La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDT. / The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic gram-negative bacteria, its production being associated to various diseases, including tumorigenesis. A causal relationship has been established between DNA damage, mutagenesis and cancerogenesis. Different studies classified CDT among the bacterial genotoxins. The CDT-related pathogenicity relies on the catalytic subunit CdtB action, shown to induce double-strand breaks (DSB) on the host genomic DNA. Previously, our team showed that, at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT probably induces single-strand breaks that degenerate into DSB during S-phase. To document this model, we studied the repair systems involved in host-cell in response to CDT-induced DNA damage. Since various repair pathways allow cells to respond different type of DNA damage, we speculated that non-DSB repair mechanisms might contribute to the cellular resistance to CDT-mediated genotoxicity. First, we confirm that HR is involved in the management of CDT-induced lesions, but also Non Homologous End Joining, the second major DSB repair mechanism. Next we show that nucleotide excision repair, involved in adducts repair, is not important to take care of CDT-induced DNA damage, whereas base excision repair impairment sensitizes CDT-treated cells, suggesting that CDT induce single-strand breaks. Moreover, we demonstrate for the first time the involvement and the activation of the Fanconi Anemia repair pathway in response to CDT. Finally, to better characterize CDT-induced damage, we initiate experiments to study CdtB nuclease activity in vitro. For this, different CdtB mutants have been generated, purified and their nuclease activity tested. A similar nuclease activity has been obtained for the wt or mutant CdtB in an in vitro assay (digestion of a supercoiled plasmid). However, a cell assay (nuclear expression of CdtB in eukaryotic cells) confirms the loss of activity for the mutant subunit. Our results thus indicate the importance to test the CdtB subunit in different context. To conclude, our work reinforces a model where CDT induces single-strand damage and not direct DSB. This also underlines the importance of cell proliferation to generate DSB and sheds light on the activated host-cell systems, after CDT-induced DNA damage.

TRF1 est une protéine télomérique essentielle pour la stabilité et la régulation de la longueur des télomères. Son expression est altérée dans de nombreux cancers humains, et son inhibition, dans un contexte p53 déficient, favorise le développement de tumeurs chez la souris. Nous montrons ici que l'inhibition de TRF1 dans les fibroblastes primaires humains conduit à une accumulation télomérique de γ-H2AX et à une activation de la voie de réponse aux dommages de l'ADN dépendante des kinases ATR/Chk1, menant rapidement les cellules vers la sénescence. En revanche, lorsque les voies p53 et pRb sont défaillantes, les cellules échappent à la sénescence. L'érosion accrue des télomères engendre alors une fragilité télomérique et une instabilité chromosomique, caractérisées par la présence de fusions entres chromatides soeurs et de signaux multi-télomériques (MTS). Un niveau élevé de MTS, associés à la présence de télomères courts, est également retrouvé après la surexpression de TRF1. Cette fragilité télomérique conduit à une extension de la capacité proliférative des cellules, due à une stabilisation de la longueur des télomères par réactivation de la télomérase. Nous proposons que la fragilité des télomères, induit par l'altération de la charge télomérique de TRF1, conduit à une instabilité chromosomique qui facilite la réactivation de la télomérase et à des anomalies chromosomiques comparables à celles retrouvées dans les tumeurs. La dérégulation de l'expression de TRF1 joueraient un rôle dans la progression tumorale des cellules p53 et pRb déficientes. / TRF1 is a telomere-binding protein which is essential for both telomere stability and telomere length regulation. TRF1 depletion in the context of p53 deficiency promotes tumor development in the mouse, and TRF1 expression is altered in some human cancers. We report here that inhibition of TRF1 in human primary fibroblast results in rapid induction of senescence, which is concomitant with telomeric accumulation of γ-H2AX and phosphorylation of the ATR downstream checkpoint kinase Chk1. Abrogation of p53 and pRb pathways bypasses senescence but leads to accelerated telomere shortening and early onset of chromosomal instability, including sister chromatid fusions and the occurrence of multi-telomeric signals (MTS) related to telomere fragility. MTS are also elevated in TRF1-overexpressing cells and are coincident with the presence of short telomeres. Elevated telomere fragility was associated with greater immortalization potential and resultant cells maintained their telomeres via telomerase reactivation. We propose that changes in TRF1 occupancy at telomeres lead to telomere-fragility driven chromosome instability, which facilitates the reactivation of telomerase and engenders cancer-relevant chromosomal aberrations. These events would occur at early stages of the tumor progression process in the context of an impaired p53 and pRb response.

Abstract: It is well established that ionizing radiation induces a variety of damage in DNA by direct effects that are mediated by one-electron oxidation and indirect effects that are mediated by the reaction of water radiolysis products, e.g., hydroxyl radicals (•OH). In cellular DNA, direct and indirect effects appear to have about an equal effect toward DNA damage. We have shown that ϒ-(gamma) ray irradiation of aqueous solutions of DNA, during which •OH is the major damaging ROS can lead to the formation several lesions. On the other hand, the methylation and oxidative demethylation of cytosine in CpG dinucleotides plays a critical role in the gene regulation. The C5 position of cytosine in CG dinucleotides is frequently methylated by DNA methyl transferees (DNMTs) and constitutes 4-5% of the total cytosine. Here, my PhD research work focuses on the analysis of oxidative base modifications of model compounds of methylated and non methylated oligonucleotides, isolated DNA (calf-thymus DNA) and F98 cultured cell by gamma radiation. In addition, we identified a series of modifications of the 2-deoxyribose moiety of DNA arising from the exposure of isolated and cellular DNA to ionizing radiation. We also studied one electron oxidation of cellular DNA in cultured human HeLa cells initiated by intense nanosecond 266 nm laser pulse irradiation, which produces cross-links between guanine and thymine bases (G*-T*). To achieve these goals, we developed several methods based on mass spectrometry to analyze base modifications in isolated DNA and cellular DNA. / Résumé : Les radiations ionisantes induisent une variété de dommages à l'ADN selon des effets directs, correspondant à une oxydation suite à l’éjection d’un électron, et indirecte, médiés par une réaction avec les produits issus de la radiolyse de l’eau environnante, tels que les radicaux hydroxyles (•OH). Au sein d’une cellule, l’importance relative des effets directs et indirects semble être quantitativement similaire en ce qui concerne les dommages induits à l'ADN cellulaire. Nous avons démontré que l'irradiation par rayons Υ-(gamma) de solutions aqueuses d'ADN, dont l’action délétère est principalement véhiculé e par l’intermédiaire des radicaux hydroxyles, peut induire sur l’ADN la formation de toute une palette de modifications. D'autre part, la méthylation et la déméthylation oxydative de la cytosine au sein de couples de dinucléotides CpG jouent un rôle essentiel dans la régulation des gènes. La position C5 de cette cytosine se retrouve fréquemment méthylée par les méthyltransférases (DNMTs) et constitue alors 4-5% de l’ensemble de la cytosine présente au sein de l’ADN. Mon projet de recherche est centralisé autour de l'analyse de la modification des bases de l’ADN suite à leur oxydation dans des composés modèles constitués d'oligonucléotides méthylés et non-méthylés, puis dans l'ADN isolé (extrait de cellules de thymus de veau) et enfin au sein de cultures cellulaires F98 ayant subies une irradiation par rayons Υ-(gamma). De plus, nous avons identifié une série de modifications spécifiques au groupement fonctionnel 2-désoxyribose de l'ADN résultant de l'exposition de l'ADN isolé et cellulaire aux rayonnements ionisants. Nous avons également étudié les conséquences de l’irradiation par des impulsions lasers nanoseconde à 266 nm de cultures cellulaires de lignée humaine (HeLa). Responsable d’une réaction d’oxydation suite à l’éjection d’un électron, l’identification des modifications induites à l’ADN cellulaire suite à l’irradiation laser a permis de mettre en évidence des pontages ADN-ADN caractéristiques entre les bases guanine et thymine (G*-T*). Pour atteindre ces objectifs, nous avons développé plusieurs méthodes d’analyse des modifications de bases au sein de l’ADN isolé et de l'ADN cellulaire basées sur la spectroscopie de masse.

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2. / Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres that play a crucial rôle in the equal segregation of chromosomes by organizing the bipolar spindle during mitosis. Recent studies have revealed the involvement of centrosomes in regulating G2/M transition during normal cell cycle progression. Moreover, increasing evidence suggests that centrosomes also play roles in the DNA damage response and cell cycle checkpoint signalling by serving as “meeting points” where DNA-damage-responsive genes and cell cycle regulators communicate. Numerical centrosome aberrations, or centrosome amplification, is a common feature of most human cancers that promotes aneuploidy and is involved in tumorigenesis as well as tumor progression. Interestingly, centrosome amplification and fragmentation have also been shown to constitute a cellular response to impaired DNA integrity that triggers cell death by mitotic failure. Although their roles are critical in tumorigenesis and the DNA damage response, the mechanisms that regulate centrosome homeostasis and dynamics remain poorly understood. To gain a better understanding of the role of the centrosomes in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage; the recruitment and/or centrosomal activation of the kinases implicated in this checkpoint pathways were studied by indirect immunofluorescence on HeLaS3 cells or western blot on purified centrosomal fractions. Our results showed that the kinases CHK1, CHK2, ATM and ATR are activated at the centrosomes in cell synchronised in G2. However, after activation of the G2/M checkpoint, these activated kinases moved from centrosomes. Finally, to identify new centrosomal actors potentially involved in the regulation of this checkpoint, a comparative analysis of the proteome of purified centrosomes was also realized by mass spectrometry. To study more specifically the function of CHK2 at the centrosomes, we developped molecular tools wich will serve to determine the role of the sub-population of CHK2 localized at the centrosomes in 1) in regulating entry into mitosis during unperturbed cell cycle progression, 2) in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage induced by ionizing radiations and genotoxic drugs and 3) in centrosomal homeostasis and dynamics by regulating centrosomal amplification, fragmentation and clustering during normal cell cycle progression and in response to genotoxic drugs. This study will further elucidate the importance of centrosomes in regulating the cell response to genotoxic stress induced by anti-cancer treatments and reveal potential new functions for the kinase CHK2 in unperturbed cell cycle progression and in response to DNA damage.

L’ubiquitylation est une modification post-transcriptionelle qui est nécessaire pour la dégradation des protéines mais aussi pour la régulation et la localisation de nombreux facteurs. Un grand nombre de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN et dans la réponse aux lésions de l’ADN sont ubiquitylées. L’ubiquitylation durant la réponse aux dommages de l’ADN dépend de l’enzyme d’activation de l’ubiquitine UBA1 qui est située au sommet de la cascade d’ubiquitination. Durant ma thèse, j’ai mis à jour le mécanisme de recrutement d’UBA1 au niveau de l’ADN endommagé ainsi qu’un rôle majeur de l’ubiquitylation dans la voie de signalisation ATR.A l’aide d’une approche in vitro qui mime la voie de signalisation ATR, j’ai montré qu’UBA1 est recrutée au niveau de molécules d’ADN linéaire et qu’elle est nécessaire à l’ubiquitylation des protéines recrutées sur ce substrat. J’ai également découvert que l’ubiquitylation et le recrutement d’UBA1 in vitro sont dépendants de la kinase DNA-PKcs et de la poly(ADP-ribose) polymérase PARP1, deux senseurs majeurs des lésions de l’ADN. Il apparait que PARP1 régule le recrutement d’UBA1 via la formation de chaines de poly(ADP)-ribose (PAR). De plus, j’ai montré qu’UBA1 est capable de se lier aux chaines PAR. J’ai identifié la région d’UBA1 capable d’interagir avec les chaines PAR : il apparait que cette région est désorganisée et riche en acide aminés hydrophobes. La comparaison de la protéine UBA1 de levure et la protéine UBA6 humaine qui ne lient pas PAR nous a permis d’identifier les acides aminées hydrophobes nécessaires pour la lésion à PAR.J’ai aussi démontré qu’UBA1 est nécessaire pour la réponse aux lésions de l’ADN. En effet, l’inhibition ou la déplétion d’UBA1 conduit à une perte de la phosphorylation de Chk1 dans notre système in vitro. De même, le traitement avec des molécules induisant des lésions de l’ADN telles que le CPT, le MMS et la bléocine conduit à une phosphorylation moindre de Chk1 lorsqu’UBA1 est inhibée. Afin de démontrer que la liaison d’UBA1 aux chaines PAR est cruciale pour la réponse aux dommages, j’ai mis en place un système in vivo permettant d’exprimer des mutants d’UBA1 incapable de lier les chaines PAR.Globalement mes résultats indiquent qu’UBA1 est recrutée au niveau de l’ADN endommagé à l’aide de PARP1 et DNA-PKcs. Plus précisément, il apparait que la liaison avec les chaines PAR et l’ubiquitylation de protéines spécifiques est nécessaire pour la mise en place de la voie de signalisation ATR. L’importance d’UBA1 dans le processus est soulignée par le fait que son inhibition ou son inactivation conduit à une phosphorylation moindre de Chk1. Il est raisonnable de penser que des inhibiteurs d’UBA1 puissent être utilisés pour cibler la voie ATR dans les cellules cancéreuses. Finalement, cette étude devrait permettre de mieux comprendre comment les interactions entre les processus d’ubiquitylation et de PARylation permettent de réguler la réponse aux dommages. / Ubiquitylation is an important posttranslational modification that is necessary for protein degradation as well as for the regulation and the localization of many cellular factors. A number of proteins implicated in DNA replication and DNA damage response are ubiquitylated. Ubiquitylation during the DNA damage response is selectively dependent on the ubiquitin-activating enzyme UBA1, which functions at the apex of the ubiquitylation cascade. In this thesis, I describe the mechanism of UBA1 recruited at damaged sites and uncover the role of ubiquitylation in ATR signaling.Using a cell free system developed in the lab that recapitulates ATR kinase-signaling pathway, I present evidence that, UBA1 is recruited to linear DNA substrates and mediate ubiquitylation of DNA-bound proteins. I found that protein ubiquitylation and the recruitment of UBA1 to DNA in cell-free extracts was dependent on the kinase DNA-PKcs and on the poly ADP-ribose polymerase PARP1, two sensors of DNA lesions. PARP1 regulates UBA1 recruitment in large part through poly (ADP)-ribose (PAR) chain formation. UBA1 exhibited affinity for PARP1 and for PAR chains. Furthermore, we have identified minimal region on UBA1 which is prominently hydrophobic and disordered region of UBA1 which are required for its PAR binding activity. Through comparison with yeast UBA1 and human UBA6 which failed to bind with PAR chains, we identified hydrophobic amino acid residues which are critical for PAR binding.I also show evidence that UBA1 is required for efficient DNA damage signaling. In a cell free system, chemical inhibition or siRNA depletion of UBA1 led to the loss of ChK1 phosphorylation, suggesting that UBA1 activity is required for efficient DNA damage response. Consistent with these observations, when cells were treated with DNA lesion inducing drugs like CPT, MMS and Bleocin, we observed less efficient Chk1 phosphorylation. I have developed UBA1 replacement system to demonstrate functional significance of mutation in PAR binding residues of UBA in DNA damage response.Collectively, these results indicate that UBA1 is recruited to DNA damaged sites in a DNA-PKcs and PARP1 dependent-manner, in a larger part through its interaction with PAR chains and that protein ubiquitylation on DNA damages is necessary for the assembly of a productive ATR signaling complex. The importance of role of UBA1 in DNA damage response is underscored by the finding that UBA1 inhibition leads to inefficient Chk1 phosphorylation which is required for efficient DNA damage response. Thus, UBA1 inhibitors could be used to target ATR signaling in cancer cells. This study should eventually lead us to provide more insights on how cell maintains genome integrity through crosstalk between posttranslational modifications including ubiquitylation and PARylation.

Les checkpoints de l'ADN coordonnent les réponses cellulaires aux dommages de l'ADN et au blocage de la réplication des cellules eucaryotes. Chez Saccharomyces cerevisiae, la protéine kinase Rad53 occupe une place centrale au sein des checkpoints de l'ADN. Afin d'identifier de nouveaux partenaires de Rad53, une approche génétique a été développée, utilisant l'allèle dominant létal RAD53-DL qui déclenche constitutivement des réponses cellulaires normalement induites par des lésions de l'ADN. Notre hypothèse est que l'absence des activateurs ou des substrats de Rad53 pourrait rétablir la croissance. Nous avons donc recherché, à l'échelle du génome de S. cerevisiae, les gènes qui suppriment la toxicité de RAD53-DL lorsqu'ils sont inactivés. 110 gènes ont été isolés et classés en groupes fonctionnels. Un groupe a particulièrement retenu notre attention. Il est composé de huit gènes dont l'inactivation confère à la cellule une hyper-résistance à plusieurs stress génotoxiques. Trois de ces gènes codent des composants du protéasome 26S, l'enzyme central du système de dégradation ubiquitine-dépendante des protéines qui joue un rôle crucial dans la plupart des processus cellulaires. Le protéasome est une structure macromoléculaire très sophistiquée composée d'une partie catalytique, la particule 20S, associée au complexe régulateur 19S, lui même formé de 2 sous-complexes, la base et le couvercle. Son assemblage comprend de nombreuses étapes ordonnées. Au moment du crible, un seul chaperon du protéasome était connu chez la levure, la protéine Ump1, impliquée dans les étapes finales de maturation du protéasome 20S. Par des analyses génétiques et biochimiques, nous avons caractérisé les cinq autres membres du groupe fonctionnel « protéasome », dont la fonction était jusqu'alors inconnue. Les gènes YLR021W, YPL144W, YLR199C et YKL206C, que nous avons baptisés POC1-4 (Proteasome Chaperone), codent 4 protéines formant deux paires de chaperons du protéasome 20S (Poc1-Poc2 et Poc3-Poc4) agissant en amont de Ump1. HSM3 code la première protéine chaperonne de la particule régulatrice du protéasome. Hsm3 s'associe avec la base du 19S et assiste son assemblage. Son rôle est également de réguler l'association du 19S en formation avec le protéasome 20S. Nous avons identifié les homologues mammifères de Poc1-4 (PAC1-4) et Hsm3 (S5b), mettant ainsi en lumière une conservation remarquable des facteurs d'assemblage du protéasome au cours de l'évolution

Face aux agressions constantes que subit l'ADN, les cellules ont développé des mécanismes de protection, nommés checkpoints pour maintenir l'intégrité de leur génome. Chez Saccharomyces cerevisiae, la kinase Rad53 joue un rôle central dans ces voies et son activation conduit à de nombreux effets cellulaires tels que le ralentissement du cycle cellulaire, le ralentissement de la réplication, l'activation de la transcription de certains gènes, l'activation de la réparation... Lors d'un crible transcriptomique, utilisant une souche exprimant une forme hyperactive de Rad53, nous avons identifié le gène HUG1 comme l'un des gènes les plus transcrits suite à l'activation de la voie RAD53. Cependant les fonctions de Hug1 demeurent énigmatiques.Pour mieux comprendre les fonctions de Hug1 dans la réponse aux dommages de l'ADN, nous avons recherché ses partenaires physiques et avons identifié les protéines Rnr2 et Rnr4, les deux composants de la petite sous-unité de la Ribonucléotide Réductase (RNR). La RNR est un complexe enzymatique qui catalyse l'étape limitante de synthèse des nucléotides. Nous avons alors cherché à caractériser cette interaction par diverses méthodes. Nous avons ainsi montré que Hug1 est une protéine intrinsèquement désordonnée capable d'interagir physiquement avec la petite sous-unité de la RNR et qu'au moins onze acides aminés de Hug1 sont impliqués dans son interaction avec la RNR. Lors de nos investigations, nous avons observé que le fait d'étiqueter Rnr2 en position C-terminale sensibilisait les souches aux stress génotoxiques et que cette sensibilité était supprimée si on abrogeait la fonction de HUG1, faisant de Hug1 un nouvel inhibiteur de la RNR. Ainsi nous sommes parvenus à proposer un modèle de régulation de la RNR par Hug1.

Les facteurs de transcription STAT3 sont des protéines cytoplasmiques qui induisent l'activation de gènes en réponse à une stimulation de facteurs de croissance ou de cytokines. A la suite d'une phosphorylation sur son résidu tyrosine 705, STAT3 se dimérise et est transloqué dans le noyau afin d'activer ses gènes cibles spécifiques impliqués dans la progression de la phase G1 vers la phase S du cycle cellulaire. Néanmoins, en absence de phosphorylation du résidu tyrosine 705, STAT3 est capable d'induire l'activation de ses gènes cibles, ces observations ont été corrélées avec la phosphorylation du résidu sérine 727 localisée dans le domaine de transactivation. Dans ce cas, il a été montré que les gènes cibles sont différents de ceux activés par STAT3 phosphorylé sur son résidu tyrosine. Ces résultats suggèrent que les modifications post-traductionnelles de STAT3 jouent un rôle important dans la spécificité de son activité transcriptionnelle. Nous avons observé que le facteur de transcription est phosphorylé sur son résidu sérine 727 en réponse à un traitement génotoxique par la kinase Cdk5. Dans ces conditions, cette voie Cdk5- STAT3 permet la diminution de l'expression de gènes impliqués dans la progression de la phase G1 du cycle cellulaire comme la cycline D1 et c-Myc afin de favoriser l'expression des gènes de réparation tel que Eme1. En parallèle, nous avons montré que STAT3 est également phosphorylé sur son résidu sérine 727 lors de la phase G2 et de la mitose. Cette phosphorylation, due à la kinase Cdk1, permet de réguler l'expression de gènes impliqués dans le déroulement des phases G2 et M du cycle cellulaire, tels que PLK1, STIL, RIC8A, FoxM1, NuMa, Cdc25C. Par ailleurs, grâce à une étude immunohistochimique, nous avons remarqué que STAT3 est phosphorylé sur son résidu sérine 727 dès les stades précoces du cancer colorectal. L'ensemble de ces résultats suggère que la sérine 727 est un site de phosphorylation majeur dans le cancer colorectal. Cette phosphorylation lui permet d'activer deux voies distinctes : la réparation des dommages de l'ADN en réponse à un traitement génotoxique et la progression du cycle cellulaire de la phase G2 vers la mitose.

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2. / Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres that play a crucial rôle in the equal segregation of chromosomes by organizing the bipolar spindle during mitosis. Recent studies have revealed the involvement of centrosomes in regulating G2/M transition during normal cell cycle progression. Moreover, increasing evidence suggests that centrosomes also play roles in the DNA damage response and cell cycle checkpoint signalling by serving as “meeting points” where DNA-damage-responsive genes and cell cycle regulators communicate. Numerical centrosome aberrations, or centrosome amplification, is a common feature of most human cancers that promotes aneuploidy and is involved in tumorigenesis as well as tumor progression. Interestingly, centrosome amplification and fragmentation have also been shown to constitute a cellular response to impaired DNA integrity that triggers cell death by mitotic failure. Although their roles are critical in tumorigenesis and the DNA damage response, the mechanisms that regulate centrosome homeostasis and dynamics remain poorly understood. To gain a better understanding of the role of the centrosomes in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage; the recruitment and/or centrosomal activation of the kinases implicated in this checkpoint pathways were studied by indirect immunofluorescence on HeLaS3 cells or western blot on purified centrosomal fractions. Our results showed that the kinases CHK1, CHK2, ATM and ATR are activated at the centrosomes in cell synchronised in G2. However, after activation of the G2/M checkpoint, these activated kinases moved from centrosomes. Finally, to identify new centrosomal actors potentially involved in the regulation of this checkpoint, a comparative analysis of the proteome of purified centrosomes was also realized by mass spectrometry. To study more specifically the function of CHK2 at the centrosomes, we developped molecular tools wich will serve to determine the role of the sub-population of CHK2 localized at the centrosomes in 1) in regulating entry into mitosis during unperturbed cell cycle progression, 2) in checkpoint regulation at G2/M transition in response to DNA damage induced by ionizing radiations and genotoxic drugs and 3) in centrosomal homeostasis and dynamics by regulating centrosomal amplification, fragmentation and clustering during normal cell cycle progression and in response to genotoxic drugs. This study will further elucidate the importance of centrosomes in regulating the cell response to genotoxic stress induced by anti-cancer treatments and reveal potential new functions for the kinase CHK2 in unperturbed cell cycle progression and in response to DNA damage.

La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours des processus nucléaires utilisant l’ADN comme matrice tels que la réplication, la transcription ou la réparation des cassures et autres types de lésions à l’ADN. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés. Ils regroupent les complexes de remodelage ATP-dépendants et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Nous nous intéressons au laboratoire à la voie de méthylation de la lysine 20 située sur la queue aminoterminale de l’histone H4. Le premier niveau de méthylation est induit par la monométhyltransférase PR-Set7 tandis que la di et tri méthylation sont déposées par le couple d’enzymes SUV4-20H1/2. Pour mieux caractériser le rôle joué par PR-Set7 au cours du développement, j’ai étudié la fonction de l'orthologue de PR-Set7 chez la Drosophile (dPR-Set7). La première partie de ma thèse a consisté à caractériser le rôle de dPR-Set7 dans la transcription. De manière intéressante, nous avons montré que la régulation transcriptionnelle médiée par PR-Set7 nécessite son domaine SET enzymatique mais pas H4K20me, suggérant l'existence d’autres substrats non-histones. Nous avons mis en évidence une interaction fonctionnelle de PR-Set7 et ISWI qui est la sous unité catalytique des complexes de remodelage de la chromatine (CRC). Fait intéressant, ISWI contient un patch basique identique à la queue N-terminale de H4 suggérant qu’il pourrait être un substrat pour dPR-Set7. La deuxième partie de ma thèse a consisté à combiner l’effet des radiations à ceux induits par les inhibiteurs des méthyltransférases responsables de la méthylation H4K20 et les radiations dans les lignées de cellules cancéreuses du pancréas et de l’ovaire. Par l'utilisation de différents inhibiteurs ciblant soit PR-Set7 ou les enzymes SUV4-20H, j’ai voulu savoir si la baisse des niveaux de H4K20me pourrait contribuer à une meilleure efficacité des traitements aux rayons X. Nos résultats montrent que la diminution globale des marques H4K20me2/3 suite à l’inhibition des enzymes SUV4-20H n’impacte que faiblement sur la survie des cellules et la combinaison des deux traitements les rendraient plus radiosensibles. / Chromatin is a dynamic nucleoprotein structure that requires remodeling for all nuclear processes such as replication, transcription and DNA damage. Several factors have been characterized to modulate chromatin structure and include ATP-dependent remodeling complexes and histone-modifying enzymes. We are interested in the laboratory in the methylation pathway of lysine 20 on histone H4 tail. The first level of methylation is induced by the monomethyltransferase PR-Set7 and the di/tri methylation are deposited by the SUV4-20H enzymes. To better characterize the role of dPR-Set7 during development, I wanted to study the function of Drosophila PR-Set7 (dPR-Set7). The first part of my thesis aimed to unravel the role of dPR-Set7 in transcription. Interestingly, transcriptional regulation mediated by PR-Set7 requires its enzymatic SET domain but not H4K20me, suggesting the existence of other non-histone substrates. We demonstrated a functional interaction between PR-Set7 and ISWI, the catalytic subunit of chromatin remodeling complexes (CRC). Interestingly, ISWI contains a basic patch identical to the histone H4 tail suggesting that it could be a substrate for dPR-Set7. The second part of my thesis consisted in combining inhibitors of H4K20 methyltransferase and radiation in ovarian and pancreatic cancer cell lines. I wanted to know if the decrease of H4K20me levels by inhibiting either PR-Set7 or SUV4-20H enzymes, contribute to better X-ray treatments. Our results show that the overall decrease of H4K20me2/3 marks following the inhibition of SUV4-20H enzymes has a low impact on cell survival and the combining effects of both treatments sensitize cancer cells.