The World Health Organization classifies glioblastoma (GBM) as a type IV astrocytoma, making it one of the most fatal tumors that exists. Despite the advances in chemotherapy, surgery, and radiation treatments that improve a patients length of survival, the overall trajectory of the disease remains unchanged. It has been shown that GBM cells produce significant levels of prostaglandins, including prostaglandin D2 (PGD2). PGD2 possesses pro- and anti-tumorigenic properties. Hence, a more complete understanding of PGD2 activity in GBM could yield more effective treatments against GBM. Through techniques like RT-PCR, immunohistochemistry, and HPLC tandem mass spectrometry, we were able to confirm the presence of the PGD2 synthesis in GBM cell lines. We treated GBM cell lines with various concentrations of exogenous PGD2 over 72 hours and observed its effects on cell count, apoptosis, mitosis and viability. Our results suggest that PGD2 possesses contradictory functions in GBM depending on concentration (mM PGD2 vs. nM PGD2) and receptor activation. / A Organização Mundial de Saúde classifica glioblastoma (GBM) como um astrocitoma tipo IV, fazendo uns dos tumores mais fatais que existe. A pesar dos avanços em quimioterapia, cirurgia e radioterapia que melhoram a longevidade de sobrevivência, a trajetória geral da doença permanece imutável. Tem sido demonstrado que células de GBM produzem níveis significativos de prostaglandinas, incluindo prostaglandina D2 (PGD2). PGD2 possui propriedades pro- e anti-tumorigenicos. Então, um entendimento mais completo da atividade de PGD2 em GBM pode gerar tratamentos mais efetivos. Através de técnicas como RT-PCR, imunohistoquimicas e HPLC espectrometria de massa em tandem, conseguimos confirmar a presença da síntese de PGD2 em linhagens de GBM. Tratamos linhagens de GBM com concentrações variáveis de PGD2 exógeno durante 72 horas e observamos seus efeitos na contagem de células, apoptose, mitose e viabilidade. Nossos resultados sugerem que PGD2 possui funções opostas em GBM dependendo em concentração (mM PGD2 vs. nM PGD2) e ativação de receptores.

O glioblastoma multiforme (GBM) é uma neoplasia do sistema nervoso central (SNC), caracterizada por uma elevada capacidade proliferativa e migratória. O desenvolvimento do tumor provoca uma remodelação da matriz extracelular (MEC) que facilita a migração tumoral. Eicosanóides são moléculas lipídicas importantes na carcinogênese e a sua síntese está correlacionada com o grau de desenvolvimento do tumor. As prostaglandinas são eicosanóides envolvidas na estimulação da angiogênese, na adesão celular e proliferação celular. Este estudo tem por objetivo avaliar in vitro o efeito da PGE2 na expressão moléculas da MEC e das moléculas de adesão envolvidas na migração, em células U87MG e U251MG. As células U251MG e U87MG foram tratadas com PGE2 (10µM) e Ibuprofeno (25µM), por um período 48hs. As proteínas da MEC foram analisadas por RT-qPCR após o tratamento. Foram realizadas reações de imunohistoquímica para as moléculas da MEC. As alterações foram encontradas na expressão de laminina, fibronectina, colágeno tipo IV e as integrinas αv , α3 e α5 para células U87MG . Observamos imunomarcação nas linhas celulares para colágeno tipo IV, laminina e fibronectina. Concluímos que o tratamento com IBU e PGE2, afeta a expressão gênica de moléculas de MEC. / Glioblastoma Multiforme (GBM) is a neoplasm of the central nervous system (CNS), characterized by a high proliferative and migratory capacity. Tumor development leads to extracellular matrix (ECM) remodeling and facilitating the migration of these cells. Eicosanoids are important lipid molecules in carcinogenesis, and their synthesis often correlates with the degree of tumor development. Prostaglandins are eicosanoids involved in the stimulation of angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation. This study is aimed to evaluate the expression of several ECM molecules involved in migration after altering the concentration of prostaglandins, using human glioma cell lines as an in vitro model. The cell lines U87MG and U251MG were treated with PGE2 (10µM) and Ibuprofen (25µM), for a predetermined period of 48hs. Proteins involved in extracellular matrix were analyzed by RT-qPCR after treatment in vitro. Immunohistochemical reactions were also performed for the ECM molecules. Changes were found in the expression of laminin, fibronectin, type IV collagen and αv, α3 and α5 integrins in cells U87MG. We observed immunostaining in cell lines to type IV collagen, laminin and fibronectin. In conclusion, Ibuprofen and PGE2, affects gene expression of ECM molecules.

Orientadores: Admar Costa de Oliveira, Roberto Carlos Burini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:09:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Haidamus_LeandroLopes_D.pdf: 785768 bytes, checksum: a63544a849a7db50b64812194be804ca (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O uso de drogas antiinflamatórias é comum entre atletas nos quais a prevalência de lesões musculares é elevada tanto nos períodos de treinamento e competição. Entretanto, algumas dessas drogas possuem ação imunossupressiva, que quando utilizadas em grande quantidade ou por tempo prolongado pode provocar queda nas respostas imunológicas. O objetivo da presente Tese foi verificar se a suplementação com ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 ocasionaria uma redução, tanto nas concentrações plasmáticas dos indicadores de lesão muscular (enzima lactato desidrogenase e creatina quinase) como dos mediadores químicos da inflamação da série ¿2¿ (prostaglandina E2, tromboxano B2 e leucotrieno B4) derivados do ácido araquidônico (C20:4, ?-6) e das alterações morfológicas do músculo esquelético. O experimento foi desenvolvido com 36 ratos Wistar distribuídos ao acaso em quatro grupos experimentais com nove ratos. Os grupos formados eram os seguintes: Grupo 1 - ratos sedentários sem suplementação; Grupo 2 - ratos sedentários com suplementação; Grupo 3 - ratos submetidos às sessões de natação (60 minutos diários), com carga de peso extra crescente, sem suplementação e Grupo 4 ¿ ratos submetidos às sessões de natação, com carga de peso extra crescente, com suplementação. A suplementação era feita por gavagem utilizando-se 3,0 g diárias de óleo de peixe contendo AGPI ?-3 (EPA: 187,0 mg/g e DHA: 140,0 mg/g) durante 28 dias. Os grupos não suplementados receberam 3,0 g de azeite de oliva diariamente (grupo controle). Os ratos receberam dieta não purificada de fórmula fechada (MP-77- Primor) e água à vontade, sendo os pesos avaliados semanalmente. Os indicadores de lesão muscular (LDH e CK), análise histológica e morfométrica das fibras musculares esqueléticas bem como os mediadores do processo inflamatório (PGE2, TXB2 e LTB4) foram determinados no final do experimento. Os resultados obtidos indicam que a suplementação com AGPI ?-3 reduziu a concentração plasmática da enzima LDH, tanto nos animais sedentários como nos submetidos ao treinamento físico (p<0,05). Com relação aos mediadores químicos da inflamação (PGE2, TXB2 e LTB4) as concentrações plasmáticas reduziram significativamente (p<0,05) nos animais sedentários, mas não reduziram nos animais submetidos ao exercício físico. No entanto, ao se observar esse resultado, verificou-se que em todos os mediadores químicos houve uma redução nos valores absolutos nos animais suplementados com AGPI ?-3. Pela análise histológica das fibras musculares mostrou que nos grupos treinados, os ratos não suplementados apresentaram as seguintes alterações morfológicas: presença de processo de fagocitose de fibra muscular, fibra atrófica e fibras polimórficas, enquanto que nos ratos suplementados, a análise histológica mostrou uma redução acentuada dessas alterações o que resultou na quase inexistência de lesões musculares. Tendo em vista os resultados obtidos, pode ser sugerido de que ação antiinflamatória dos AGPI ?-3 nos ratos e por extensão em atletas, seria maior se a suplementação fosse realizada diariamente independentemente do período de treinamento / Abstract: The use of antiinflammatory drugs is common among athletes in which the prevalence of muscular lesions is elevated in training and competition periods. However, some of those drugs have an immunosuppression action, and when used in high dosages or for long time can provoke a decrease in the immunological responses. The objective of the present Thesis was to verify if the supplementation with polyunsaturated fatty acids omega-3 would cause a reduction, in the plasmatic concentrations of the indicators of muscular lesion (lactate dehidrogenase enzyme and creatine kinase) as well as in the chemical mediators of the inflammation of the series ¿2¿ (prostaglandin E2, thromboxane B2 and leukotriene B4) derived of arachidonic acid (C20:4, ?-6) and the morphologic alterations of skeletal muscle. The experiment was developed with 36 Wistar rats distributed at random in four experimental groups with nine rats. The formed groups were the following: Group 1 - sedentary rats without supplementation; Group 2 - sedentary rats with supplementation; Group 3 - rats submitted to swimming sessions (60 minutes daily), with load of gaining extra weight, without supplementation and Group 4 - rats submitted to swimming sessions, with load of gaining extra weight, with supplementation. The supplementation was made daily by ¿gavage¿ using 3,0g of fish oil containing AGPI ?-3 (EPA: 187,0 mg/g and DHA: 140,0 mg/g) for 28 days. The groups not supplemented received 3,0g of olive oil daily (control group). The rats received a non-purified diet of closed formula (MP-77-Primor) and water was ad libitum, with their weight being checked weekly. The indicators of muscular lesion (LDH and CK), histological and morphometric analyses of the skeletal muscular fibers as well as the mediators of the inflammatory process (PGE2, TXB2 and LTB4) were determinated at the end of the experiment. The obtained results indicate that the supplementation with AGPI ?-3 did reduce the plasmatic concentration of the LDH enzyme in the sedentary animals as well as in the animals submitted to the physical training (p<0,05). With respect to the chemical mediators of the inflammation (PGE2, TXB2 and LTB4) the plasmatic concentrations were reduced significantly (p < 0,05) in the sedentary animals, but were not reduced in the animals submitted to the physical exercise. However, by observing this results, it was verified that in all of the chemical mediators there was a reduction in the absolute values in the supplemented animals with AGPI ?-3. By the histological analysis of the muscular fibers showed that in the trained groups, the no supplemented rats had the following morphologic alterations: presence of the process of phagocytosis of muscular fiber, atrophic fiber, polymorphic fibers, while that in the supplemented rats, the histological analysis showed an accentuated reduction of those alterations that resulted in an almost inexistence of muscular lesions. Having in mind the obtained results, it can be suggested that the antiinflammatory action of AGPI ?-3 in the rats and for extension in athletes, would be improved if the supplementation was administered daily independently of the training period / Doutorado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

Orientador: Marcos Renato de Assis / Resumo: A expectativa de vida diminui com artrite reumatoide (AR) devido ao aumento da mortalidade por doenças cardiovasculares. Isto se deve, possivelmente, à disfunção endotelial resultante da intensa atividade inflamatória relacionada à AR. Evidências tem apontado para um possível envolvimento do sistema renina-angiotensina (SRA) nos danos cardiovasculares inerentes à AR. Acredita-se que a participação do SRA agrave o comprometimento endotelial decorrente de inflamações sistêmicas através da ativação do receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1) pela angiotensina II (Ang II). Por outro lado, a literatura também reporta a influência dos hormônios andrógenos, principalmente da testosterona, nas ações da Ang II sobre os tecidos vasculares. Assim, o objetivo do presente estudo é investigar os efeitos da artrite induzida por adjuvante (AIA) sobre o equilíbrio redox, a função endotelial e as respostas da aorta de ratos à Ang II, bem como, verificar se esses efeitos podem ser influenciados pela redução dos níveis circulantes de testosterona. Para isto, ratos Wistar machos adultos foram submetidos à falsa-castração e falsa-imunização (Controles), castração seguida de falsa-imunização (ORX), falsa-castração seguida de imunização (ORX) e castração seguida de imunização (ORX+AIA). Ao final do experimento, segmentos de aorta torácica foram desafiadas em cubas de órgãos isolados com acetilcolina (ACh), Ang II, KCl e nitroprussiato de sódio e, das curvas concentração resposta obtidas, calculou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Life expectancy of patients with rheumatoid arthritis (RA) is lower due to increased mortality in consequence of cardiovascular diseases. Presumably, this occurs due to endothelial dysfunction resulting from severe inflammatory activity related to RA. Evidence has demonstrated a possible involvement of the renin-angiotensin system (RAS) in the cardiovascular injury inherent to RA. The RAS involvement is considered to worsen the endothelial impairment due to systemic inflammation through angiotensin II type 1 receptor (AT1) activation of Ang II. (Ang II). Additionally, previous studies also observed that androgen hormones, mainly the testosterone, modulate the Ang II actions in cardiovascular tissues. Thus, the aim of the present study is to investigate the effects of adjuvant-induced arthritis (AIA) on systemic redox balance, endothelial function and rat aorta responses to Ang II, as well as, whether these effects may be influenced by the reduction of circulating levels of testosterone. For this, adult male Wistar rats were submitted to false-castration and false-immunization (Controls), castration followed by false-immunization (ORX), false-castration followed by immunization (ORX) and castration followed by immunization (ORX + AIA) . At the end of the experiment, thoracic aorta segments were challenged in isolated organ bath with acetylcholine (ACh), Ang II, KCl and sodium nitroprusside and, from the concentrantion-response curves obtained were calculated pEC50 and maximal ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Les récepteurs nucléaires LXRα et LXRβ sont activés par la fixation de dérivés oxygénés du cholestérol. Ils régulent l’expression de nombreux gènes appartenant au métabolisme du cholestérol et des acides gras, et jouent un rôle important dans l’inflammation et l’immunité innée. L’activation de LXR inhibe le développement de l’athérosclérose, en augmentant l’efflux de cholestérol des macrophages ainsi que le transport inverse jusqu’au foie et l’excrétion biliaire. De plus, LXR diminue la biosynthèse et la captation du cholestérol dans les tissus périphériques. Enfin, les agonistes synthétiques de LXR administrés à des souris diminuent significativement l’inflammation dans les lésions athérosclérotiques, notamment en inhibant la sécrétion de certaines cytokines inflammatoires. Néanmoins LXR régule également la lipogenèse et la synthèse d’acides gras mono-insaturés, et l’administration d’agonistes de LXR s’accompagne également d’effets indésirables liés à cette régulation, comme une accumulation dérégulée d’acides gras dans le foie et une augmentation du taux de LDLs circulantes. Plusieurs autres mécanismes restent encore à être explorés, comme la synthèse d’acides gras polyinsaturés et les conséquences sur le métabolisme cellulaire. Nos travaux identifient une nouvelle voie régulée entièrement par LXR, le métabolisme des acides gras polyinsaturés. Le récepteur nucléaire LXR régule l’ensemble des enzymes FADS1, FADS2 et ELOVL5, responsables de la synthèse d’acides gras polyinsaturés oméga-6 et oméga-3. Cette régulation s’accompagne d’une incorporation d’acide arachidonique dans les phospholipides, via la régulation de LPCAT3, ce qui prépare les macrophages à une synthèse accrue de dérivés inflammatoires issus de l’acide arachidonique, comme la Prostaglandine E2, suite à une stimulation au lipopolysaccharide. La régulation de cette voie par LXR a également un effet sur le développement de l’athérosclérose, augmentant les taux d’acides gras polyinsaturés oméga-6 et oméga-3 dans les plaques d’athérome. Nos résultats montrent donc que LXR régule la synthèse des acides gras polyinsaturés en plus des acides gras mono-insaturés et de la lipogenèse et que cette régulation a des conséquences sur le profil lipidique des macrophages in vitro et in vivo ainsi que sur leur réponse inflammatoire. / The nuclear receptors LXRα and LXRβ are activated by oxygenated metabolites of cholesterol. They regulate the expression of numerous genes belonging to cholesterol and fatty acids metabolism, and play a central role in inflammation and innate immunity. LXR activation inhibits atherosclerosis development, by increasing cholesterol efflux from macrophages as well as reverse cholesterol transport and biliary excretion. In addition, LXR decreases cholesterol uptake and biosynthesis. Synthetic LXR agonists fed to mice significantly decrease inflammation in atherosclerotic lesions, by inhibiting several inflammatory cytokines. However, LXR also regulate lipogenesis and monounsaturated fatty acids synthesis, and LXR agonists supplementation is accompanied by side effects due to this regulation, such as a deregulated accumulation of fatty acids in the liver and an increase in circulating LDLs. Other mecanisms still need to be characterized, such as polyunsaturated fatty acids synthesis and the consequences on cell metabolism. Our work identify a new pathway regulated by LXR, the metabolism of polyunsaturated fatty acids. The nuclear receptor LXR regulates all enzymes responsible for omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids synthesis, FADS1, FADS2 and ELOVL5. This regulation is accompanied by an increase in arachidonic acid incorporation in phospholipids, via LPCAT3 regulation, which subsequently primes human macrophages for an increased inflammatory metabolites secretion derived from arachidonic acid, such as Protaglandin E2, following a LPS stimulation. The regulation of this pathway by LXR has an effect on atherosclerosis, increasing omega-6 and omega-3 ployunsaturated fatty acids in atheroma plaques. Our results show therefore that LXR regulates polyunsaturated fatty acids synthesis in addition to monounsaturated fatty acids and lipogenesis, and that this regulation has direct consequences on lipid profile of macrophages in vitro and in vivo as well as on their inflammatory response.

O Glioblastoma (GBM) é um astrocitoma grau IV, representando o glioma de maior malignidade e o tumor cerebral primário mais frequente em humanos. A terapia indicada para o GBM é a ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, todas com baixíssima eficiência devido a agressividade e as características do GBM. Consequentemente, a sobrevida dos pacientes indicados aos tratamentos convencionais é pouco mais de um ano. A inflamação é, sabidamente, uma das características que participa de modo decisivo do desenvolvimento tumoral, incluindo do GBM, e as relações entre mediadores inflamatórios e câncer são alvos de pesquisa nos últimos anos. Diversos estudos apontam um papel da via dos eicosanoides na modulação de processos patológicos envolvidos na inflamação e no câncer. Os eicosanoides são mediadores lipídicos bioativos, envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, em especial os associados à resposta inflamatória. As principais vias de produção de eicosanoides (ciclooxigenases, lipoxigenases, e citocromo P450), assim como seus produtos, são frequentemente alterados em diversos tipos de tumor, associados ao crescimento e a progressão tumoral. Contudo, o perfil dessas vias é consideravelmente pouco compreendido em GBM. O objetivo deste estudo foi analisar in vitro o perfil e o papel das três vias de eicosanoides e seus produtos (eicosanoides ou não) nas linhagens de GBM (U251-MG, U87-MG, A172, T98G e U138-MG), modulando a atividade de enzimas chaves com drogas especificas para, então, analisar parâmetros de proliferação, migração e morte celular. Nossos resultados mostram, em todas as linhagens analisadas, um perfil heterogêneo das enzimas e receptores chaves das três vias. O perfil lipídico evidencia a produção de 13-HODE, produto de 15-lipoxigenase-1 em todas as linhagens, bem como ausência de leucotrienos e 5-HETE do eixo de 5-lipoxigenase. Os inibidores farmacológicos para 15-LOX e 12-LOX/15-LOX foram capazes de reduzir o crescimento, modular o ciclo celular e a migração celular das linhagens U251-MG, U87-MG e A172. O mesmo é visto com a inibição de mPGES-1. A inibição de 5-LOX por outro lado não afetou nenhum parâmetro nas mesmas linhagens. Todos os resultados apontam, portanto, para um papel do eixo de 15-LOX e COX no crescimento e na migração das células de GBM humano. / Glioblastoma (GBM) is a grade IV astrocytoma, the most malignant and the most frequent primary brain tumour in humans. Standard therapies for treating GBM are surgical resection, chemotherapy and radiotherapy, all with low efficiency due to GBM aggressiveness and characteristics. Therefore, patient survival after conventional treatments is about one year. Inflammation is one of the main characteristics that plays a decisive role in tumour development, including in GBM. The relationships between inflammatory mediators and cancer have been the subject of research in recent years. Several studies point to the eicosanoid pathways as modulators of pathological processes between inflammation and cancer. Eicosanoids are bioactive lipid mediators, involved in various physiological and pathological processes, especially those associated with the inflammatory response. The major eicosanoid pathways (cyclooxygenases, lipoxygenases, and cytochrome P450) as well as their products, are frequently altered in several tumours, associated with tumour growth and progression. However, the profile of these pathways is poorly understood in GBM. The objective of this study was to analyse, in vitro, the profile and role of eicosanoid pathways and their products (eicosanoids or not) in GBM cell lines (U251-MG, U87-MG, A172, T98G and U138-MG), modulating the key enzymes with inhibitors, analysing proliferation, migration and cell death. Our results show, in all analysed cell lines, a heterogeneous profile for the key enzymes and receptors of the three pathways. The lipid profile shows the production of 13-HODE, a product of 15-lipoxygenase-1, as well the absence of leukotrienes and 5-HETE of the 5-lipoxygenase axis. The pharmacological inhibitors for 15-LOX and 12-LOX / 15-LOX led to changes in cell cycle, reduced growth, reduced migration of U251-MG, U87-MG and A172 cell lines. The same was seen with the inhibition of mPGES-1. Inhibition of 5-LOX, on the other hand, did not affect any of these parameters in the same cell lines. All results, therefore, point to an important role of 15-LOX and COX pathways in the growth and migration of human GBM cells.

Os eicosanoides, produtos do metabolismo do ácido araquidônico, apresentam papel importante na homeostasia e na patogênese de diversas doenças humanas. A biossíntese desses compostos pode ser estimulada por agentes farmacológicos como ionóforos e inibidores da Ca2+-ATPase, e também por agonistas naturais como o formil-metionil-leucil-fenialanina (fMLP). Considerando os interesses em avaliar e comparar o perfil de mediadores lipídicos, como os leucotrienos (LTs), as prostaglandinas (PGs), os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs), os ácidos dihidroxitetraenoicos (DiHETEs) e os ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs), na saúde e na doença, o objetivo deste trabalho foi padronizar um método analítico para determinar do perfil de eicosanoides em plasma humano após estimulação do sangue total, e assim observar diferenças entre indivíduos saudáveis e doentes. Dessa forma, um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS) foi validado para quantificação de 22 eicosanoides em plasma de indivíduos saudáveis. A análise por HPLCMS/ MS foi realizada em modo negativo pelo modo de varredura por monitoramento de reações múltiplas (MRM). A linearidade do método apresentou coeficiente de correlação (r) maior que 0,98 para todos os eicosanoides analisados. A precisão e exatidão intra e inter-ensaios tiveram desvio padrão e erro relativo menores que 15%, exceto para o limite inferior de quantificação cujos valores foram menores que 20%. Para estimulação das células do sangue total, quatro estímulos (fMLP, ionomicina, A23187 e tapsigargina) foram utilizados. A análise estatística mostrou que o A23187 e a tapsigargina foram os estímulos mais potentes na indução da produção de eicosanoides. Em seguida, comparamos o perfil de eicosanoides em amostras de plasma de indivíduos saudáveis com pacientes com anemia falciforme (AF), em tratamento com hidroxiureia (HU) ou transfusão sanguínea crônica. Os resultados demonstraram que o método é preciso para determinação de diferenças entre os pacientes e indivíduos saudáveis quanto à produção dos mediadores lipídicos 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2 e PGE2. Portanto, nosso método analítico é sensível, específico e reprodutível para identificar e quantificar diferenças no perfil de eicosanoides em amostras de sangue estimuladas in vitro, e poderá contribuir para o estabelecimento do perfil de mediadores lipídicos em diferentes doenças inflamatórias e infecciosas. / Eicosanoids, products from arachidonic acid metabolism, play an important role in the homeostasis and in the pathogenesis of various human diseases. Pharmacological agents such as Ca2+ ionophores and Ca2+-ATPase inhibitors, as well as natural agonists such as fMet-leu-Phe (fMLP) can stimulate eicosanoid biosynthesis. Considering the interests in evaluate and compare the profile of lipid mediators, as leukotriens (LTs), prostaglandins (PGs), epoxyeicosatrienoic acids (EETs), dihydroxytetraenoic acids (DiHETEs) and hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), in healthy and disease, the aim of this work was to standardize a method to determine the eicosanoid profile of human plasma samples after whole blood stimulation, and to assess differences between healthy and sick individuals. For this purpose, a liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was validated for the quantification of 22 eicosanoids using human plasma from healthy volunteers. In addition, we optimized a method for the stimulation of eicosanoids in human whole blood. LC-MS/MS analyses were performed by negative electrospray ionization and multiple reaction monitoring. An assumption of linearity resulted in a regression coefficient > 0.98 for all eicosanoids tested. The mean intra-assay and inter-assay accuracy and precision values had relative standard deviations and relative errors of < 15%, except for the lower limit of quantification, where these values were < 20%. For whole blood stimulation, four stimuli (fMLP, ionomycin, A23187, and thapsigargin) were used. Results of the statistical analysis showed that A23187 and thapsigargin were potent stimuli to induce the production of eicosanoids. We next compared the eicosanoid profiles of healthy volunteers to those of patients with sickle cell anemia (SCA) under treatment with hydroxyurea (HU) or after chronic red blood cell (RBC) transfusion. The results indicate that the method was sufficient to find a difference between lipid mediators released in whole blood of SCA patients compared to healthy subjects for 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2, and PGE2. In conclusion, our analytical method is sensitive, specific and reproducible for indentify and quantify changes in eicosanoid profiles in whole blood stimulated in vitro, which can contribute to establishing the eicosanoid profiles associated with different inflammatory and infectious diseases.

Os eicosanoides, produtos do metabolismo do ácido araquidônico, apresentam papel importante na homeostasia e na patogênese de diversas doenças humanas. A biossíntese desses compostos pode ser estimulada por agentes farmacológicos como ionóforos e inibidores da Ca2+-ATPase, e também por agonistas naturais como o formil-metionil-leucil-fenialanina (fMLP). Considerando os interesses em avaliar e comparar o perfil de mediadores lipídicos, como os leucotrienos (LTs), as prostaglandinas (PGs), os ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs), os ácidos dihidroxitetraenoicos (DiHETEs) e os ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs), na saúde e na doença, o objetivo deste trabalho foi padronizar um método analítico para determinar do perfil de eicosanoides em plasma humano após estimulação do sangue total, e assim observar diferenças entre indivíduos saudáveis e doentes. Dessa forma, um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (HPLC-MS/MS) foi validado para quantificação de 22 eicosanoides em plasma de indivíduos saudáveis. A análise por HPLCMS/ MS foi realizada em modo negativo pelo modo de varredura por monitoramento de reações múltiplas (MRM). A linearidade do método apresentou coeficiente de correlação (r) maior que 0,98 para todos os eicosanoides analisados. A precisão e exatidão intra e inter-ensaios tiveram desvio padrão e erro relativo menores que 15%, exceto para o limite inferior de quantificação cujos valores foram menores que 20%. Para estimulação das células do sangue total, quatro estímulos (fMLP, ionomicina, A23187 e tapsigargina) foram utilizados. A análise estatística mostrou que o A23187 e a tapsigargina foram os estímulos mais potentes na indução da produção de eicosanoides. Em seguida, comparamos o perfil de eicosanoides em amostras de plasma de indivíduos saudáveis com pacientes com anemia falciforme (AF), em tratamento com hidroxiureia (HU) ou transfusão sanguínea crônica. Os resultados demonstraram que o método é preciso para determinação de diferenças entre os pacientes e indivíduos saudáveis quanto à produção dos mediadores lipídicos 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2 e PGE2. Portanto, nosso método analítico é sensível, específico e reprodutível para identificar e quantificar diferenças no perfil de eicosanoides em amostras de sangue estimuladas in vitro, e poderá contribuir para o estabelecimento do perfil de mediadores lipídicos em diferentes doenças inflamatórias e infecciosas. / Eicosanoids, products from arachidonic acid metabolism, play an important role in the homeostasis and in the pathogenesis of various human diseases. Pharmacological agents such as Ca2+ ionophores and Ca2+-ATPase inhibitors, as well as natural agonists such as fMet-leu-Phe (fMLP) can stimulate eicosanoid biosynthesis. Considering the interests in evaluate and compare the profile of lipid mediators, as leukotriens (LTs), prostaglandins (PGs), epoxyeicosatrienoic acids (EETs), dihydroxytetraenoic acids (DiHETEs) and hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), in healthy and disease, the aim of this work was to standardize a method to determine the eicosanoid profile of human plasma samples after whole blood stimulation, and to assess differences between healthy and sick individuals. For this purpose, a liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was validated for the quantification of 22 eicosanoids using human plasma from healthy volunteers. In addition, we optimized a method for the stimulation of eicosanoids in human whole blood. LC-MS/MS analyses were performed by negative electrospray ionization and multiple reaction monitoring. An assumption of linearity resulted in a regression coefficient > 0.98 for all eicosanoids tested. The mean intra-assay and inter-assay accuracy and precision values had relative standard deviations and relative errors of < 15%, except for the lower limit of quantification, where these values were < 20%. For whole blood stimulation, four stimuli (fMLP, ionomycin, A23187, and thapsigargin) were used. Results of the statistical analysis showed that A23187 and thapsigargin were potent stimuli to induce the production of eicosanoids. We next compared the eicosanoid profiles of healthy volunteers to those of patients with sickle cell anemia (SCA) under treatment with hydroxyurea (HU) or after chronic red blood cell (RBC) transfusion. The results indicate that the method was sufficient to find a difference between lipid mediators released in whole blood of SCA patients compared to healthy subjects for 5-HETE, 12-HETE, LTB4, LTE4, TXB2, and PGE2. In conclusion, our analytical method is sensitive, specific and reproducible for indentify and quantify changes in eicosanoid profiles in whole blood stimulated in vitro, which can contribute to establishing the eicosanoid profiles associated with different inflammatory and infectious diseases.