&scaron;e<br />retenciju jedinjenja u čistoj vodi i in silico molekulskih deskriptora odnosno strukture<br />jedinjenja. Lipofilnost jedinjenja ima najveći uticaj na njihove farmakokinetičke, tj. ADME<br />(apsorpcija, distribucija, metabolizam, eliminacija) osobine. Definisani su i statistički<br />potvrđeni najbolji multi linearni regresioni modeli zavisnosti farmakokinetičkih parametara<br />stiril laktona i od drugih molekulskih deskriptora. In vitro citotoksična aktivnost jedinjenja<br />evaluirana je prema četiri nove humane maligne ćelijske linije: kancer prostate (PC3), kancer debelog creva (HT-29), melanom (Hs294T), adenokancer pluća (A549). Najaktivnije<br />novosintetizovano jedinjenje je triciklični 4-fluorocinamatni analog, koji ispoljava<br />nanomolarnu aktivnost (IC₅₀ 2,1 nM) prema ćelijama melanoma i aktivniji je preko 2250 puta od komercijalnog antitumorskog agensa doksorubicina (DOX). SAR analizom utvrđena je zavisnost između strukture i biolo&scaron;ke aktivnosti jedinjenja. Molekulskim dokingom ispitana je veza stiril laktona i ciljanog proteina značajnog za kancer prostate. Jedinjenja sa visokom inhibitornom aktivno&scaron;ću prema ćelijama kancera prostate imaju visok doking skor i mogu graditi koordinativno-kovalentnu vezu sa Fe²+jonom prisutnim u aktivnom centru enzima. 3D-QSAR analizom, koja je izvedena metodama komparativnih polja CoMFA i CoMSIA, formiran je značajan prediktivni model između hemijske strukture i biolo&scaron;ke aktivnosti stiril laktona.</p> / <p>The behavior and the chromatographic lipophilicity natural styryl lactone 7-(+)-<br />goniofufurone, 7-epi-(+)-goniofufurone, crassalactones B and C and twenty of their newly<br />synthesized derivatives and analogs were examined using reverse-phase high performance liquid chromatography in the two solvent systems. In previous studies it has been shown that these compounds have great biological potential toward several human tumor cell lines. Chromatographic behavior of the compounds is generally in accordance with their structure. The relationships between the chromatographic retention constants and the majority of their in silico lipophilicity parameters are linear. The application of chemometric QSRR analysis determined very good multiple linear regression predictive models of quantitative correlation between experimentally obtained chromatographic retention constant, which determines the retention of the compound in pure water and in silico molecular descriptors, i.e. the structure of the compound. The lipophilicity of the compounds has a major influence on their pharmacokinetics, i.e. ADME (absorption, distribution, metabolism, elimination) properties. The best multi-linear regression models depending on the pharmacokinetic parameters of styryl lactone and other molecular descriptors have been defined and statistically validated. In vitro cytotoxic activity of the compounds was evaluated according to four novel human malignant cell lines: prostate cancer (PC3), colon cancer (HT-29), melanoma (Hs294T), lung adenocarcinom (A549). The most active compound was tricyclic 4-fluorocinnamic analog, which exhibits a nanomolar activity (IC50 2,1 nM) toward melanoma cells. This compound is over 2250 times more active than commercial antitumor agent doxorubicin (DOX). SAR analysis has revealed a correlation between the structure and the biological activity of the compounds. Using the molecular docking the relationship of the styryl lactone and the target protein important for prostate cancer was examined. The compounds with high inhibitory activity against prostate cancer cells have a high docking score and are capable to form a coordinative-covalent bond with a Fe2+ ion present in the active centre of the enzyme. 3DQSAR analysis, which was performed by methods of comparative CoMFA and CoMSIA fields, has formed a good predictive model between chemical structure and biological activity of the styryl lactone.</p>

<p>Proteini imaju osnovnu ulogu u&nbsp; životnim&nbsp;procesima, usled čega je isptivanje raznovrsnosti&nbsp;njihove strukture jedna od ključnih potreba&nbsp;modernih biolo&scaron;kih istraživanja. Cilj ove&nbsp;doktorske disertacije je predviđanje&nbsp;trodimenzionalne strukture beta-galaktozidaza&nbsp;odabranih bakterijskih sojeva (<em>Streptococcus&nbsp;thermophillus,&nbsp; Lactobacillus acidophilus</em>,&nbsp; i&nbsp;<em>Bifidobacterium animalis</em>&nbsp; ssp.&nbsp; <em>lactis</em>) kao i&nbsp;karakterizacija &nbsp;njihovih aktivnih mesta i&nbsp;određivanje aktivnih rezdua. Takođe, cilj&nbsp;disertacije obuhvata i ispitivanje beta-galaktozidaze&nbsp;<em> Bacteroides thetaiotaomicron</em>-a,&nbsp;kao i ispitivanje aktivnosti beta-galaktozidaze&nbsp;Kluyveromyces lactis-a. Na osnovu sličnosti&nbsp;<br />analizirane sekvence se mogu podeliti u dva&nbsp;klastera. Članovi klastera 1 pripadaju GH-2&nbsp;subfamiliji, dok članovi klastera 2 pripadaju GH-42 subfamiliji. Na osnovu klaster analize i poravnanja sekvenci&nbsp; predložene su&nbsp; katalitički&nbsp;aktivne rezidue beta-galaktozidaza ispitivanih&nbsp;sojeva: GLU458/GLU546 kod <em>S. thermophillus</em>-a,&nbsp;GLU148/GLU307 kod&nbsp;<em> L. Acidophilus-</em>a i&nbsp;GLU164/GLU324 kod<em> B. animalis</em> ssp.<em> lactis</em>-a.&nbsp;Konstruisani su homologi modeli beta-galaktozidaza<em> S. thermophilus, L. &nbsp;acidophilus, B.&nbsp;&nbsp; animalis</em>&nbsp; ssp.&nbsp;<em> lactis</em>.&nbsp; Iz rezultata simulacije&nbsp;molekularnog dokinga svih beta-galaktozidaza&nbsp;uočljivo je da se supstrat veže za aktivno mesto&nbsp;koje se nalazi u regionu visoke&nbsp;elektronegativnosti. Simulacije dokinga su&nbsp;potvrdile aktivna mesta predložena poravnanjem&nbsp;sekvenci i otkrile rezidue koje učestvuju u&nbsp;vezivanju laktoze i galaktoze kao supstrata.&nbsp;Obzirom da je objavljena samo jedna kristalna&nbsp;struktura beta-galaktozidaze sa laktozom u&nbsp;aktivnom mestu, analiza molekularnog dokinga&nbsp;laktoze kao supstrata je sprovedena i sa beta-alaktozidazama koje imaju određenu&nbsp;trodimenzionalnu strukturu. Na osnovu slučnosti&nbsp;sekvenci može se zaključiti da je nukleofilna&nbsp;rezidua beta-galaktozidaze <em>B. thetaiotaomicron</em>-a&nbsp;GLU259. Analizom konzervativnih regiona, kao i&nbsp;doking simulacije, može se zaključiti da ulogu&nbsp;proton donora ima rezidua GLU182. Hemijski&nbsp;sastav mleka za ispitivanje aktivnosti beta-galaktozidaze <em>Kluyveromyces lactis-</em>a je u skladu sa pravilnikom o kvalitetu proizvoda od mleka i&nbsp;starter kultura&nbsp; koji izdaje Ministarstvo&nbsp;<br />poljoprivrede i za&scaron;tite životne sredine Republike&nbsp;Srbije.&nbsp; Celokupna laktoza se razgradila u&nbsp;permeatu na temperaturi od 40&deg;C i pri&nbsp;koncentraciji enzima od 0,1% nakon 60 minuta od&nbsp;trenutka dodatka enzima. Maksimalna brzina&nbsp;postiže se toku prvih 10 minuta. Iz dobijenih&nbsp;rezultata može se zaključiti da beta-galaktozidaza&nbsp;<br /><em>K. lactis</em>-a ima visoku efikasnost prilikom&nbsp;razgradnje laktoze &scaron;to je čini pogodnom za&nbsp;<br />komercijalnu upotrebu u industriji mleka. U ovoj&nbsp;disertaciji predstavljen je protokol za&nbsp;<br />modelovanje komercijalno važnih beta-galaktozidaza i analiziranje njihovih &nbsp;interakcija sa laktozom kao supstratom. Dobijeni rezultati treba&nbsp;da pruže okvir za molekularna istraživanja&nbsp;vezivanja i razgradnje laktoze, kao i za buduće&nbsp;<br />dizajniranje komercijalno interesantnih beta-galaktzidaza.&nbsp;</p> / <p>Proteins have an essential role in all life&nbsp;processes. Therefore, investigation of their&nbsp;<br />structure diversity is one of the key focuses of&nbsp;modern biological researches. The aim of this&nbsp;PhD thesis is prediction of three-dimensional&nbsp;structure of&nbsp; beta-galactosidases of&nbsp; selected&nbsp;bacterial strains (<em>Streptococcus thermophillus,&nbsp;Lactobacillus acidophilus </em>and <em>Bifidobacterium&nbsp;animalis</em> ssp. <em>lactis</em>), as well as characterization&nbsp;of their active sites and active residues.&nbsp;Furthermore, this thesis include investigation&nbsp;<em>Bacteroides thetaiotaomicron</em>&nbsp; and&nbsp;<em>Kluyveromyces lactis</em> beta-galactosidases. Based&nbsp;on sequence &nbsp;similarity analyzed sequences can&nbsp;be clustered in two clusters. Members of cluster&nbsp;<br />1 belong to GH-2 subfamily, while members of&nbsp;cluster 2 belong to GH-42 subfamily. Cluster&nbsp;analysis and sequence alignment revealed&nbsp;potential active residues: GLU458/GLU546 - S.&nbsp;thermophillus,&nbsp; GLU148/GLU307&nbsp; -&nbsp; L.&nbsp;Acidophilus&nbsp; and&nbsp; GLU164/GLU324&nbsp; -&nbsp; B.&nbsp;animalis ssp. lactis.&nbsp; Homologous models of&nbsp;beta-galactosidases from&nbsp; <em>S. thermophilus,&nbsp; L.&nbsp;acidophilus,&nbsp; B. animalis&nbsp;</em> ssp.&nbsp; <em>lactis</em>&nbsp; are&nbsp;<br />constructed as a result of this PhD thesis.&nbsp;Molecular docking simulations of all beta-galactosidases revealed that substrate binds in&nbsp;region with high electronegativity. &nbsp;Furthermore,&nbsp;docking simulations confirmed active sites&nbsp;suggested by sequence alignment. As only one&nbsp;crystal structure with lactose in its active site&nbsp;has been published, docking simulations with&nbsp;lactose as a ligand were also performed with&nbsp;<br />experimentally determined beta-galactosidases&nbsp;structures. Also, lactose and &nbsp;alactose &nbsp;binding&nbsp;residues are predicted. Based on sequence&nbsp;similarity&nbsp; GLU259&nbsp; can be recognized as&nbsp;nucleophile of&nbsp;<em> B. thetaiotaomicron&nbsp;</em> beta-galactosidase. By analysis of conserved regions&nbsp;and docking simulation, GLU182 is predicted as&nbsp;a proton donor residue. Chemical composition&nbsp;of milk used for Kluyveromyces lactis&nbsp; beta-galactosidase research had appropriate quality&nbsp;according to directions of Ministry of&nbsp;<br />agriculture and environmental protection of&nbsp;Republic of Serbia. Total lactose content was&nbsp;degraded in permeate after 60 min using&nbsp;enzyme concentration of 0,1% at&nbsp; 40&deg;C.&nbsp;Maximal degradation was reached in the first 10&nbsp;min. Based on the results, it can be concluded&nbsp;that <em>Kluyveromyces lactis</em> beta-galactosidase has&nbsp;high efficiency for &nbsp;lactose degradation, which&nbsp;makes it commercially interesting for milk&nbsp;industry. Protocol for modeling of commercially&nbsp;important beta-galactosidases and their&nbsp;<br />interactions with lactose is developed as a result&nbsp;of this PhD thesis. Obtained results should&nbsp;provide the frame for molecular investigation of&nbsp;lactose binding and degradation, as well as for&nbsp;designing of commercially suitable beta-galactozidases.&nbsp;</p>

<p>Испитивано је хроматографско понашање (хроматографска липофилност) 29 стероидних једињења (триазола и тетразола, толуенсулфонилхидразида, диона, нитрила и динитрила) од потенцијалног биомедицинског значаја, испитивано је помоћу течне хроматографије високих перформанси на обрнутим фазама, применом две стационарне и две мобилне фазе. Липофилност, изражена преко ретенционог параметра logk, моделована је QSRR приступом. Формирани линеарни и нелинеарни модели омогућили су испитивање односа између ретенционих параметара и in silico молекулских дескриптора, који су израчунати на основу структуре испитиваних једињења. Добра предиктивна моћ формираних модела, добијених за калибрациони сет, потврђена је и применом екстерног тест сета и валидационог сета. Предиктивна моћ формираних модела потврђује могућност њиховог коришћења за предвиђање липофилности нових, структурно сличних, једињења. Примењене су и класификационе хемометријске методе (анализа главних компоненти и хијерархијска кластер анализа) како би се уочиле сличности и разлика између једињења. Поред тога, представљена је in vitro анализа антимикробног потенцијала испитиваних стероидних једињења према Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans. Два једињења, са епоксидном групом у положају 4,5, испољила су бактериостатски ефекат према S. aureus. Такође, приказана је докинг анализа одабраних испитиваних једињења са антипролиферативном активношћу према ћелијама андроген-рецептор негативног канцера простате (AR-нег. PC-3). На основу визуелизације оптималних положаја и анализе постојећих интеракција, идентификовано је једињење са највећим потенцијалом као инхибитор хуманог цитохрома P450 CYP17A1.</p> / <p>Ispitivano je hromatografsko ponašanje (hromatografska lipofilnost) 29 steroidnih jedinjenja (triazola i tetrazola, toluensulfonilhidrazida, diona, nitrila i dinitrila) od potencijalnog biomedicinskog značaja, ispitivano je pomoću tečne hromatografije visokih performansi na obrnutim fazama, primenom dve stacionarne i dve mobilne faze. Lipofilnost, izražena preko retencionog parametra logk, modelovana je QSRR pristupom. Formirani linearni i nelinearni modeli omogućili su ispitivanje odnosa između retencionih parametara i in silico molekulskih deskriptora, koji su izračunati na osnovu strukture ispitivanih jedinjenja. Dobra prediktivna moć formiranih modela, dobijenih za kalibracioni set, potvrđena je i primenom eksternog test seta i validacionog seta. Prediktivna moć formiranih modela potvrđuje mogućnost njihovog korišćenja za predviđanje lipofilnosti novih, strukturno sličnih, jedinjenja. Primenjene su i klasifikacione hemometrijske metode (analiza glavnih komponenti i hijerarhijska klaster analiza) kako bi se uočile sličnosti i razlika između jedinjenja. Pored toga, predstavljena je in vitro analiza antimikrobnog potencijala ispitivanih steroidnih jedinjenja prema Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans. Dva jedinjenja, sa epoksidnom grupom u položaju 4,5, ispoljila su bakteriostatski efekat prema S. aureus. Takođe, prikazana je doking analiza odabranih ispitivanih jedinjenja sa antiproliferativnom aktivnošću prema ćelijama androgen-receptor negativnog kancera prostate (AR-neg. PC-3). Na osnovu vizuelizacije optimalnih položaja i analize postojećih interakcija, identifikovano je jedinjenje sa najvećim potencijalom kao inhibitor humanog citohroma P450 CYP17A1.</p> / <p>Chromatographic behavior (chromatographic lipophilicity) of 29 steroid compounds (triazole and tetrazole, toluenesulfonylhydrazide, dione, dinitrile and nitrile) with potential biomedical importance was investigated by reversed-phases high-performance liquid chromatography using two stationary and two mobile phases. The lipophilicity expressed through the retention parameter logk was modeled using QSRR approach. Formed linear and non-linear models enabled the study of the relationship between the retention parameters and in silico molecular descriptors calculated from the structure of the investigated compounds. Good predictive power of the established models obtained for the calibration set was confirmed by the application of an external test set and validation set. The predictive power of the established model confirms the possibility of their use for lipophilicity prediction of new, structurally similar compounds. The classification chemometric methods (principal components analysis and hierarchical cluster analysis) were applied in order to recognize the similarities and differences between the compounds. Тhis dissertation presents the in vitro analysis of the antimicrobial potentials of the investigated steroid compounds against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. Two compounds, with epoxy group in the position 4,5, exhibited bacteriostatic effect against S. aureus. The docking analysis of selected test compounds with antiproliferative activity toward cells of androgen receptor-negative prostate cancer (AR-neg. PC-3) is showed. Based on the optimal position visualization and analysis of existing interactions a compound with the most promising potential as human cytochrome P450 CYP17A1 inhibitor is idetified.</p>