A variação de cunho geográfico nas populações naturais está intimamente ligada às características ecológicas do ambiente como também aos processos históricos que resultaram no estabelecimento de linhagens distintas. Poucas espécies de serpentes têm sido estudadas adequadamente para determinar se existe variação geográfica na morfologia associada ao seu ciclo reprodutivo e dieta. As serpentes do gênero Crotalus são consideradas um bom modelo para estudos relacionados à variação geográfica devido à sua ampla distribuição, que abrange diversos tipos de hábitats. A cascavel C. durissus está restrita a América do Sul. No Brasil ocorre em todos os estados, exceto no Acre e Espírito Santo. São reconhecidas algumas populações isoladas na Floresta Amazônica. Algumas das suas populações exibem um nível considerável de variação morfológica e ecológica, sendo que populações adjacentes podem diferir drasticamente. De um modo geral, são escassos os estudos com esta espécie no Brasil, requerendo urgentes investigações para estabelecer se a variabilidade observada está associada a algum fenômeno específico. Neste estudo, foi examinado um total de 870 exemplares de C. durissus no Brasil. Em termos gerais, de acordo com o dimorfismo sexual, os resultados indicaram que as fêmeas apresentaram um maior número de escamas no ventre, enquanto que os machos apresentaram um número maior de escamas associadas à cauda e de losângulos. Em poucos casos as fêmeas exibiram comprimentos rostro-cloacais maiores, no entanto os maiores tamanhos da cabeça foram evidenciados neste sexo. Por outro lado, na maioria dos casos, os machos foram mais compridos do que as fêmeas, apresentando caudas mais longas. Similarmente as listras paravertebrais foram significativamente maiores nos machos. As análises discriminantes indicaram que as populações apresentaram padrões de variabilidade morfológica altamente complexos, ainda que a segregação de algumas das populações possa refletir fortes tendências evolutivas próprias dentro de algumas linhagens. A análise de variação geográfica indicou que variáveis ambientais influenciaram parcialmente a variabilidade morfológica nas populações de acordo com a sua distribuição. De acordo com os parâmetros relacionados a historia natural, o ciclo reprodutivo das fêmeas foi bem conservador, refletindo um padrão bienal e sazonal. Nos machos o ciclo espermatogênico mostra também um padrão sazonal exibindo variações anuais entre as populações. A associação entre os processos históricos, aspectos fisiológicos e condições climáticas são provavelmente os principais fatores que influenciaram as mudanças nestes padrões reprodutivos em fêmeas e machos. A dieta foi constituída principalmente por roedores, fato possivelmente associado à maior abundância e disponibilidade deste tipo de presa ao longo do ano nas áreas de ocorrência da espécie. No entanto, lagartos do grupo dos teiídeos podem ser considerados como itens alimentares eventualmente importantes na dieta de C. durissus do Brasil. / The geographical variation is intimately associated to the ecological characteristics such as the historical process of a species. A few species of snakes have been studied adequately to determine an existence of geographical variation in morphology, reproduction and diet. Rattlesnakes (Crotalus) are considered a good model for geographical variation studies, due to their wide distribution that include several habitat types. The rattlesnake, Crotalus durissus is restricted to South America. In Brazil, this group is present throughout the country, except in states of Acre and Espírito Santo. In addition, there are isolated populations in open areas in Amazonia, in the Amazonian savannas in the states of Amazonas, Roraima, Pará and Amapá. Some populations of C. durissus show considerable variation in the morphology, reproduction and diet composition even with neighboring populations differing drastically from each other. Generally, there has been little research conducted of C. durissus in Brazil needing urgent investigation to this respect. A total of 870 specimens of C. durissus were examined. In general, according to the sexual dimorphism, the results indicated that the females have a higher number of ventral scales, while the males showed a greater number of scales associated to the tail and the lozanges. In a few cases, the females exhibited larger snout-vent length but larger head sizes were shown in this sex. Overall, males were longer than females, exhibiting tails and paravertebral stripes which were relatively longer. The discriminant analysis showed in general populations with patterns of highly complex morphological variability, even though the segregation of some populations may reflect strong evolutionary tendencies of their own within some groups. The analysis of geographic variation indicated that environmental variables partially influenced the morphological variability in populations according to their distribution. In accordance with parameters related to natural history, the reproductive cycle of females, was extremely conservative, reflecting a biennial seasonal pattern. In males, the spermatogenic cycle also shows a seasonal pattern, which demonstrated annual variations between populations. The association between the historical processes, physiological aspects and climatic conditions is probably the main factors that influenced these reproductive patterns in females and males. The diet was composed mainly of rodents, habit related to the abundance and availability of the prey, however teid lizards can also be considered as an important food item of the diet of C. durissus from Brazil.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Os acidentes ofÃdicos de serpentes representam um sÃrio problema de SaÃde PÃblica nos paÃses tropicais, tanto pela freqÃÃncia com que ocorrem e/ou pela morbi-mortalidade que ocasionam. As serpentes do gÃnero Crotalus estÃo representadas no Brasil pela espÃcie Crotalus durissus, a qual se divide em seis subespÃcies. Nosso trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos dos venenos das serpentes Crotalus durissus cascavella originadas do estado do Cearà (Cdcc) e MaranhÃo (Cdcm); Crotalus durissus collilineatus (Cdcol); Crotalus durissus ruruima (Cdru) e suas fraÃÃes, Crotoxina (CTXru) e Fosfolipase A2 (PLA2ru), nos processos biolÃgicos de espraiamento celular, fagocitose, atividade fungicida e alteraÃÃes hematolÃgicas. Camundongos Swiss, machos, foram inoculados por via intraperitonial com os venenos descritos acima, nas doses de 120, 50, 27, 20 (venenos) e 10Âg/Kg (fraÃÃes), respectivamente. Duas horas apÃs inoculaÃÃo foram coletadas amostras de sangue do plexo orbital e o exsudato peritonial. A anÃlise estatÃstica utilizada foi o teste t de Student com significÃncia de 95%. Os animais tratados foram comparados com o grupo controle (inoculados com salina 0,9%). Cdcm e a CTXru causaram as maiores alteraÃÃes no eritrograma. 37,5% dos eritrÃcitos apresentaram morfologia macrocÃtica e microcÃtica; 25,5% hipocrÃmia; 25% com anisocitose e presenÃa de policromasia. Foram observados 16,8% de corpÃsculos de Howell Jolly. A contagem global de leucÃcitos foi reduzida significantemente apÃs administraÃÃo do Cdcc (82,9%), Cdcm (70,1%) e Cdru (83,8%). A celularidade foi alterada depois da inoculaÃÃo de Cdcc, Cdru e CTXru, em todos os tipos de cÃlulas. A contagem global de cÃlulas do peritÃnio aumentou apÃs inoculaÃÃo de Cdcc, Cdcol, Cdru e a CTXru. Em adiÃÃo, o macrÃfago foi à cÃlula predominante na contagem diferencial de cÃlulas peritoniais, contudo, somente a Cdcol apresentou significÃncia estatÃstica para macrÃfago (62,3%). Foi encontrada reduÃÃo significativa do espraiamento celular depois da administraÃÃo de todos os venenos variando de 52,7 a 65,7%. A fagocitose foi estatisticamente reduzida pela Cdcc nos perÃodos de 30, 60, 90 e 120 minutos. Cdru reduziu a fagocitose apenas em 30, 60 e 120 minutos, Cdcm em 30 e 90 minutos e CTXru nos tempos de 60 e 120 minutos. A Cdcol, e a CTXru mostraram significÃncia na atividade fungicida contra C. albicans nos perÃodos de 30, 60, 90 e 120 minutos, mas a Cdcc mostrou resultado similar em 60, 90 e 120 minutos. Conclui-se que o veneno interfere diferentemente na resposta hematolÃgica e funcional. Em adiÃÃo pode-se postular que os macrÃfagos foram responsÃveis por estas alteraÃÃes. Estudos futuros deverÃo ser realizados na perspectiva da identificaÃÃo de provÃvel aÃÃo fungicida de venenos ofÃdicos e suas fraÃÃes / Venomous snake accidents represent a serious public health problem in tropical countries, as much as for their frequency of occurrence and/or morbidity and mortality that they caused. In Brazil, the genus Crotalus comprise only one species, termed Crotalus durissus, which is divided into six subspecies. The aim of our study was to evaluate the effects promoted by venoms of Crotalus durissus cascavella, originated from the States of Cearà (Cdcc) and MaranhÃo (Cdcm); C. durissus collilineatus (Cdcol); C. durissus ruruima (Cdru) and its isolated components, such as crotoxin (CTXru) and phospholipase A2 (PLA2ru), in the biological processes of cellular spreading, phagocytosis, hematological alterations and antifungal activity. Male Swiss mice were inoculated intraperitoneally with the venom doses of 120, 50, 27, 20, 10 and 10 Âg/Kg, respectively to the snakes described above. After two hours of inoculation blood samples and exudate were collected from orbital plex and peritoneum, respectively. Statistical evaluation was performed using Student-T test with significance level set at 95%. We compared the treated animals with a control group, where animals were inoculated with saline 0.9%. Cdcm and CTXru caused the most severe alterations in the erythrogram. We noticed that 37.5% of the erythrocytes showed macrocytic and microcytic morphology; 25.5% were hipocromic; 25% showed anisocytosis and the presence of polycromasia. We also found Howell Jolly bodies in 16.8% of the examined erythocytes. The total counting of leukocytes was reduced statistically after administration of Cdcc (82.9%), Cdcm (70.1%) and Cdru (83.8%). Cellularity was altered after the inoculation of Cdcc, Cdru and CTXru for all evaluated cells. We noticed a statistic increase of peritoneum total cells caused by Cdcc, Cdcol, Cdru and CTXru. In addition, macrophage was the most predominant cell after peritoneum differential cell counting. However, only Cdcol showed a statistic increase of macrophages (62.3%). We found significant reduction of cellular spreading after administration of all venoms ranging from 52.7 to 65.7%. Phagocytosis was statistically reduced by Cdcc in the periods of 30, 60, 90 and 120 minutes. However, Cdru reduced phagocytosis only at 30, 60 and 90 minutes, Cdcm decreased phagocytosis at 30 and 90 minutes and CTXru in the periods of 60 and 120 minutes. Cdcol and CTXru showed significant fungicide activity against C. albicans in the periods of 30, 60, 90 and 120 minutes, but Cdcc showed similar results at 60, 90 and 120 minutes. We conclude that distinct venoms interfered differently in the intensity of each functional and hematological response. In addition, we postulate that macrophages maybe partially responsible for these alterations. Further studies should be evaluated for the use of venoms as fungicides

O presente estudo investigou o efeito do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) e da sua principal fração, crotoxina (ctx) sobre a resposta inflamatória induzida pela carragenina (cg). Foram avaliados o efeito do pré e do pós-tratamento com o VCdt sobre o desenvolvimento do edema de pata, a migração celular para a cavidade peritoneal e a interação leucócito-endotélio na microcirculação do músculo cremaster de camundongos induzidos por carragenina. O pré (14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (48, 4 ou 1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) inibiu o desenvolvimento do edema de pata induzido pela injeção intraplantar de carragenina em todos os tempos analisados (300 μg/50 μL). O mesmo efeito inibitório foi observado para o pré (21, 14, 7 dias ou 1 h) e pós-tratamento (1 h) com o VCdt (1,5 μg/50 μL s.c.) sobre a migração celular para a cavidade peritoneal induzida pela carragenina (300 μg/50 μL). A administração do VCdt por via oral (8,8 μg/200 μL) antes (14, 7 dias ou 1 h) ou após (1 h) a injeção de carragenina (300 μg/200 μL) também inibiu o influxo celular para a mesma cavidade. Em relação à interação leucócito-endotélio, o tratamento com o VCdt 1 h antes ou após a injeção de carragenina no subcutâneo da bolsa escrotal (300 μg/100 μL), aumentou o número de células em estado de rolling. Por outro lado, reduziu a adesão das células ao endotélio e a migração celular para o tecido extravascular. Da mesma forma que o VCdt, a ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) administrada 1 h antes ou após a carragenina inibiu todos os eventos acima citados. Os efeitos inibitórios do VCdt sobre o edema e sobre a migração celular foi comparado ao de clássicas drogas antiinflamatórias: a dexametasona, a indometacina, o L-NAME e o nimesulide. Para o edema, foi observado que somente o VCdt e o nimesulide impediram a formação do segundo pico de edema de carragenina. Para a migração celular, não foi observada diferença entre o tratamento com o VCdt e as drogas antiinflamatórias. A associação do VCdt com as drogas antiinflamatórias acima citadas não potencializou as suas ações inibitórias sobre a migração celular. Os dados demonstram que o VCdt apresenta um efeito antiinflamatório prolongado, e ainda, que a ctx pode contribuir para o efeito antinflamatório do VCdt. / In the present study, we investigated the effects of Crotalus durissus terrificus venom (CdtV) and crotoxin (ctx) on vascular and cellular events of inflammation induced by carrageenan (cg) in mice. It was evaluated the effect of the pre or post-treatment with CdtV on development of paw edema, cell migration and leukocyte-endothelium interaction at the cremaster muscle microcirculation induced by cg in mice. The pre (14, 7 days or 1h) and posttreatment (48, 4 or 1h) with CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.), inhibited the paw edema induced by carrageenan (300 μg/50 μL) in all periods of time evaluated. The same inhibitory effect of CdtV (1,5 μg/50 μL s.c.) was observed to the pre (21, 14, 7 days or 1 h) and post-treatment (1h) on cell migration to the peritoneal cavity induced by cg (300 μg/200 μL). The oral administration of CdtV (8,8 μg/200 μL) before (14, 7 days or 1h) or after (1h) intraperitoneal injection of cg (300 μg/200 μL), also inhibited the cell influx to the same cavity. To evaluate leukocyte-endothelium interaction, the treatment with CdtV 1h before or after the cg injection (300 μg/100 μL) into the scrotal bag of the animals induced an increase in leukocyte rolling, but reduced the cellular adhesion to the endothelium surface and cellular migration to the extravascular tissue. The administration of ctx (0,89 μg/50 μL s.c.) 1 h before or after cg injection, could inhibit all inflammatory events mentioned above. The inhibitory effect of CdtV on paw edema and cellular migration were also compared with that observed for classical anti-inflammatory drugs, such as: dexamethasone, indomethacin, LNAME and nimesulide. Only CdtV and nimesulide blocked the second peak of edema formation induced by cg. For cell migration, no differences were observed among the treatment with CdtV and anti-inflamatory drugs. The association of CdtV with drugs did not potentialize their actions on cell migration. These results demonstrate that CdtV exhibits a long-lasting antiinflammatory effect and that ctx could contribute for the anti-inflammatory effect of CdtV.

Atualmente, grande parte do onhecimento adquirido sobre reprodução de serpentes, advém de estudos levados a efeito na América do Norte e Europa, com animais de regiões temperadas; e, na Austrália, com Elapídeos tropicais. No presente estudo foram utilizadas dez serpentes fêmeas prenhes de Crotalus durissus (Viperidae) de região neotropical, com o objetivo de descrever e correlacionar a morfologia do corpo lúteo, placenta e estágio fetal. Com isso pode-se inferir também, o tempo de prenhez. As técnicas realizadas para essa descrição e correlação foram: biometria macroscópica das fêmeas e suas estruturas; microscopia de luz com coloração de hematoxilina-eosina e microscopia eletrônica de varredura. Foram coletados no total 124 corpos lúteos e 116 placentas, onde observou-se que a cascavel possui o corpo lúteo de caráter ovulatório e a placenta do tipo corioalantóica evolvida por uma delgada membrana da casca do ovo. Concluiu-se que o tamanho padrão da superfície dos corpos lúteos para uma prenhez normal é de 18 a 34 mm2 e que há um corpo lúteo para cada ovo, independente se está fertilizado ou atrésico, porém os ovos atrésicos não possuem placenta. Pela primeira vez foi possível visualizar a disposição estrutural dos filamentos calcários em forma de trama na membrana da casca do ovo. Foi inferida uma classificação da placenta em três estágios I, II e III de acordo com a morfologia e aumento das vilosidades apresentadas entre placenta e útero; e a partir da identificação do estágio de desenvolvimento embrionário e fetal pode-se inferir o tempo de prenhez em C. durissus, classificadas em três terços, inicial, médio e final, evidenciando que existe uma correlação entre a evolução dos estágios placentários com desenvolvimento fetal, conforme a evolução gradual da prenhêz / At de present time, great part of snake reproduction knowledge results from researches realized in North America and Europe, with temperate region animals; in Australia with tropical Elapides. At this present research, ten pregnant females of the snake Crotalus durissus (Viperidae), from Neotropical Region, were utilized. The main goal is to correlate the morphology, corpus luteum, placenta and fetal development. Then, it is also easy to deduce the pregnancy time. The techniques performed for this description and correlation were females macroscopic biometry and their structures; light microscopy with hematoxiline-eosine color and electronic scanning microscopy. 124 corpora lutea and 116 placentas were collected. In those samples could be observed that rattlesnakes have an ovulatory corpus luteum and a corioalantoic placenta wrapped by a slender membrane of the eggshell. Clearly the conclusion is that the normal standard size surface corpus luteum for a normal pregnancy is from 18 to 34mm² and that there is a corpus luteum for each egg, independently if it is fertilized or atresic; but, these atresic eggs have not placenta. For the first time it was possible to visualize the structural arrangement of the calcareous filaments in shaped frame in the eggshell membrane. It was inferred a placenta classification in three stages: I, II and III according to the morphology and increased vilosiddes presented among placenta and uterus; and, from the identification of embryonic and fetal development stage we can infer the time pregnancy in C. durissus, classified in three thirds, initial, middle and final, indicating that there is a correlation between the evolution of placental stage with fetal development, as the gradual evolution of pregnancy

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DizFilho_EduardoBrittodosSantos_M.pdf: 1713352 bytes, checksum: 603465fac59506eae00eb719cec694e7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Na região norte do Brasil a serpente Crotalus durissus ruruima (C.d.r) é responsável por diversos casos de acidentes ofídicos, e é principalmente encontrada próxima à fronteira com a Venezuela e Colômbia. Contudo a Crotalus durissus cumanensis (C.d.c). é outra serpente bastante comum no sul da Venezuela próximo a fronteira com o Brasil. Ambas as serpentes são encontradas na região equatorial da América do Sul e ambos os venenos mostraram diferenças significativas em suas composições, se comparadas com a Crotalus durissus terrificus (C.d.t.). A crotoxina é a principal toxina, e responsável pelos principais efeitos toxicológicos do veneno de C.d.t. O objetivo principal desta dissertação foi o de isolar e caracterizar isoformas de PLA2s isoladas de ambos os venenos e caracterizar farmacológica e bioquimicamente estas PLA2s e outras toxinas. A análise comparativa do veneno total de C.d.r. mostrou uma presença sutil de convulxina e giroxina, enquanto a análise da C.d.c. revelou ausência de convulxina no veneno. Alem disso, ambos demonstraram significativas diferenças para a atividade de PLA2. A análise de cada crotoxina isolada de C.d.r. ou de C.d.c. também revelou significante variação em comparação com a C.d.t. Neste trabalho nos isolamos duas novas isoformas de PLA2 de C.d.r. e C.d.c.. Ambas as proteínas foram caracterizadas como básicas e ambas demonstram massa molecular de aproximadamente 14 kDa. Em dicroísmo circular ambas as proteínas demonstraram a presença de alta quantidade de alfa hélice, contudo foi encontrada uma pequena diferença para a quantidade de folha Seta e cadeias randômicas. Estes resultados sugerem que a diferença estrutural entre estas proteínas, corrobora com os resultados da análise de seqüência N-terminal e a análise filogenética. Além das diferenças bioquímicas encontradas para os dois venenos, para a crotoxina, PLA2 e crotapotina, nos observamos que o veneno e a crotoxina isolada da C.d.c. exibiram alta atividade neurotóxica em preparação de músculo nervo frênico diafragma de camundongo, enquanto o veneno e a crotoxina de C.d.r. não. bogo nos concluímos que ambos .os venenos mostraram diferenças em suas propriedades bioquímicas e farmacológícas, entre os dois venenos e estes em comparação com a C. d. terrificus e C. d. collilineatus. Ambas as isoformas de PLA2 demonstraram algumas similaridades estruturais em alguns aspectos, mas nqs observamos algumas poucas diferenças que provavelmente estão associadas com as diferenças farmacológicas e enzimáticas encontradas entre as isoformas de PLA2 isoladas de C.d.r. e C.d.c / Abstract: In the north region of Brazil the Crotalus durissus ruruima (C.d.r.) is responsible for several snake bit cases and mainly found in the region near the Venezuela and Colombia. Although the Crotalus durissus cumanensis (C.d.e.) is other wide spread rattlesnake in south Venezuela frontier. Both snakes are only found in the equatorial region of South America and both venoms showed significative difference in the composition if compared to Crotalus durissus terrifieus (C.d.t). 'The crotoxin is the principal toxin and responsible for the main toxicology effect of the Crotalus durissus terrifieus venom. The main focus of the thesis was isolation and characterization of the PLA2 isoforms isolated from the both venom and characterized the pharmacological and biochemical characterization PLA2 and other toxins. The comparative analysis of whole venom of C.d.r. showed the marginal presence of convulxin and gyroxin while the analysis of the C.d.c. the convulxin was absent in the venom. Beyond this, both also showed significative differences for the PLA2 activity. The analysis of the each crotoxin isolated from the C.d.r. or C.d.c. also showed significant variation in comparison with C.d.t. In this work we isolated two new isoforms of PLA2 from the C.d.r. and C.d.c. Both proteins were characterized as basic protein and both showed a molecular mass around 14 kDa. In the circular dichroism, both proteins showed the presence of high content of alpha helix although they found slights differences for the beta sheets or random coil.These results suggest the structural difference of both proteins that were corroborated by the N-terminal sequence analysis and by phylogenetic analysis. Beside the biochemical differences found for both venom, crotoxins, PLA2 and erotapotins, we observed the venom and Crotoxins isolated from the C.d.e. exhibited higher neurotoxic activity on the phrenic nerve diaphragm preparation while the venom and crotoxin isolated from the C.d.r. was not. )"hus we conclude that both venoms showed differences at biochemical and pharmacological properties between both venom and these in comparison with C.d. terrifieus or C.d. collilineatus. Both PLA2 isoforms showed some similar structural aspects but we observed some slight different that probably were associated with the pharmacological and enzimatical differences found for both PLA2 isolated from the C.d. e. and C.d.r / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A hemostasia previne a perda de sangue após uma lesão vascular e garante a fluidez sanguínea. Para isso há a participação de células carreadoras de fator tissular e também de plaquetas, além de fatores plasmáticos, cofatores, fosfolipídios e íons cálcio que resultam na liberação dos fibrinopeptídios do fibrinogênio e polimerização dos monômeros de fibrina, transformando-os em fibrina estável. Os polifosfatos também participam da ativação da via intrínseca da cascata de coagulação ativando o fator XII e a pré-calicreína plasmática. Os répteis possuem peculiaridades quanto ao mecanismo de coagulação, apresentando níveis altos de anticoagulantes circulantes e ausência ou deficiência de alguns fatores de coagulação. Pouco se sabe sobre a participação real dos trombócitos e polifosfatos no mecanismo hemostático de serpentes. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo hemostático da serpente de C.d. terrificus, avaliando também o papel dos trombócitos e dos polifosfatos. Os testes de coagulação apresentaram tempos prolongados, mas o nível de fibrinogênio (227, 47 ± 20,38 g/dL) foi semelhante ao humano. Foi constatada a presença de FXII, que foi ativado pelos polifosfatos, reduzindo o tempo de coagulação em Rotem. Os trombócitos de C.d. terrificus (13,37 ± 1,22 x 109/L) são células nucleadas elipsoidais, que apresentam superfície lisa quando não estão ativados. Esses trombócitos agregaram com colágeno 5,84 ± 0,85 Ω) e cálcio ionóforo (24 ± 3,3 %). Porém, não ativaram com ADP, como previamente mostrado em outros répteis. A adesão trombocitária observada (1,25 ± 0,37 %) foi mais baixa do que em seres humanos (11%), lembrando que a adaptação do método usado não foi totalmente adequada às serpentes. Embora se saiba pouco sobre a importância das variações das características morfológicas das fibras de fibrina, que em C.d. terrificus diferem das de ratos, humanos e outras espécies descritas de mamíferos, o tipo dessa rede de fibrina pode estar influenciando no processo final da hemostasia, juntamente com a participação dos trombócitos. A eficácia do mecanismo hemostático em serpentes C.d. terrificus parece estar relacionada principalmente à ativação da coagulação pelo fator tissular. Assim, a fase de iniciação é tão eficiente quanto em mamíferos, diferindo mais na fase de propagação do coágulo, ou seja, na via intrínseca. A baixa concentração de alguns fatores de coagulação e níveis elevados de inibidores naturais, tais como a antitrombina, interfere nesse sistema mais lento e possivelmente diminui os riscos trombóticos / Hemostasis prevents blood loss after vascular injury and provides the blood flow. Platelets and tissue factor bearing cell, plasma factors, cofactors, phospholipids and calcium ions participate in this process that results in the release of fibrinogen fibrinopeptides and polymerization of fibrin monomers, converting to stable fibrin. Polyphosphates also participate in the activation of the intrinsic pathway of the coagulation cascade by activating factor XII and plasma prekallikrein. The peculiarities of blood coagulation of reptiles are high levels of circulating anticoagulants and absence or low level of some coagulation factors. The role of thrombocytes and polyphosphates in the hemostatic mechanism of snakes is not well known. The objective of this study was to investigate the hemostatic mechanism of C.d. terrificus snake evaluating the role of thrombocytes and polyphosphates. Coagulation tests showed prolonged times, but the level of fibrinogen (227.47 ± 20.38 g/dL) was similar to human. It was also observed the presence of FXII activated by polyphosphates reducing the clotting time in Rotem. Thrombocytes of C.d. terrificus (13.37 ± 1.22 x 109/L) are ellipsoidal nucleated cells, which exhibit smooth surface when not activated. These thrombocytes were activated by collagen (5.84 ± 0.85 Ω) and calcium ionophore (24 ± 3.3%). However, they did not aggregate with ADP as previously shown in other reptiles. The thrombocytes adhesiveness observed (1.25 ± 0.37%) was lower than in humans (11%), probably, in part because the adaptation of the method used was not fully adequate to snakes. Although little is known about the importance of morphological characteristics of C.d. terrificus fibrin fibers, which differ from rat, human and other mammalian species described, possibly this type of fibrin network may influence the final stages of hemostasis, with thrombocytes participation. The efficacy of the hemostatic mechanism in C.d. terrificus snakes seems to be mainly related to the activation of coagulation by tissue factor. Thus, the initiation phase is as efficient as in mammals, differing in the propagation phase of coagulation or intrinsic pathway. The low concentration of some coagulation factors and high levels of natural inhibitors such as antithrombin may be interfering with that system, and also preventing thrombotic diseases

A variação de cunho geográfico nas populações naturais está intimamente ligada às características ecológicas do ambiente como também aos processos históricos que resultaram no estabelecimento de linhagens distintas. Poucas espécies de serpentes têm sido estudadas adequadamente para determinar se existe variação geográfica na morfologia associada ao seu ciclo reprodutivo e dieta. As serpentes do gênero Crotalus são consideradas um bom modelo para estudos relacionados à variação geográfica devido à sua ampla distribuição, que abrange diversos tipos de hábitats. A cascavel C. durissus está restrita a América do Sul. No Brasil ocorre em todos os estados, exceto no Acre e Espírito Santo. São reconhecidas algumas populações isoladas na Floresta Amazônica. Algumas das suas populações exibem um nível considerável de variação morfológica e ecológica, sendo que populações adjacentes podem diferir drasticamente. De um modo geral, são escassos os estudos com esta espécie no Brasil, requerendo urgentes investigações para estabelecer se a variabilidade observada está associada a algum fenômeno específico. Neste estudo, foi examinado um total de 870 exemplares de C. durissus no Brasil. Em termos gerais, de acordo com o dimorfismo sexual, os resultados indicaram que as fêmeas apresentaram um maior número de escamas no ventre, enquanto que os machos apresentaram um número maior de escamas associadas à cauda e de losângulos. Em poucos casos as fêmeas exibiram comprimentos rostro-cloacais maiores, no entanto os maiores tamanhos da cabeça foram evidenciados neste sexo. Por outro lado, na maioria dos casos, os machos foram mais compridos do que as fêmeas, apresentando caudas mais longas. Similarmente as listras paravertebrais foram significativamente maiores nos machos. As análises discriminantes indicaram que as populações apresentaram padrões de variabilidade morfológica altamente complexos, ainda que a segregação de algumas das populações possa refletir fortes tendências evolutivas próprias dentro de algumas linhagens. A análise de variação geográfica indicou que variáveis ambientais influenciaram parcialmente a variabilidade morfológica nas populações de acordo com a sua distribuição. De acordo com os parâmetros relacionados a historia natural, o ciclo reprodutivo das fêmeas foi bem conservador, refletindo um padrão bienal e sazonal. Nos machos o ciclo espermatogênico mostra também um padrão sazonal exibindo variações anuais entre as populações. A associação entre os processos históricos, aspectos fisiológicos e condições climáticas são provavelmente os principais fatores que influenciaram as mudanças nestes padrões reprodutivos em fêmeas e machos. A dieta foi constituída principalmente por roedores, fato possivelmente associado à maior abundância e disponibilidade deste tipo de presa ao longo do ano nas áreas de ocorrência da espécie. No entanto, lagartos do grupo dos teiídeos podem ser considerados como itens alimentares eventualmente importantes na dieta de C. durissus do Brasil. / The geographical variation is intimately associated to the ecological characteristics such as the historical process of a species. A few species of snakes have been studied adequately to determine an existence of geographical variation in morphology, reproduction and diet. Rattlesnakes (Crotalus) are considered a good model for geographical variation studies, due to their wide distribution that include several habitat types. The rattlesnake, Crotalus durissus is restricted to South America. In Brazil, this group is present throughout the country, except in states of Acre and Espírito Santo. In addition, there are isolated populations in open areas in Amazonia, in the Amazonian savannas in the states of Amazonas, Roraima, Pará and Amapá. Some populations of C. durissus show considerable variation in the morphology, reproduction and diet composition even with neighboring populations differing drastically from each other. Generally, there has been little research conducted of C. durissus in Brazil needing urgent investigation to this respect. A total of 870 specimens of C. durissus were examined. In general, according to the sexual dimorphism, the results indicated that the females have a higher number of ventral scales, while the males showed a greater number of scales associated to the tail and the lozanges. In a few cases, the females exhibited larger snout-vent length but larger head sizes were shown in this sex. Overall, males were longer than females, exhibiting tails and paravertebral stripes which were relatively longer. The discriminant analysis showed in general populations with patterns of highly complex morphological variability, even though the segregation of some populations may reflect strong evolutionary tendencies of their own within some groups. The analysis of geographic variation indicated that environmental variables partially influenced the morphological variability in populations according to their distribution. In accordance with parameters related to natural history, the reproductive cycle of females, was extremely conservative, reflecting a biennial seasonal pattern. In males, the spermatogenic cycle also shows a seasonal pattern, which demonstrated annual variations between populations. The association between the historical processes, physiological aspects and climatic conditions is probably the main factors that influenced these reproductive patterns in females and males. The diet was composed mainly of rodents, habit related to the abundance and availability of the prey, however teid lizards can also be considered as an important food item of the diet of C. durissus from Brazil.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 176084 bytes, checksum: ba3ed3d023a44786d6afb86a343a98e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Accidents ofidic cart a relevant medical problem in our country due to the high toxicity and lethality of the poisons. About 8% of the accidents they are related to the gender Crotalus being in second place in the number of accidents and in first in relation to the death index. The study had as objective evaluates and to compare the effectiveness of the therapy of the intoxication for poison crotalic in dogs, with use of antiophidic serum isolated or associated the frozen plasma. The dogs were divided in two groups being: Group VS: animals inoculated with poison crotalic and treaties with antiophidic serum bothropic-crotalic; Group VSP: animals inoculated with poison crotalic, treaties with antiophidic serum and plasma frozen fresh. The animals were submitted the clinical evaluation and laboratorial. It was observed us of the two groups edema in the place of inoculation of the poison and mitigation with more precocious recovery in the animals of the group VSP, presence of reflex pupillary the light, dilated pupils, lameness, flaccid paralysis of the musculature, mandibular ptose, increase of the breathing frequency, decrease in the erythrocyte number, hemoglobin and hematocrit, decrease in the number of lymphocytes, increase in the neutrophil number, leukocytes, sanguine incoagulability and increase in the time of protrombina and partial tromboplastina activated with more precocious recovery in the animals of the group VSP. In conclusion the dose of poison crotalic used in the experimental intoxication of dogs was capable to produce alterations in the clinical parameters, laboratorial and hematological with benefits mainly in the recovery of the mitigation and decrease of the member edema in the animals that received the antiophidic serum associated to the frozen fresh plasma when compared to the animals that received only the antiophidic serum. / Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido às altas toxicidades e letalidades dos venenos. Cerca de 8% dos acidentes estão relacionados ao gênero Crotalus estando em segundo lugar no número de acidentes e em primeiro em relação ao índice de óbito. O estudo teve como objetivo avaliar e comparar a indução da intoxicação experimental e terapia por veneno crotálico em cães, com uso de soro antiofídico isolado ou associado a plasma congelado. Os cães foram divididos em dois grupos sendo: Grupo VS: animais inoculados com veneno crotálico e tratados com soro antiofídico botrópico-crotalico; Grupo VSP: animais inoculados com veneno crotálico, tratados com soro antiofídico e plasma fresco congelado. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e hemograma. Foram observados nos dois grupos, edema no local de inoculação do veneno e sedação com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP, presença de reflexo pupilar a luz, midríase, claudicação, paralisia flácida da musculatura, ptose mandibular, aumento da frequência respiratória, diminuição no número de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, diminuição no número de linfócitos, aumento no número de neutrófilos, leucócitos, incoagulabilidade sanguínea e aumento no tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP. Conclui-se que a dose de veneno crotálico usada na intoxicação experimental de cães foi suficiente de produzir alterações nos parâmetros clínicos, laboratoriais com benefícios principalmente na recuperação da sedação e diminuição do edema de membro nos animais que receberam o soro antiofídico associado ao plasma fresco congelado quando comparado aos que receberam somente o soro antiofídico.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao.pdf: 176084 bytes, checksum: ba3ed3d023a44786d6afb86a343a98e0 (MD5) Previous issue date: 2010-08-27 / Accidents ofidic cart a relevant medical problem in our country due to the high toxicity and lethality of the poisons. About 8% of the accidents they are related to the gender Crotalus being in second place in the number of accidents and in first in relation to the death index. The study had as objective evaluates and to compare the effectiveness of the therapy of the intoxication for poison crotalic in dogs, with use of antiophidic serum isolated or associated the frozen plasma. The dogs were divided in two groups being: Group VS: animals inoculated with poison crotalic and treaties with antiophidic serum bothropic-crotalic; Group VSP: animals inoculated with poison crotalic, treaties with antiophidic serum and plasma frozen fresh. The animals were submitted the clinical evaluation and laboratorial. It was observed us of the two groups edema in the place of inoculation of the poison and mitigation with more precocious recovery in the animals of the group VSP, presence of reflex pupillary the light, dilated pupils, lameness, flaccid paralysis of the musculature, mandibular ptose, increase of the breathing frequency, decrease in the erythrocyte number, hemoglobin and hematocrit, decrease in the number of lymphocytes, increase in the neutrophil number, leukocytes, sanguine incoagulability and increase in the time of protrombina and partial tromboplastina activated with more precocious recovery in the animals of the group VSP. In conclusion the dose of poison crotalic used in the experimental intoxication of dogs was capable to produce alterations in the clinical parameters, laboratorial and hematological with benefits mainly in the recovery of the mitigation and decrease of the member edema in the animals that received the antiophidic serum associated to the frozen fresh plasma when compared to the animals that received only the antiophidic serum. / Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido às altas toxicidades e letalidades dos venenos. Cerca de 8% dos acidentes estão relacionados ao gênero Crotalus estando em segundo lugar no número de acidentes e em primeiro em relação ao índice de óbito. O estudo teve como objetivo avaliar e comparar a indução da intoxicação experimental e terapia por veneno crotálico em cães, com uso de soro antiofídico isolado ou associado a plasma congelado. Os cães foram divididos em dois grupos sendo: Grupo VS: animais inoculados com veneno crotálico e tratados com soro antiofídico botrópico-crotalico; Grupo VSP: animais inoculados com veneno crotálico, tratados com soro antiofídico e plasma fresco congelado. Os animais foram submetidos à avaliação clínica e hemograma. Foram observados nos dois grupos, edema no local de inoculação do veneno e sedação com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP, presença de reflexo pupilar a luz, midríase, claudicação, paralisia flácida da musculatura, ptose mandibular, aumento da frequência respiratória, diminuição no número de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito, diminuição no número de linfócitos, aumento no número de neutrófilos, leucócitos, incoagulabilidade sanguínea e aumento no tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada com recuperação mais precoce nos animais do grupo VSP. Conclui-se que a dose de veneno crotálico usada na intoxicação experimental de cães foi suficiente de produzir alterações nos parâmetros clínicos, laboratoriais com benefícios principalmente na recuperação da sedação e diminuição do edema de membro nos animais que receberam o soro antiofídico associado ao plasma fresco congelado quando comparado aos que receberam somente o soro antiofídico.